Artículo de método

Combinar el análisis cuantitativo de la toma de comida y por la fuerza activando las neuronas para estudiar apetito en Drosophila

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DOI:

10.3791/56900

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24 de abril de 2018

 ,  , 
1School of Life Science, University of Science and Technology of China, 2State key Laboratory of Brain and Cognitive Science, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Ensayos cuantitativos de consumo de alimentos con alimentos teñido proporcionan un robusto y alto rendimiento significa evaluar motivación alimentación. Combinando el análisis de consumo de alimentos con thermogenetic y optogenetic pantallas es un poderoso enfoque para investigar los circuitos neurales subyacentes apetito en adulto melanogaster del Drosophila.

Resumen

Consumo de alimentos está bajo el estricto control del cerebro, que integra el estado fisiológico, palatabilidad y contenido nutricional de los alimentos y cuestiones comandos para iniciar o detener la alimentación. Descifrar los procesos que subyacen a la toma de decisiones oportuna y moderada alimentación tiene importantes implicaciones en nuestra comprensión de Trastornos fisiológicos y psicológicos relacionados con la alimentación de control. Métodos simples, cuantitativos y robustos se requiere medir la ingestión de alimentos de los animales después de la manipulación experimental, como el aumento por la fuerza de las actividades de ciertas neuronas de destino. Aquí, presentamos tinte etiquetado basado en ensayos de alimentación para facilitar el estudio neurogenetic del control de la alimentación en adultos moscas de la fruta. Revisión de ensayos de alimentación disponibles y luego describir nuestros métodos paso a paso de configuración de análisis, que combinan thermogenetic y manipulación de optogenetic de neuronas control alimentación motivación con ensayo de ingesta de alimentos etiquetados de tinte. También discutimos las ventajas y limitaciones de nuestros métodos, en comparación con otros ensayos de alimentación, para ayudar a los lectores a elegir un ensayo apropiado.

Introducción

Cuantificar la cantidad de alimento ingerido es importante para la evaluación de múltiples aspectos de la alimentación de los controles por el cerebro en respuesta a las necesidades internas (por ejemplo, Estados de hambre) y factores externos (como la palatabilidad y calidad de los alimentos)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. en los últimos años, los esfuerzos de descifrar los sustratos neurales de control de alimentación en Drosophila conducen al desarrollo de múltiples ensayos para cuantificar la cantidad de comida ingerida directamente o servir como un indicador de la motivación de alimentación 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.

El capilar alimentador (CAFE) ensayo12,13 fue desarrollado para medir la cantidad de consumo de alimentos líquidos en un microcapillary de vidrio. El ensayo CAFE es muy sensible y reproducible17 y simplifica la medición de consumo de alimentos, especialmente para cuantificar la alimentación a largo plazo18. Sin embargo, este análisis requiere las moscas para subir a la punta de la microcapillary y alimentar al revés, que no es conveniente para todas las cepas. Además, porque las moscas a probar usando el ensayo CAFE tienen que ser criados en alimentos líquidos, el efecto de estas condiciones en estado de metabolismo o malnutrición potencial de cría queda por determinarse.

La respuesta de extensión probóscide (PER) ensayo11,14 cuenta la frecuencia de respuestas de extensión probóscide hacia toques suaves gotas de alimento. POR ensayo probada como una excelente manera de evaluar la alimentación motivación de marcha individual y evaluar la influencia de la palatabilidad y contenido de alimentos18,19. Sin embargo, no es una cuantificación directa de la cantidad de ingesta.

Recientemente, se desarrolló un método semiautomático, el manual de ensayo (MAFE)15, de la alimentación. En MAFE, una sola mosca inmovilizada es alimentada manualmente con un microcapillary que contiene los alimentos. Dado que las respuestas de extensión probóscide y consumo de alimentos se pueden supervisar simultáneamente, MAFE es adecuado para la evaluación de valores nutritivos y los efectos de la manipulación farmacológica. Sin embargo, inmovilizar una mosca podría afectar negativamente su rendimiento conductual, incluyendo la alimentación.

Además, la mosca probóscide y Detector de actividad (FlyPAD)10 fue desarrollado para cuantificar automáticamente el comportamiento de alimentación. Utilizando métodos de visión de máquina, FlyPAD registra interacciones físicas entre una mosca y alimentos para cuantificar la frecuencia y duración de las extensiones de la probóscide como indicador de la motivación de alimentación. FlyPAD proporciona un enfoque de alto rendimiento para supervisar las conductas de alimentación de una mosca de movimiento libre, aunque la sensibilidad y la solidez de este sistema está por ser confirmada más a fondo por más estudios12.

Etiquetado estrategias utilizan con frecuencia para estimar la ingestión de alimentos en moscas. Es común etiquetar alimentos con trazadores químicos y, después de la alimentación, medir la cantidad de marcador ingerido para calcular la cantidad de ingesta de alimentos. Trazadores radiactivos16,17,20,21,22,23,24,25 permite la detección a través de la cutícula sin homogeneización de las moscas. Este método ofrece muy baja variabilidad y alta sensibilidad18y es factible de estudio a largo plazo de la ingestión de alimentos. Sin embargo, la disponibilidad de radioisótopos utilizables y diferentes tasas de absorción y excreción deben tenerse en cuenta cuando se trabaja con este ensayo.

Etiquetado y rastreo de ingesta de alimentos con colores no tóxicos de alimentos es un lugar más seguro y más simple alternativa2,3,26,27,28. Moscas se homogeneizaron después de alimentarse con alimentos que contengan colorantes solubles y no absorbibles, y la cantidad de colorante ingerido posteriormente se cuantifica usando un espectrofotómetro3,24,28,29 . La estrategia de etiquetado es fácil de realizar y proporciona alta eficiencia, pero con una salvedad. El volumen de ingesta de tinte ingerido es menor que el volumen real porque la excreción comienza tan pronto como 15 minutos después vuela17de alimentación. Además, el ensayo evalúa la ingesta de alimentos normalmente dentro de un periodo de 60 min, que sólo es conveniente para la investigación de corto plazo alimentación comportamiento24,28. Por otra parte, múltiples factores internos y externos, como el genotipo17, género17, acoplado estado17, cría de densidad30, ritmo circadiano31,32y de calidad de alimentos3 , 8 , 16, influencia la toma de comida. Por lo tanto, la duración de alimentación deba ser ajustado según condiciones experimentales específicas. Además de facilitar la cuantificación de la ingesta de alimentos, colores de alimento también se utilizan para evaluar alimentos opciones2,19,27y visualizar el menisco en un microcapillary en el CAFE ensayo12.

Aquí, presentamos una protocolo combinado manipulación de la actividad neuronal con enfoque etiquetado tinte. Esta estrategia se ha demostrado útil en nuestro estudio neurogenéticas en el control de la alimentación en adultos moscas de la fruta24. El método de puntuación visual permite una rápida estimación de consumo de alimentos; así, es útil para la investigación a través de un gran número de cepas de manera oportuna. Los candidatos de la pantalla entonces se analizan en detalle utilizando un método colorimétrico que proporcionan objetivos y cuantificación precisa de estudios adicionales.

Además de los ensayos de alimentación, también Describimos los thermogenetic27,33,34,35 optogenetic36 métodos y de activar a las neuronas de la blanco en Drosophila. Para activar las neuronas de thermogenetic funcionamiento es simple y conveniente con Drosophila transitorio del Receptor potencial Ankyrin 1 (dTRPA1), que es un canal de temperatura y voltaje-bloqueado del catión que aumenta la excitabilidad neuronal cuando el ambiente temperatura se eleva por encima de 23 ° C33,37; sin embargo, pruebas animales a altas temperaturas pueden producir efectos adversos en el comportamiento. Otro método eficaz para activar las neuronas en Drosophila está utilizando optogenetics con CsChrimson36, que es una variante rojo-cambiado de puesto de channelrhodopsin que aumenta la excitabilidad de las neuronas cuando se expone a la luz. Optogenetics ofrece una resolución temporal más alta y menor disturbio a comportamientos que thermogenetics. Combinando la medición cuantitativa de la ingestión de alimentos con la manipulación de la actividad neuronal representa un enfoque eficaz para el estudio de los mecanismos neurales de la alimentación.

Describimos en detalle la preparación de la cámara de alimentación y las moscas a probarse. Usando Gal4 Taotie moscas como un modelo24, describimos las neuronas activadoras thermogenetics y optogenetics. Dos ensayos de cuantificación de consumo de alimentos con alimentos marcados con tinte también se describen en el protocolo.

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Protocolo

1. preparación de la cámara de alimentación

Nota: La cámara de alimentación de tinte etiquetado alimentación análisis consta de dos partes: el contenedor exterior (como una cubierta) y el interior contenedor (como fuente de alimento).

  1. Modificar el envase exterior de un frasco de vidrio para el cultivo de Drosophila con (un diámetro interno de 31,8 mm) y una altura de 80 mm (figura 1A, 1C). Cubierta la parte inferior del recipiente con una capa de agarosa al 1% (5 mL) para mantener la configuración de alimentación adecuadamente humidificado y servir como un sustrato blando para las moscas caminar sobre (figura 1B). El contenedor lo ofrece un entorno naturalistico pero controlado con mínimo estrés o alteración a las moscas.
    1. Preparar el envase exterior. 0,5 g de agarosa se suspende en 50 mL de agua bidestilada, calor con agitación frecuente y hervir hasta para disolver completamente en un agitador magnético con una placa de calor.
    2. Cuando el 1% agarosa enfriado a unos 60 ° C, transferir 5 mL de agarosa al 1% a un vacío fuera de envase (figura 1B) y permita que los recipientes permanecen abiertos hasta que enfríe a temperatura ambiente para producir una almohadilla de agarosa.
  2. Preparar la comida marcada con colorante. Composición de los alimentos marcados con tinte varía en función de diversos propósitos experimentales. Aquí es un ejemplo de preparación de los alimentos etiquetados de tinte que contiene solamente sacarosa.
    1. Añadir 0,5 g de agarosa a 50 mL de agua bidestilada, calor con agitación frecuente y hervir para disolver completamente en un agitador magnético con una placa de calor.
    2. Cuando la agarosa 1% arriba se enfría a unos 60 ° C, añadir a la agarosa para obtener sacarosa 100 mM 1,71 g de sacarosa.
    3. Añadir 0,25 g de colorante azul (erioglaucine disódico) a la solución de agarosa para obtener alimento de marcado tinte de 0.5% (p/v).
  3. Preparar el interior contenedor. Poner el vacío dentro de contenedores sobre una superficie horizontal plana, luego agregar 750 μl de alimentos marcados con tinte azul para contenedores de alimentos individuales, deje que se solidifique durante al menos 5 minutos.
    Nota: Interior contenedor es un pequeño plato de plástico con 13,6 mm de diámetro interior y una altura de 7,5 mm (figura 1A, 1C). Está lleno de comida marcado con tinte y luego se coloca en el centro de la almohadilla de la agarosa del envase exterior.
  4. Transferir un relleno dentro de envase en un recipiente exterior preparado y colocarlo en el centro de la almohadilla de agarosa. Deje que las cámaras de alimentación permanecen abiertos a temperatura ambiente durante 40 minutos hasta que la pared del recipiente exterior está libre de condensación.
    Nota: La pared es necesaria para evitar que las moscas están pegadas en la pared por contacto con gotas de agua.
  5. Preparar cámaras alimentación con alimentos libres de colorantes (misma composición pero sin teñir) de fondo.

2. preparación de las moscas

Nota: Hembra adulta vuela 5 a 10 días tras eclosión normalmente se utilizan para la alimentación de los ensayos. Se recomienda para preparar moscas de diferentes genotipos, incluyendo controles genéticos y en paralelo. 20 moscas (de una cámara de alimentación) generan un punto de datos.

  1. Considerar la densidad de población para la cría de moscas adultas. Control de la densidad de población por lo general, variando el número de moscas los padres según las cepas y las dimensiones de los frascos de cultivo. Por ejemplo, transferir 15 machos y 30 hembras de Cantón-S a un frasco de cultivo (31,8 mm de diámetro) y una altura de 80 mm y dejar que las hembras para poner huevos para un día y luego quitar que el adulto vuela.
  2. Preparar moscas para la activación de thermogenetic.
    1. Utilizar el sistema de Gal4/UAS38 para expresar dTRPA133 en varias neuronas por travesía que UAS-dTrpA1 vuela con líneas de GAL4 controlador (figura 2B).
    2. Mantenga las moscas adultas en alimentos a 22 ° C, humedad relativa de 60% y un ciclo de luz-oscuridad de 12 h/12 h.
    3. Ensayo dos días antes de la alimentación, ordenar y recoger moscas en un CO2 cojín mosca debajo de un microscopio estéreo en un frasco de alimento fresco y mantener una densidad de 20 moscas por frasco.
  3. Preparar moscas para la activación de optogenetic.
    1. Utilizar el sistema de Gal4/UAS38 para expresar CsChrimson36 en diferentes neuronas por cruce UAS-CsChrimson moscas con diferentes líneas de controlador de GAL4.
    2. Recoger nuevamente moscas eclosed (dentro de 24 h) y transferir a un frasco con alimentos que contengan 400 μm all-trans-retinal.
    3. Para evitar la activación prematura, envolver los frascos de cultivo con papel de aluminio y luego ponerlas en una caja oscura para proteger a moscas de la estimulación de luz no deseada. Mantenga las moscas a 25 ° C, 60% de humedad en la oscuridad de 4 a 6 días.
    4. Dos días antes del ensayo de alimentación hembra tipo vuela en CO2 almohadilla mosca debajo de un microscopio estéreo. Recoger 20 moscas en el frasco de un alimento y mantener en la oscuridad antes de la prueba de alimentación.
    5. Realizar todas las operaciones bajo la tenue luz tan rápido como sea posible para evitar los efectos causados por la luz ambiental. Use una lámpara de LED colocada muy lejos de la zona de trabajo, la intensidad en la zona de trabajo es 5 μW/cm2.
      Nota: Uso de hambre Cantón-S vuela como un control positivo para el análisis de alimentación. Privar a estas moscas de la comida y mantener en agarosa al 1% durante 24 h antes de la prueba de alimentación. Los niveles de consumo de alimentos de las moscas ayudan a evaluar las fluctuaciones día a día.

3. thermogenetic activación

  1. Llevar a cabo todos los experimentos alimentación al mismo tiempo del día, alrededor de Zeitgeber tiempo 4-631,32, para reducir al mínimo las variaciones debido a los ritmos circadianos.
  2. Preparar una incubadora (o una pequeña habitación con una estufa de temperatura controlada) como entorno de calefacción.
  3. Antes de los experimentos conductuales, equilibre las cámaras alimentación preparadas a la temperatura experimental (30 ° C) durante 2 h asegurar que la temperatura es uniforme relativa en la cámara de alimentación.
  4. Para iniciar el proceso de alimentación, cuidadosamente transferir 20 moscas de su frasco de inicio en una cámara de alimentación precalentada dando suaves golpecitos. Continuar el proceso de alimentación a 30 ° C durante 60 min ( Figura 3A) .
    Nota: Agitaciones frecuentes, tales como apertura y cierre de la puerta de la incubadora, afectar negativamente el comportamiento de alimentación, por lo tanto deben reducirse.
  5. Cesar a 60 min de alimentación congelando las cámaras alimentación de-80 ° C (ó -20 ° C) durante 30 minutos.
    Nota: Punto de congelación ayuda a detener la alimentación en todas las cámaras simultáneamente. Vuela a-80 ° C de congelación tiene dos propósitos, para euthanizing las moscas y para almacenamiento hasta homogeneización hasta una semana.
  6. Para el grupo de control de temperatura, transferencia de 20 moscas en una temperatura alimentación cámara con tinte color alimento para iniciar el proceso de alimentación a 22 ° C durante 60 min.
  7. Dejar la alimentación del grupo de control de temperatura congelando las cámaras a-80 ° C (o -20 ° C) durante 30 minutos.

4. Optogenetic activación

  1. Llevar a cabo todos los experimentos alimentación al mismo tiempo del día, alrededor de Zeitgeber tiempo 4-631,32, para reducir al mínimo las variaciones debido a los ritmos circadianos.
  2. Cuidadosamente transfiera 20 moscas de un frasco en una cámara de alimentación golpeando suave y vuelva a colocar la cámara hacia los lados en la instalación de iluminación (Figura 4A, 4B).
    1. Para la manipulación de optogenetic, utilice una matriz de LEDs naranja (607 nm) como la fuente de estimulación de luz y fijar una placa de plexiglás horizontal por encima de los LEDs para apoyar la alimentación de cámaras durante la iluminación. Guardar la configuración en una incubadora a 25 ° C con una humedad de 60% (Figura 4A, 4B).
    2. Estimular las moscas control genético en paralelo con el Taotie > CsChrimson vuela, pero en diferentes cámaras de alimentación.
  3. Continuar el proceso de alimentación de 60 minutos con iluminación trasera por la luz anaranjada.
    1. Determinar las intensidades de iluminación óptima para optogenetics experimental36. Para el Taotie > CsChrimson moscas, una intensidad de 2,2 mW/mm2 induce parálisis (cese de locomoción) y pérdida de control postural, por lo tanto, utilizar una intensidad intermedia de 0,1 mW/mm2 para estimular el Taotie > CsChrimson vuela durante la prueba de alimentación.
  4. Dejar la alimentación por congelación cámaras alimentación de-80 ° C (ó -20 ° C) durante 30 minutos.

5. visual estimación de consumo de alimentos

Nota: El enfoque visual de puntuación provee una estimación semicuantitativa de los consumos de alimentos. Aunque no es tan objetivo como el método óptico, este método permite pasar por un gran número de cepas de la mosca de manera oportuna, lo que es adecuado para la primera ronda de una pantalla genética para reducir rápidamente la lista de candidatos para otras pruebas.

  1. Después del proceso de alimentación, anestesiar y anotar las moscas en un CO2 cojín mosca debajo de un microscopio estéreo. Dar puntuación individual para cada mosca basado en el volumen y la intensidad de color de tinte de comida en su abdomen (figura 2A).
    Nota: Criterios para la estimación visual: el sistema de puntuación tiene 4 niveles de ingesta de alimentos correspondientes a diferentes volúmenes e intensidades de color comida en el abdomen.
    1. Puntuación vuela sin alimentos de tinte color perceptible un puntaje de 0; aquellos con leve tinte azul (apenas perceptible) o con tinte color alimentos ocupan menos de un tercio del volumen del abdomen dan una puntuación de 1.
    2. Puntuación vuela con intensa comida de tinte color ocupando la mitad del abdomen una puntuación de 2.
    3. Aquellos con intenso teñido contenido ocupa más de la mitad del abdomen marcar una puntuación de 3 (figura 2A).
  2. Calcular la proporción de moscas con diferentes puntajes en cada condición experimental (figura 2B).

6. colorimétrica cuantificación de consumo de alimentos

  1. Después de vaciar el cese de la alimentación, todas 20 moscas de un alimentación del compartimiento en un pedazo de papel de peso, luego transfieren a un tubo de 1,5 mL con un cepillo suave.
    Nota: No tome todas las cámaras de almacenamiento de-80 ° C a la vez para evitar moscas se peguen a la pared de la cámara debido a la condensación de agua en la cámara de frío.
  2. Añadir 500 μl de SAFT al tubo y homogeneizar las moscas con un molino que muele a 60 Hz durante 5 s.
    1. Confirmar homogeneización suficiente observación cuando no hay detectables fragmentos de partes del cuerpo.
  3. Girar los tubos con homogenados durante 30 min a 13.000 rpm a limpiar los escombros.
  4. Después de la centrifugación, transferir 100 μl de sobrenadante a un pozo de una placa de 96 pocillos.
  5. Después de todas las muestras se cargan, poner la placa en un lector de placas para medir la absorbancia de las muestras a 630 nm.
  6. Para eliminar la absorbancia de fondo, restar la absorbancia del sobrenadante de moscas que se alimentan de comida sin tinte de la absorbancia del sobrenadante de las moscas azules alimentados con alimentos.
    Nota: Este paso es opcional, dependiendo de las composiciones del alimento utilizado. Cuando un alimento mosca (sin tinte) genera la absorbancia a 630 nm, es necesario realizar este paso para eliminar el fondo.

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Resultados

Pantalla thermogenetic.

Apetito anormalmente creciente provoca ingesta elevada, independientemente de las necesidades fisiológicas. Se utilizó este esquema para el diseño de un alto rendimiento conductual pantalla obtener mangos genéticas de las neuronas relacionadas con el hambre y saciado de Estados (figura 1). La pantalla rindió Taotie-Gal424. Cuando las neuronas ...

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Discusión

Este informe se centra en el proceso técnico de ensayos de alimentación tinte etiquetado de consumo de alimentos en el contexto de thermogenetic y activación de optogenetic manipular neuronas control de alimentación. Este Protocolo simple y confiable ayudará a dilucidar la función de las neuronas de candidato en la alimentación de control, para medir la preferencia de alimentos de las moscas y para identificar nuevos actores en los circuitos de control alimentación vía pantallas genéticas basadas en la alimentación de

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Divulgaciones

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por nacional básico de investigación programa de China (2012CB825504), Fundación de Ciencias naturales Nacional de China (91232720 y 9163210042), Academia China de Ciencias (CAS) (GJHZ201302 y QYZDY-SSW-SMC015), Bill y Melinda Gates Programa de Fundación (OPP1119434) y 100 talentos de CAS a Zhu Y..

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
UAS-CsChrimsonBloomintoon55135
UAS-dTrpA1Bloomintoon26263
TDC1-GAL4 Bloomintoon9312
TDC2-GAL4Bloomintoon9313
sNPF-GAL4proporcionado por Z. Zhao
NPF-GAL4proporcionado por Y. Rao
TH-GAL4proporcionado por Y. Rao
5-HT-GAL4proporcionado por Y. Rao
AKH-GAL4proporcionado por Y. Rao
dip2-GAL4Proporcionado por Y. Rao
Taotie-GAL4Proporcionado por J. Carlson
AgaroseBiowest G-10
SacarosaSigmaS7903
Erioglaucina sal disódicaSigma 861146
all-trans-retinal Sigma R2500almacenado en la oscuridad
Triton X-100Amresco9002-93-01
Alimentomoscas 1 L alimento contiene: 77,7 g de harina de maíz, 32,19 g de levadura, 5 g de agar, 0,726 g de CaCl2, 31,62 g de sacarosa, 63,2 g de glucosa, 2 g de sorbato de potasio, pH     
  1x búfer PBS 1 L 1X PBS contiene: 8 g de Nacl, 0,2 g de Kcl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, pH 7,4
PBST Tampón1X PBS con 1% Triton X-100
  Molino de moliendaShang Hai Jing XinIncubadora Tissuelyser-24
NingBo Jiang NanHWS-80
Agitador magnético con placa térmicaChang Zhou Bo YuanCJJ 78-1
EspectrómetroThorlabsCCS200/M
Microplaca EspectrofotómetroThermo Scientific Multiskan GO Tipo: 1510, REF 51119200
Microscopio estereoscópico de fluorescencia Leica  M205FA
Microscopio estereoscópicoLeica S6E
Contenedor exteriorFrasco de vidrio Jiang Su Hai Mencon un diámetro de 31,8 mm y una altura de 80 mm (dimensión interior)
Contenedor interior la fábrica de maquinaria Beijing Yi Rancon un diámetro de 13,6 mm y una altura de 7,5 mm (dimensión interior)
1,5 mL Tubos EppendorfHai Men Ning Mong
  placa de 96 pocillosCorning Incorporated  Costar 3599
LEDsXin Xing Yuan Guangdian607 nm, 3W https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058
para Plato de plástico de

Referencias

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Ensayo de ingesta de alimentosDrosophila melanogasteractivaci n termogen ticaestimulaci n optogen ticaalimento marcado con colorantemanipulaci n neuronalcomportamiento alimentariocuantificaci n de colorante azulconfiguraci n de almohadilla de agarosaan lisis en lector de placas

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