Describimos la estrategia de producción de vectores lentivirales integrasa deficientes (IDLVs) como vehículos para la entrega de CRISPR/Cas9 a las células. Con una capacidad para mediar la edición rápido y robusto gene en células, IDLVs actualmente un seguro y plataforma igualmente eficaz vector de genes en comparación con vectores competentes integrasa.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un protocolo para la producción de vectores lentivirales integrasa deficientes para CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout en dividir las células
En este artículo
Resumen
Resumen
Vectores lentivirales son una opción ideal para la entrega de componentes de edición de genes a las células debido a su capacidad para estable transducción de una amplia gama de células y mediadores altos niveles de expresión génica. Sin embargo, su capacidad para integrarse en el genoma de la célula huésped aumenta el riesgo de mutagénesis de insertional plantea preocupaciones de seguridad y limita su uso en contextos clínicos. Además, la expresión persistente de los componentes gene-edición había entregada por estos aumentos de vectores lentivirales integración competente (ICLVs) la probabilidad de promiscuo gene targeting. Como alternativa, se ha desarrollado una nueva generación de vectores lentivirales integrasa deficientes (IDLVs) que se ocupa de muchas de estas preocupaciones. Aquí el protocolo de producción de una plataforma IDLV nueva y mejorada para la edición de genes mediada por CRISPR y lista los pasos involucrados en la purificación y concentración de tales vectores se describe su transducción y eficacia gene-edición usando HEK-293T células fue demostrada. Este protocolo es fácilmente escalable y puede usarse para generar IDLVs de alto título que son capaces de transducción de las células in vitro y en vivo. Además, este protocolo puede ser fácilmente adaptado para la producción de ICLVs.
Introducción
Edición precisa gen constituye la piedra angular de los avances biomédicos importantes que implican el desarrollo de nuevas estrategias para hacer frente a enfermedades genéticas. En la vanguardia de las tecnologías de edición de gene es el método apoyándose en el uso de la clustered regularly -nterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / sistema de Cas9 que inicialmente fue identificado como un componente de inmunidad bacteriana contra la invasión de material genético viral (revisado en las referencias1,2). Una ventaja importante del sistema CRISPR/Cas9....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. cultivo de células HEK-293T y siembra para transfección
Nota: Riñón embrionario humano 293T (HEK-293T) las células son cultivadas en DMEM, medios de comunicación de alta glucosa suplementado con suero de ternera 10% suplementado con promotores de crecimiento y hierro y solución de antibiótico-antimicótico 1 x (100 x solución contiene penicilina unidades 10.000 estreptomicina 10 mg y 25 μg de anfotericina B por mL). Los medios de comunicación también se complementa con piruvato de sodio x 1, mezcla de aminoácidos no esenciales 1 x y 2 mM L-glutamina (dipéptido stock 200 mM L-Alanil-L-glutamina en 0,85% NaCl). Las células se cultivan en plac....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Validación de la eficacia de nocaut de vectores IDLV-CRISPR/Cas9
Utilizamos células 293T GFP-expresando como un modelo para validar la eficacia de knockout de genes CRISPR/Cas9-mediada. Las células GFP + fueron generadas por transducción de células HEK-293T con pLenti-GFP (vBK201a) en una MOI de 0.5 (figura 3b, el panel "no virus"). El cassette sgRNA-GFP/Cas9 todo-en-uno vector fue empaquetado en partículas IDLV o ICLV y p24 ELI.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
IDLVs han comenzado a emerger como el vehículo de elección en vivo gene-la edición, especialmente en el contexto de enfermedades genéticas, debido en gran parte al bajo riesgo de mutagénesis asociado con estos vectores respecto a la integración de las plataformas de entrega22 , 28. en el manuscrito actual, intentamos detallar el protocolo asociado con la producción del todo-en-uno IDLV-CRISPR/Cas9 sistema mejorado que se desarrolló recientemente en nuest.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
USC-499-P de la patente (1175) fue presentada por la Universidad de Carolina del sur en relación con el trabajo descrito en este manuscrito.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Departamento de Neurobiología, Duke University School of Medicine y del Decanato de ciencias básicas, Universidad de Duke. También agradecemos a los miembros de la base de Vector Viral de duque para comentarios sobre el manuscrito. Plásmido pLenti CRISPRv2 fue regalo Feng Zhang (Broad Institute). El sistema LV-packaging incluyendo el psPAX2 de plásmidos, VSV-G, pMD2.G y pRSV-Rev fue un amable regalo de Didier Trono (EPFL, Suiza). Apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por la Universidad de Carolina del sur Facultad de medicina, conceder RDF18080-E202 (B.K).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrífuga | Beckman Coulter | A99839 | |
| Allegra 25R | Beckman Coulter | 369434 | |
| xMark Microplate Lector de placas de absorbancia | Bio-Rad 1681150 | ||
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Microscopio de fluorescencia invertida | Leica | DM IRB2 | |
| 0.45-μ unidad de filtro m, 500 ml | Tubos de | Corning 430773 | |
| Seton Scientific | 5067 | ||
| Adaptadores de tubo cónico | Seton Scientific | PN 4230 | |
| SW32Ti rotor de cubo oscilante | Beckman Coulter | 369650 | |
| Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL | Corning | 430791 | |
| cónicos de 50 ml tubos de centrífuga | Corning | 430291 | |
| Placas de alta ligereza de 96 pocillos | Corning | 3366 | |
| 150 mm Placas de cultivo celular tratadas con TC con rejilla de 20 mm | Corning | 353025 | |
| placa de cultivo tratada con TC de 100 mm | Corning | 430167 | |
| 0,22 μ Unidad de filtro M, | 1L | Corning 430513 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Pipetas para cultivo de tejidos, 5 mL | Corning | 4487 | |
| Pipetas para cultivo de tejidos, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Pipetas para cultivo de tejidos, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Hemacitómetro con cubreobjetos | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Nombre | Compañía | Número de catálogo | Comentarios |
| Reactivos de cultivo celular | |||
| Riñón embrionario humano 293T (HEK 293T) células | ATCC | CRL-3216 | |
| 293FT | célulasThermo Fisher Scientific | R70007 | |
| DMEM, medios con alto contenido de glucosa | Gibco | 11965 | |
| Suero cósmico de ternera | Hyclone | SH30087.04 | |
| Solución antibiótica-antimicótica, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Piruvato de sodio | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| Aminoácido no esencial (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| RPMI 1640 medios | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Tripsina-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| BES (N, N-bis (2-hidroxietil)-2-amino-etanosulfónico) | Sigma Aldrich | B9879 - BES | |
| Gelatina | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Name | Company | >Número de catálogo | Comentarios |
| >p24 Reactivos ELISA | |||
| Monoclonal anti-p24 anticuerpo | reactivos de referencia e investigación sobre el SIDA de los NIH | 3537 | |
| Normas sobre el VIH-1 Programa de | reactivos de referencia e investigación sobre el SIDA de los NIH | SP968F | |
| Anticuerpo policlonal anti-p24 | Programa de reactivos de investigación y referencia del SIDA de los NIH | SP451T | |
| rábano picante anti-conejo de cabra IgG | Sigma Aldrich | 12-348 Concentración de | trabajo 1:1500 |
| Suero de ratón normal, Estéril, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Suero de Cabra, Estéril, 10mL | Sigma | G9023 | Concentración de trabajo 1:1000 |
| TMB Sustrato de peroxidasa | KPL | 5120-0076 | Concentración de trabajo 1:10,000 |
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Plasms | |||
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| lentiCRISPR v2 | Addgene | 52961 | |
| Name | Company | Número de catálogo | >Comments |
| Enzimas de restricción | |||
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | Nueva Inglaterra Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Referencias
- Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 1....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
