Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos con un nanocobertura StarPEG heparinizada

La eficacia terapéutica de las terapias basadas en células está limitada por células baja retención y supervivencia pobre^1,2. Con el fin de mejorar el resultado de terapias con células madre, ingeniería de superficies a través de la manipulación enzimática de la célula, péptido Conjugación, bioorthogonal química y física encapsulación con biomateriales ha sido explotados^{3,4, 5,6,7,8,9,10}. El protocolo actual pretende lograr ingeniería de superficies de las células vivas utilizando un método "fácil-a-adoptar" aplicando una nanocobertura starPEG ultrafino incorporado de heparina (heparina-PEG) a la superficie de la célula. Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos fue presentado aquí como un ejemplo debido a la naturaleza heterogénea de los islotes de Langerhans y los resultados despectivos del trasplante clínico de islotes actual.

De hecho, el trasplante clínico de islotes se realiza actualmente por inyección directa de islotes aislados en la vena porta hepática y este procedimiento sólo está disponible para pacientes selectivos debido a la escasez de donantes materiales y baja eficacia terapéutica ¹¹. convencionalmente, alginato ha sido el biomaterial más comúnmente utilizado para la encapsulación de islote y modificación superficial, aunque es menos que ideal debido a la inestabilidad química de alginato y fibrosis inflamatoria relacionada con^{12, 13}. Además, en comparación con el tamaño natural de islotes que oscila entre 100 a 200 μm, las microcápsulas de alginato-islote son más grandes, que oscilan entre los 400 y 800 μm, que exceda la distancia de difusión fisiológica de oxígeno. Encapsulación de islote conformal, es decir., encapsulando islotes sin alteración significativa del volumen del islote, fue entonces desarrollado. Así, la deposición de nanomembranes compuesto por PEG, tetrafluoroetileno, membrana de silicio o nanocobertura varias capas (también conocido como la técnica de la "capa por capa" [LBL]) ha sido reportada, dando por resultado mejorado en vitro la supervivencia de la isla^{14 ,15,16,17,18}, aunque la LBL enfoque a menudo requiere extensos islotes dando período de deposición de capas múltiples, que puede comprometer la viabilidad del islote . Por otra parte, la inestabilidad de nanomembranes que se basa en las interacciones electrostáticas o covalentes entre capas de biomembrana o interacciones hidrofóbicas entre nanomembranes y la superficie del islote también plantea preocupaciones^{9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26}.

Otro factor limitante que afecte el resultado terapéutico del trasplante intraportal islote es la instantánea sangre mediada por reacción inflamatoria (IBMIR) causada por el contacto directo de implantado islotes de sangre, resultando en la agregación plaquetaria, coagulación y efecto inmune adversa o indeseable activación celular⁹. Para abordar estos problemas, una nanocobertura ultra fina compuesta de glicol de polietileno en forma de estrella (starPEG) fue preparada por su biocompatibilidad establecido y su versatilidad como material de la cubierta del islote. Heparina, un glicosaminoglicano altamente sulfatado, se incorporó en la nanocobertura starPEG por sus propiedades antiinflamatorias, anticoagulantes y capacidad para facilitar la vascularización mediante la contratación de pro-angiogenic Factores del crecimiento^{22, 23}.

1. fabricación de heparina incorporada la nanocobertura Starpeg

1. Síntesis de succinato de succinimidyl heparina (heparina-NHS)
   1. Pesar 0,69 g de heparina y disolver en 2,0 mL de agua desionizada helada.
   2. Pesar 0,23 g de NHS y disolver en 0,5 mL de helado agua desionizada en un matraz de fondo redondo.
   3. Pesar 0,77 g de EDC y disolver en 0,5 mL de helado agua desionizada en un matraz de fondo redondo.
   4. Mezcla el NHS y EDC soluciones en un matraz de fondo redondo. Deje la solución mezclada en el banquillo a temperatura ambiente durante 30 min a temperatura ambiente.
   5. Centrifugar la mezcla de NHS de EDC a 5.031 x g por 10 min eliminar el exceso de EDC y NHS.
   6. Añadir 30 mL de etanol frío a la solución de mezcla y centrifugar a 5.031 x g por 10 min.
      1. Repetir dos veces.
2. Preparación de la nanocobertura heparina starPEG
   1. Añadir 1,0 mL de 10% (p/v) starPEG-(NH₂)₈ a un matraz de fondo redondo.
   2. Añadir 0,67 mL de 10% (p/v) heparina-NHS el mismo matraz de fondo redondo.
   3. Coloque la solución mezclada de starPEG-(NH₂)₈ y heparina-NHS en una incubadora a 25 ° C por 20 min obtener una solución clara con viscosidad.
      Nota: Para los experimentos en que fluorescencia etiquetada heparina (heparina de FAM) fue requerida, el procedimiento de fabricación es el mismo excepto que la estrella de (NH₂) - PEG -₈ fue disuelto en agua desionizada con 5.6- carboxyfluorescein Nsuccinimidyl - éster 0.1% (fracción molar) de starPEG-(NH₂)₈. )
3. Caracterización de la nanocobertura heparina-PEG por Fourier transforman espectroscopía infrarroja (FT-IR)
   1. Antes de empezar, enjuague el dispositivo de mortero, mortero y granulación de ágata (pequeños discos con diámetro de 13 mm) con acetona y agua desionizada. Seque el vidrio en un horno antes de usarlo.
   2. Mezcla aproximadamente 0.1 – 1% heparina-PEG muestra con 200 – 250 mg de polvo fino de KBr.
   3. Coloque la mezcla de KBr y heparina-PEG en el mortero de ágata y pulverizar finamente en pequeñas bolitas con un diámetro de 2 μm.
   4. Transferir la mezcla a un dispositivo de granulación. Aplique la fuerza de compresión alta (8 T/cm²) en el vacío durante 1-2 min formar bolitas transparentes.
   5. Tire suavemente de las pelotillas de la muestra respecto a la dispositivo de granulación. Tenga cuidado de no tirar demasiado para no incurrir en grietas.
   6. Transferir las pelotillas muestra muy cuidadosamente a un espectroscopio infrarrojo de Fourier transforma para determinar la estructura química de la muestra.
4. Examen de las estructuras internas de la porosidad de la nanocobertura heparina-PEG por escaneada la microscopia electrónica (SEM)
   1. Para los siguientes procedimientos, preparar pipetas y placa de cultivo de célula estándar de 48-bien.
   2. Pipetear la solución de copolímero de PEG de heparina en los pocillos de una placa de cultivo de 48-bien.
   3. Congelar la placa a-80 ° C durante 24 h.
   4. Lypophilize las muestras a-50 ° C en ambiente de vacío (0.1 Pa) durante 24 h.
   5. Distribuyen las muestras en la superficie pegajosa de un trozo de aluminio.
   6. Cubrir las muestras con oro y observe bajo el microscopio electrónico escaneado para observar estructuras internas porosas.
5. Examen de la superficie de la nanocobertura heparina-PEG por microscopía de fuerza atómica (AFM)
   1. Limpiar el portaobjetos de vidrio de sílice con solución Piraña (70% H₂SO₄, 30% H₂O₂) a 80 ° C durante 40 minutos.
   2. Someter a ultrasonidos las diapositivas en metanol durante 10 minutos y luego en tolueno durante 10 minutos.
   3. Secar los portaobjetos por secado al vacío.
   4. Lave los portaobjetos con abundante 3-aminopropil trietoxisilano solución 2% de tolueno, agitar suavemente.
   5. Someter a ultrasonidos las diapositivas en metanol durante 10 min luego en tolueno durante 10 minutos.
   6. Coloque 100 μl de solución de heparina-PEG 3% toda la superficie de los portaobjetos con ayuda de una pipeta estándar.
   7. Examinar la superficie de heparina-PEG bajo un microscopio de fuerza atómica (una frecuencia resonante de 50 a 80 kHz, la fuerza constante de 0.350 N m 21, radio de punta de 600 nm).

2. ratón islote ingeniería de superficies con heparina-PEG nanocobertura

1. Capa superficial del islote ratón con heparina-PEG nanocobertura
   1. Extraer los islotes de ratón colagenasa digestión histopaque gradiente purificación y según lo divulgada previamente en JoVE¹⁹.
   2. Dedazo 200 islotes bajo un microscopio de disección a un tubo de 1,5 mL.
   3. Añadir 500 μl de PBS a los islotes y centrifugar a 503 x g durante 1 minuto.
   4. Quite el sobrenadante y añadir 250 μl de la solución de heparina-PEG y mantener la mezcla en hielo durante 10 minutos la pipeta hacia arriba y hacia abajo para permitir que los islotes mezclar bien con la solución de heparina-PEG.
   5. Centrifugar a 503 x g durante 1 minuto.
   6. Quite el sobrenadante y agregar 500 μl de PBS. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.
   7. Centrifugue a 503 x g durante 1 min y retirar el sobrenadante y mantener los islotes para su uso posterior. Para la examinación de los islotes de ratón recubierto con heparina-PEG, FAM-heparina-PEG fue utilizado para el recubrimiento de islote siguiendo estos pasos.
2. Examen de los islotes de ratón con la nanocobertura FAM-heparina-PEG
   1. Añadir 1-2 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% suero bovino fetal en los islotes revestidos y transferir estos islotes en una placa de cultivo bacteriano estéril no cargado.
   2. Observar las señales de morfología y de la fluorescencia de FAM-heparina-PEG revestido de la nanocobertura islotes bajo un microscopio de fluorescencia invertido.

3. función de la heparina-PEG revestido islotes de ratón comparados con islotes sin recubrimiento

1. Viabilidad de los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG
   1. Dedazo de 20 de los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG y colocarlos en un pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pozos.
   2. Un total de 10 pozos se llenan 20 islotes de ratón recubierto de heparina-PEG para cada pozo.
   3. Dedazo 20 de islotes de noncoated control y colocarlos en un pozo de la misma placa de cultivo celular de 96 pozos.
   4. Un total de 10 pozos se llenan 20 islotes de noncoated de control para cada pozo.
   5. Colocar 200 μL de RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10% a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene islotes y mantener en cultivo durante 14 días.
   6. Sustituir los medios de cultivo de islotes pancreáticos cada 2 días.
   7. Tratar los islotes con un vivo o muertos kit de tinción en el final de 14 días en cultura y observados bajo un microscopio de fluorescencia invertido.
   8. Células en cada islote bajo un microscopio de fluorescencia invertido en cuenta PI⁺ (rojo).
2. Revascularización de la heparina-PEG cubierto de islotes de ratón in vitro
   1. Pre-enfriar todos los plásticos experimentales incluyendo placa de cultivo y por lo menos 12 h antes de usar puntas de pipeta.
   2. Lugar un 24-bien sobre un cojín de la refrigeración. Añadir 250 μl de hielo frío Matrigel reducido factor de crecimiento en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pozos. Coloque la placa de 24 pocillos recubierta a 4 ° C durante al menos 30 minutos.
   3. Mientras la solución de la matriz está en la nevera, trypsinize las células endoteliales de milla Sven 1 (MS1) ratón islote pancreático.
      1. Quite todos los medios de cultivo del frasco de cultivo de tejidos. Enjuague el matraz con 5 mL de PBS.
      2. Retirar el PBS y añadir 3 mL de tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 3 minutos en una incubadora estándar.
      3. Golpee ligeramente la parte inferior del frasco para separar las células y añadir 5 mL de medio de suplemento de suero.
   4. Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos.
   5. Quite el sobrenadante y añadir 5 mL de PBS. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.
   6. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
   7. Añadir medios DMEM suplementada con suero en el tubo y semilla de 50.000 células en cada pocillo de la placa de 24 pocillos recubiertos de solución matriz.
   8. Añadir 5 islotes recubierto de heparina-PEG o control noncoated islotes en cada pozo.
   9. Añadir medios DMEM suplementada con suero en cada pozo a un total de 500 μl por pocillo.
   10. Observar la formación del tubo después de 4h y 24 h de incubación bajo un microscopio de luz.
3. Secreción de insulina estimulada por glucosa de islotes recubierto de heparina-PEG
   Nota: Para determinar si la nanocobertura afectaría a la función de los islotes de ratón, se evaluó la secreción de insulina estimulada por glucosa de heparina-PEG revestido e islotes noncoated.
   1. Dedazo 30 recubierto de heparina-PEG islotes o islas noncoated control en un tubo de 1,5 mL. Preparar cada uno un total de 10 tubos de islotes revestidos e islotes noncoated.
   2. Añadir 1 mL de solución salina fisiológica con 2 mmol/L glucosa²⁰ e incubar a 37 ° C por 2 h.
      Nota: Para la receta de la solución salina fisiológica, consulte la tabla 1. Mantenga la tapa de los tubos sueltos durante la incubación en la incubadora.
   3. Quite tanta solución como sea posible.
   4. Estimular islotes por añadir 600 μl de solución salina fisiológica complementada con 20 Glucosa mmol/L a 37 ° C durante 30 minutos.
   5. Recoger 200 μL del sobrenadante de cada tubo para la cuantificación de ELISA usando una insulina comercial ELISA kit de insulina.

La nanocobertura heparina-PEG fue sintetizada por la conjugación de heparina con EDC y NHS como acoplamiento agentes (figura 1) y starPEG-(NH2)8 . Estructura química de la nanocobertura heparina-PEG fue examinado por FT-IR y como se muestra en la figura 2, se pudieran observar picos característicos de la heparina en 3.300-3.600 cm-1, correspondiente a los grupos del oxhidrilo de la heparina (figura 2 rojo). La disminución en la amplitud del pico en 3.300-3.600 cm-1 (figura 2 azul) representa la conjugación entre el starPEG (NH2)8 amida grupos y el grupo carbonilo de la heparina. Amplitud de pico 1.650 cm-1 corresponde a la amida carbonilo que se extiende la vibración también se redujeron, indicando suficiente reacción entre los grupos carboxilatos de la heparina con succinato de succinimidyl y amina de starPEG-(NH2) 8. estructura de la superficie de la nanocobertura heparina-PEG fue examinado por microscopia de fuerza atómica y aparece de Lou et al., la nanocobertura fue aproximadamente 30 nm de altura y 2 μm de ancho con pequeñas características porosas (manchas oscuras) que van entre 100 y 200 nm de diámetro10. Datos obtenidos de microscopía electrónica escaneada también confirman la estructura porosa altamente interconectada de la heparina-PEG (figura 3), sugiriendo que podría ser conveniente para la supervivencia de la célula durante el parto en vivo.

Revestimiento de la superficie de los islotes de ratón aislados fue examinado y como se presenta en la figura 4, capa delgada de la nanocobertura, demostrada por fluorescencia verde fue depositada uniformemente toda la superficie de recubrimientos islotes sin causar cambios evidentes en el islote volumen/tamaño. Durante el recubrimiento, es aconsejable mantener los islotes de hielo para mantener su viabilidad. Del mismo modo, el período de la capa, 10 minutos en este caso, fue también optimizada para permitir el mantenimiento de la viabilidad de los islotes. Cabe destacar que para la mejor observación de la nanocobertura, la microscopia electrónica que examina las secciones de islotes revestidos como previamente divulgados9,16 sería más apropiada, aunque los datos se generarían de islotes fijos y embedded en lugar de estar islotes en cultivo.

En cuanto a supervivencia y función de islotes revestidos, revascularización de islote y funciones en han sido evaluadas in vitro. Teniendo en cuenta las propiedades beneficiosas de la heparina, funcionalización de la heparina sobre la superficie del islote podría facilitar la revascularización islote en la cultura y por lo tanto su supervivencia. Hemos observado que los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG exhibieron viabilidad robusto islotes en cultivo (figura 5). Significativamente más avanzada formación vascular era también evidente a partir de células endoteliales del islote (MS1) que fueron cultivadas conjuntamente con heparina-PEG revestido islotes, indicados por estructuras alargadas en microvasos y red-como las estructuras vasculares (figura 6 ).

El proceso de la nanocobertura no incurridos capacidad secretora de efecto insulina estimulada por glucosa de los islotes de recubierto de heparina-PEG. Bajo nivel de secreción de insulina se observó en todos los grupos de tratamiento cuando islotes fueron perfundidos con solución salina fisiológica con sub-stimulatory nivel de la glucosa (2 mmol/L; Figura 7). Cuando islotes fueron estimulados con un nivel supra fisiológico de la glucosa (glucosa de 20 mmol/L), se observó aumento en la secreción de insulina en todos los grupos de tratamiento.

Figura 1: Estructura química de la nanocobertura Hep-PEG para ingeniería de superficies de islotes pancreáticos. Capa del islote fue alcanzada por reticulación covalente entre la heparina-NHS y aminas primarias dentro de la membrana de la célula y estrellas - PEG-(NH2)8. Cada molécula de heparina posee varios grupos carboxilo, que fueron modificados para tener un grupo NHS cada. Los grupos carboxilo activado de NHS reaccionará con aminas primarias de la proteína a vínculos de amida de la forma, través del cual se estabiliza la nanocobertura de Hep-PEG e islotes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Espectro infrarrojo de la estrella - PEG-(NH2)8, heparina y la nanocobertura Hep-PEG en seco estado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes de microscopía electrónica de Hep-PEG en estado seco escaneadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cubierto de imágenes representativas de heparina-PEG islotes bajo microscopio de fluorescencia.
La heparina fue etiquetada con FAM (mostrado en verde). Las imágenes son representante de 100 islotes. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Islotes recubierto de heparina-PEG exhibieron viabilidad islote robusto. (A) los datos presentados como mean± error de estándar del medio, n = 50 islotes por grupo. (B) las células vivas se muestran en las células verdes y muertas en rojo. Barra de escala = 100 μm. las imágenes son representativas de 50 islotes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Heparina-PEG nanocobertura facilita la revascularización intra-islote. Formación de tubo de Matrigel de MS1 células cultivadas conjuntamente con heparina-PEG cubierto de islotes y control noncoated islotes. Imágenes fueron tomadas en el bar de escala 4 y 24 h. = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Heparina-PEG nanocobertura no incurre ningún cambio en la función de secreción de insulina islote. Heparina-PEG islotes revestidos y control noncoated islotes (30 cada uno) fueron expuestos a 2 mmol/L (barra blanca) o 20 Glucosa mmol/L (barra negra) durante 30 minutos la secreción de insulina en respuesta a Glucosa mmol/L 20 fue comparable entre el recubrimiento e islotes. Datos se muestran como media ± error estándar de los medios, n = 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.