Visualización dinámica de lignificación en plantas con la química Click: doble etiquetado es felicidad!

Resumen

BLISS, un etiquetado de dos protocolos para estudiar la dinámica de la lignificación, fue desarrollado. Con sintética monolignol reporteros y una combinación secuencial de bioorthogonal SPAAC y CuAAC haga clic en reacciones, esta pavimenta la manera a un análisis profundo de los factores que regulan la biogénesis de lignina en la plantade la metodología.

Resumen

La lignina es uno de los biopolímeros más prevalentes en el planeta y un componente importante de la biomasa lignocelulósica. Este polímero fenólico desempeña un papel estructural y protección vital en el desarrollo y vida de las plantas superiores. Aunque los intrincados mecanismos de regulación procesos de lignificación en vivo fuertemente impactan la valorización industrial de muchos productos de origen vegetal, la comunidad científica todavía tiene un largo camino por recorrer para descifrarlos. En un flujo de trabajo de tres pasos simple, el protocolo de etiquetado doble aquí presentado permite estudios de Bioimagen de activamente lignifying zonas de tejidos de la planta. El primer paso consiste en la incorporación metabólica de dos reporteros químicas independientes, sustitutos de los dos monolignols nativas que dan lugar a lignina unidades H y G. Después de la incorporación al cultivo de polímeros de lignina, cada reportero entonces se etiqueta específicamente con su propia sonda fluorescente mediante una combinación secuencial de bioorthogonal SPAAC/CuAAC clic reacciones. Combinado con autofluorescencia de lignina, este enfoque conduce a la generación de mapas de localización tricolor de lignina en las paredes celulares por microscopía de fluorescencia confocal y proporciona información espacial precisa de la presencia o ausencia de activo maquinaria de lignificación en la escala de los tejidos vegetales, células y capas de la pared celular diferente.

Introducción

En las últimas dos décadas, la estrategia de reportero químico ha emergido como una metodología de dos etapas de gran alcance para investigar la dinámica y funciones de biomoléculas no genéticamente codificados. ^{1 , 2 , 3} en esta estrategia un análogo sintético de la biomoléculas de interés con una modulación pequeña – el reportero químico – es primero metabolizado por el organismo vivo y luego una sonda química (por ej., un fluoróforo para fluorescencia proyección de imagen de la microscopia confocal) es covalente a la reportera incorporada vía química del tecleo de bioorthogonal. La sonda debe reaccionar rápidamente y específicamente con la modificación introducida química siendo inerte a cualquier biomoléculas presentes en el sistema de vida. En muchos sentidos, este método supera las limitaciones de técnicas bioconjugation comunes a través del uso altamente específico haga clic en trompas de química proporcionando así la oportunidad de rastrear metabolitos o biomacromoléculas que eran previamente inaccesibles en la vida de los sistemas^4,5,6.

A pesar de la creciente popularidad de este poderoso método en células bacterianas y animales, informes que describen su uso en Biología Vegetal son sorprendentemente pocos y lejos entre^{7,8,9,10, 11,12}. Estábamos particularmente interesados en la aplicación de esta estrategia en las plantas para el estudio de la formación de la lignina, uno de los biopolímeros más prevalentes en el planeta y un componente importante de la biomasa lignocelulósica. ^{13 , 14} la lignina es un polímero fenólico que desempeña una función estructural y protectora vital en el desarrollo y vida de las plantas superiores.

Generalmente se compone de tres partes de 4-hydroxyphenylpropanoid: H (p- hidroxifenil), G (guaiacyl) y S (syringyl) unidades derivan respectivamente de tres 'monolignols' (p- coumaryl, coniférico sinapyl alcoholes y) que son sintetiza a través de la vía fenilpropanoide en el citoplasma de la célula (figura 1). Después de ser exportado a la pared celular, se oxidan monolignols a los radicales por peroxidasas o lacasas que sufren reacciones puramente químicas acoplamiento radical para polimerizar a los polímeros de lignina, un proceso llamado lignificación. ^{15 , 16} aunque lignins impactan fuertemente la valorización industrial de muchos derivados de plantas productos, la comunidad científica todavía tiene un largo camino por recorrer para descifrar los intrincados mecanismos de regulación lignificación.

Figura 1: el proceso de lignificación en células de la planta. Monolignols es biosintetizada a partir de fenilalanina en el citosol. Después de ser exportado a la pared celular, se oxidan monolignols a los radicales por peroxidasas o lacasas que sufren reacciones puramente químicas acoplamiento radical para polimerizar a los polímeros de lignina, un proceso llamado lignificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aunque los informes sobre el uso de reacciones bioorthogonal para el análisis de glicanos son numerosos,^2,3,,¹⁷ sus ejemplos de aplicación a otros tipos de biomoléculas son menos. El uso de la química bioorthogonal lignina Bioimagen fines fue promovido recientemente por Tobimatsu et al. ⁸ en Arabidopsis thaliana para proporcionar información sobre la incorporación de coniférico sustitutos de alcohol en el polímero lignina donde forma las unidades de G,^8,9 demostrando así la prueba de concepto que estrategias de reportero químico son aplicables en este contexto. El uso de CuAAC fue también ilustra usando un derivado de alcohol coniférico diferentes unos meses más tarde por Bukowski et al. ⁹ sin embargo, lignina también contiene unidades H y S y una comprensión más profunda del proceso de lignificación requiere más conocimientos sobre cómo de la monolignols son incorporados en el polímero y qué factores pueden controlar su composición. Nuevos avances en este campo actualmente dependen del desarrollo de metodologías eficientes para seguir simultáneamente varios reporteros químicos en sistemas vivos. A pesar de que algunos artículos sobre glicanos sentaron las bases en los últimos años^{18,19,20,21,22}, doble etiquetado enfoques siguen siendo un reto importante en bioorthogonal química. Si un reproducible etiquetado solo haga clic en protocolo es difícil de desarrollar, entonces doble etiquetado enfoques que requieren la optimización en tándem de dos mutuamente compatible bioorthogonal reacciones en dos reporteros químicos separados están aún más difíciles. Los pocos ejemplos que fue pionera en este aspecto utilizan una combinación de tensión promovido azida-alquino cicloadición (SPAAC) y las reacciones de Diels-Alder (DA_inv) de demanda electrónica inversa alkene tetrazina para estudiar glycans en las células animales. Sin embargo, pensamos que la bioorthogonality de la reacción de DAinv no puede ser garantizado en esta aplicación debido a las características estructurales de la lignina (que consiste en monómeros ricos en electrones substituido cinamil-tipo que pueden reaccionar con los pobres en electrones Dienes como las sondas de tetrazina utilizadas en reacciones de DAinv) y que esto puede generar no específicos de etiquetado. Además, la reacción de_inv DA requiere manijas químicos sintético difícil acceso, como abultado y lipofílico aumentando la posibilidad de que la tasa de incorporación, transporte o localización de la sustancia reportero en vivo puede verse afectada. Como considera que este último aspecto es particularmente relevante en el caso de un enfoque de química haga clic en para el estudio de lignificación, elegimos una dirección diferente y desarrollado una ligadura del Bioorthogonal imagen secuencial estrategia (BLISS) utilizando un combinación de cicloadición de azidas alquino Strain-Promoted (SPAAC) y cicloadición azida-alquino catalizada por el cobre (CuAAC) en vivo. ²³

Estas dos reacciones son los dos bioorthogonal principales, haga clic en reacciones que se han utilizado hasta la fecha, y más particularmente en los pocos ejemplos de la lignina de imágenes han sido publicados recientemente. ^{8 , 9} nuestra estrategia etiquetado dual permite el uso de una molécula de azida en un monolignol reportero y un alquino terminal por el otro, dos manijas química i) unreactive hacia estructuras biológicamente relevantes y ii) muy pequeño de tamaño (figura 2 ). Como resultado, el impacto de estas modificaciones sintéticas sobre las propiedades fisicoquímicas de las biomoléculas en estudio se reduce al mínimo reduciendo así posibles discrepancias entre los sustratos de monolignol natural y antinatural en términos de transporte y tasas de metabolización durante la etapa de incorporación metabólica. Aunque la combinación de SPAAC y CuAAC parece muy intuitiva a primera vista, es a nuestro conocimiento sólo en el segundo ejemplo de marca dual con esta estrategia y la primera aplicación en estructuras que no sean de glicanos. ^{12 , 23}

Figura 2: BLISS doble etiquetado estrategia. Química reporteros H_AZ y G_ALK son análogos de etiquetado de la nativa monolignols H y G. En primer lugar se incorporan en los polímeros de lignina creciente de las paredes celulares por la alimentación exógena (paso 1). Cyclooctyne - y azida-functionalized sondas fluorescentes entonces se unen secuencialmente a los reporteros incorporados por bioorthogonal química click: la reacción de SPAAC (paso 2) es altamente específica del H_AZ unidades y es seguida por un CuAAC reacción ( Paso 3) que es específico de G_ALK unidades (paso 3), lo que permite la localización específica de ambos reporteros independientemente en la misma muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diseñado en primer lugar y validado la azida-tagged monolignol reportero H_AZ (sustituto de p- coumaryl alcohol) y precursor de las unidades de lignina H y entonces ideó dicha doble estrategia de etiquetado en el que se utiliza en conjunto con la había divulgado previamente etiquetado alquino G_ALK,⁹ (sustituto de alcohol coniférico) y precursor de las unidades de G de lignina. En el presente Protocolo reproducible desarrollada y probada en lino, una especie de planta económicamente importante, la doble incorporación metabólica de H_AZ y G_ALK en lignina se logra primero antes de SPAAC/CuAAC secuencial etiquetado. Aquí, etiquetado H_AZ unidades primero están marcadas específicamente por medio de la ligadura de la SPAAC de un fluoróforo cyclooctyne funcionalizados, seguida de ligadura CuAAC-mediada de una segunda sonda fluorescente etiquetado G_ALK unidades. Este método fue utilizado para investigar la dinámica de los procesos de lignificación de las paredes celulares y puede ser aplicada en vivo para cortes transversales, viven tallos y plántulas de diferentes especies de plantas.

Protocolo

Nota: Los medios MS ½ líquidos y sólidos deben ser preparados previamente como se describe en la tabla adicional 1.

1. cultivo de vegetales

1. Cultivo de plantas lino de 2 meses de edad
   1. Sembrar las semillas de lino (Linum usitatissimum L.) en macetas de plástico con abono de maceta.
   2. Crecer lino en cámaras de crecimiento a 22 º C con un fotoperiodo de 16 h/8 h día/noche.
   3. Equipar a las plantas con soporte vertical después de 1 mes y crecer hasta los 2 meses de edad.
2. Cultivo de plántulas lino de 2 semanas de edad
   1. Envuelva 12 semillas de lino en un trozo de tela de queso y fije con una banda elástica para hacer un paquete.
      Nota: Llevar a cabo los siguientes pasos bajo condiciones estériles bajo una campana de flujo laminar.
   2. Coloque el paquete de semillas en un frasco de vidrio previamente esterilizado 250 mL.
   3. Añada 70 mL de 70% EtOH en la botella y suavemente agitar durante 1 minuto.
   4. Retire con cuidado el EtOH por decantación, dejando el paquete en la botella.
   5. Añadir 100 mL de hipoclorito sódico al 2% y agitar suavemente durante 10 minutos.
   6. Retirar la solución de hipoclorito de sodio por decantación, dejando el paquete en la botella.
   7. Repita los pasos 1.2.5-1.2.6.
   8. Añadir 100 mL de agua ultrapura estéril y agitar durante 1 minuto.
   9. Repita el paso 1.2.8 3 veces, en aumentar el tiempo de lavado para cada aclarado (5, 10 y 15 min).
   10. Caliente medio MS ½ sólido, viértala en una caja de cultura estéril de la planta a una altura de 2 cm y dejar enfriar hasta la solidificación.
   11. Coloque delicadamente cada semilla en medio sólido, utilizando pinzas estériles.
   12. Cierre la caja estéril.
   13. Transferir la caja a una cámara de crecimiento a 22 º C con un fotoperiodo de 16 h/8 h día/noche y crecer plántulas lino durante 2 semanas.

2. metabólica incorporación de reporteros química

Nota: A continuación se presentan tres modelos experimentales: etiquetado i) metabólica de los cortes transversales de tallo, tallos ii) todo y iii) planta de semillero. Cada protocolo se presenta una repetición biológicos y cantidades se pueden adaptadas al número de repeticiones biológicas requiere. Las soluciones de monolignol se preparan de soluciones comunes que se realizan como se describe en la tabla 2 antes del experimento. Las soluciones stock pueden almacenar varios meses a-20 ° C. El H_AZ: G_ALK o H:G proporciones pueden ajustarse todos los diseños experimentales por encargo.

1. Incorporación de reportero químico en 2 cortes transversales de tallo de lino de meses
   1. Preparar una solución de reportero químico de 300 μL conteniendo 10 μm de G_ALK y 10 de H_AZ en medio líquido de MS ½ estéril.
   2. Vórtice del H_AZ/G_{producto alcalino} solución y transferir a un pozo de una placa de 48 pozos con una micropipeta.
   3. Preparar un 300 μL control negativo solución 10 μm de G y 10 h en medio líquido de MS ½ estéril.
   4. Vórtice H/G solución y transferir a un segundo pozo de la misma placa de 48 pozos.
   5. Corte el tallo de una planta de lino meses 2 a 10 cm sobre el nivel del suelo utilizando una hoja de afeitar nueva.
   6. Delicadamente preparar 50 secciones transversales a mano alzada del tallo con la hoja de afeitar (aproximadamente 150-250 μm de espesor).
   7. Colocar inmediatamente los cortes transversales en medio MS ½ estéril líquido en un vidrio de reloj.
   8. Inspeccione visualmente y seleccionar cortes transversales todo intactos y distribuir al azar 10 de ellos en el pozo lleno de H_AZ/G_{producto alcalino} solución.
   9. Repita el paso 2.1.8 para bien llenado con H/G solución (control negativo).
   10. Repita el paso 2.1.8 un tercio bien llena con 300 μL de medio MS ½ (como control de fondo para ajustar la línea base de fluorescencia durante el posterior procesamiento de datos de imágenes de microscopía confocal).
   11. Incube la placa en luz continua en una cámara de crecimiento a 20 ° C durante 20 horas.
   12. Retirar la solución de monolignol en cada pocillo con una micropipeta.
   13. Añadir 500 μl de medio MS ½ a cada pocillo, agitar suavemente durante 10 minutos y retire este enjuague la solución con una micropipeta. Repetir 4 veces y proceder a dicha etiqueta inmediatamente (sección 3).
2. Incorporación de reportero químico en 2 meses los vástagos todo lino
   1. Preparar una solución de reportero químico de 5 mL que contiene 10 μm de G_ALK y 10 de H_AZ en medio líquido de MS ½ estéril.
   2. Vórtice del H_AZG_ALK solución y transferencia a una prueba de vidrio de 20 cm de alto tubo con una pipeta.
   3. Preparar una solución de control negativo de 5 mL que contiene 10 μm de G y 10 h en medio líquido de MS ½ estéril.
   4. Vórtice el HG de solución y transferir a una prueba de vidrio de 20 cm de alto tubo.
   5. Preparar un tercer tubo de vidrio que contiene 5 mL de medio MS ½ (como control de fondo para ajustar la línea base de fluorescencia durante el posterior procesamiento de datos de imágenes de microscopía confocal).
   6. Corte el tallo de una planta de lino meses 2 a 10 cm sobre el nivel del suelo utilizando una hoja de afeitar nueva. Deseche el sistema radicular y la parte inferior del tallo y proceder al siguiente paso con la parte superior de la espiga de la planta.
   7. No sumerja la base del tallo entero cortado en el tubo que contiene el H_AZ/G_{producto alcalino} solución. Coloque el vástago en su solución de incubación inmediatamente después del retiro de la raíz del sistema con el fin de evitar que se resequen.
      Nota: Si el método se aplica a las plantas más jóvenes/mayores u otras especies, el volumen de las soluciones de monolignol debe ajustarse según el tamaño / edad de la planta y el diámetro de su tallo.
   8. Coloque el vástago en un soporte vertical para mantenerlo recto.
   9. Sellar el tubo con parafilm para evitar la evaporación de la solución.
   10. Repita los pasos 2.2.6-2.2.9 para la muestra control negativo con el H/G de solución.
   11. Repita los pasos 2.2.6-2.2.9 para la muestra de control de fondo de fluorescencia que contiene el medio MS ½.
   12. Incubar cada tallo de 20 h de luz continua con una lámpara de neón.
   13. Después de 20 h de incorporación metabólica, quite el tallo se incubaron en la H_AZ/G_{producto alcalino} solución y enjuague con medio MS ½.
   14. Corte y deseche la parte inferior 1 cm del tallo con una hoja de afeitar y luego preparar un cilindro de alta de 1 cm de la base del tallo restante.
   15. Preparar 20 secciones transversales a mano alzada (aproximadamente 150-250 μm de espesor) de este cilindro y colóquelos inmediatamente en un vidrio de reloj con medio MS ½.
   16. Poner 500 μl de medio MS ½ en un pozo de una placa de 48 pozos.
   17. Inspeccione visualmente y seleccionar cortes transversales todo intactos y distribuir al azar 10 de ellos en el pozo que se llena con solución de MS ½.
   18. Repita los pasos del 2.2.13-2.2.17 para el vástago de control negativo se incubaron con la solución de H/G .
   19. Repita los pasos 2.2.13-2.2.17 para el vástago de control del fondo de la fluorescencia se incubaron con medio MS ½.
   20. Retire con cuidado la solución en cada pocillo con una micropipeta.
   21. Añadir 500 μl de medio MS ½ a cada pocillo, agitar suavemente durante 10 minutos y retire este enjuague la solución con una micropipeta. Repetir 4 veces y proceder a dicha etiqueta inmediatamente (sección 3).
3. Incorporación de reportero químico en 2 semanas de edad lino las plantas de semillero
   Nota: Los pasos siguientes todos llevan a cabo en condiciones estériles.
   1. Preparar una solución de reportero químico de 2 mL que contiene 10 μm de G_ALK y 10 de H_AZ en medio líquido de MS ½ estéril.
   2. Vórtice del H_AZG_ALK solución y transferencia a una prueba de 20 cm de altura vidrio tubo con una pipeta.
   3. Preparar una solución de control negativo de 2 mL que contiene 10 μm de G y 10 h en medio líquido de MS ½ estéril.
   4. Vórtice el HG de solución y transferir a una prueba de 20 cm de altura vidrio del tubo.
   5. Preparar un tercer tubo de vidrio de 20 cm de alto que contiene 2 mL de medio MS ½ (como control de fondo para ajustar la línea base de fluorescencia durante el posterior procesamiento de datos de imágenes de microscopía confocal).
   6. Delicadamente saque el medio MS ½ sólido utilizando un par largo de pinzas una plántula de lino de 2 semanas de edad (sección 1.2. arriba).
   7. Transferir suavemente la plántula al tubo que contiene el H_AZ/G_{producto alcalino} solución, asegurando que sus raíces se sumergen en la solución.
   8. Cerrar el tubo de vidrio con un tapón de plástico para evitar la evaporación.
   9. Repita los pasos 2.3.6-2.3.8 para el tubo de control negativo con el H / G de solución.
   10. Repita los pasos 2.3.6-2.3.8 para el tubo de control de fondo de fluorescencia que contiene el medio MS ½.
   11. Incubar cada plántula en luz continua en una cámara de crecimiento de 20 h a 20 ° C.
   12. Delicadamente saque la plántula se incubaron en la H_AZ/G_{producto alcalino} solución y enjuague con medio MS ½.
   13. Delicadamente preparar cortes transversales a mano alzada 20 (aproximadamente 150-250 μm de espesor) de la hipocotila.
   14. Poner 500 μl de medio MS ½ en un pozo de una placa de 48 pozos.
   15. Inspeccione visualmente y seleccionar cortes transversales todo intactos y distribuir al azar 10 de ellos en el pozo que se llena con solución de MS ½.
   16. Repita los pasos del 2.3.12-2.3.15 para la plántula del control negativo se incubaron con la solución de H/G .
   17. Repita los pasos 2.3.12-2.3.15 para la planta de control de fondo de fluorescencia se incubaron con medio MS ½.
   18. Retire con cuidado la solución en cada pocillo con una micropipeta.
   19. Añadir 500 μl de medio MS ½ a cada pocillo, agitar suavemente durante 10 minutos y retire este enjuague la solución con una micropipeta. Repetir 4 veces y proceder a dicha etiqueta inmediatamente (sección 3).

3. doble fluorescencia de etiquetado de muestras de sección de planta SPAAC y CuAAC

Nota: La dicha etiqueta protocolo es idéntica para todos los modelos experimentales 3 (sección 2).

1. Promovido por la cepa etiquetado cicloadición de azidas alquino (SPAAC)
   1. Preparar 1 mL de una solución SPAAC 5 μm de DBCO-PEG₄-5/6-carboxyrhodamine 110 en medio líquido de MS ½ estéril. Vórtice de la solución y mantener en la oscuridad.
   2. Después del lavado final pasos del Protocolo de incorporación metabólica [2.1.13, 2.2.21 o 2.3.19 dependiendo del diseño experimental elegido], retire el medio MS ½ y agregar 300 μL de la solución SPAAC por pozo con una micropipeta.
   3. Blinde la placa de 48 pozos de luz cubriéndola con papel de aluminio o colocando en una caja.
   4. Agitar suavemente la placa sobre un agitador mecánico de 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
2. Cobre-catalizada etiquetado cicloadición de azidas alquino (CuAAC)
   1. Lave cada bien 4 veces como se describe en el paso 2.1.13 manteniendo la placa en la oscuridad.
   2. Preparar 1 mL de una solución CuAAC ascorbato de sodio 2.5m m, 0.5m m de CuSO₄ y 5 μm 5-TAMRA-PEG₃-azida en medio líquido de MS ½ estéril. Vórtice de la solución y mantener en la oscuridad.
      Nota: Esta solución CuAAC debe estar recién preparada antes de usarlo y no se puede almacenar más de unos pocos días a 4 ° C.
   3. Retire el medio MS ½ en cada pozo y directamente agregar 300 μL de la solución CuAAC por bien utilizando una micropipeta.
   4. Agitar suavemente la placa sobre un agitador mecánico de 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
   5. Eliminar la solución CuAAC utilizando una micropipeta.
   6. Usando una micropipeta, agregar 500 μl de ½ MS, revuelva en la oscuridad durante 10 minutos luego retirar esta solución de lavado. Repetir dos veces.
   7. Agregar 500 μl de una solución de MeOH/agua 7:3, revolver en la oscuridad durante 1 h y extraer la solución
      PRECAUCIÓN: Metanol es tóxico por contacto con la piel o inhalación y es señalado como un carcinógeno humano. Su utilización requiere de guantes y campanas de vapores químicos.
   8. Agregar 500 μl de ½ MS, revuelva en la oscuridad durante 10 min luego retirar la solución. Repetir 4 veces.

4. montaje de muestras en microscopio de diapositivas

1. Lugar 5 gotas de medio de montaje en un portaobjetos de vidrio.
2. Depositar cuidadosamente cada H_AZ/G_ALKetiquetados sección transversal de la diapositiva.
3. Aplicar esmalte de uñas en dos lados opuestos de la diapositiva.
4. Cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos. Tenga cuidado para evitar burbujas de aire.
5. Retire el medio de montaje exceso con una toalla de papel.
6. Sellar la muestra con esmalte de uñas en los 4 lados. Deja las uñas barniz seco a temperatura ambiente (aproximadamente 30 min).
7. Repita los pasos 4.1-4.6 para las secciones transversales H/G del control negativo.
8. Repita los pasos 4.1-4.6 para las secciones de control del fondo de la fluorescencia.
9. Almacenar las diapositivas a 4 ° C en la oscuridad hasta la observación bajo un microscopio confocal.
   Nota: Los portaobjetos preparados se pueden guardarse por varias semanas a varios meses dependiendo de la calidad de la preparación. Si una nueva observación debe realizarse después del almacenamiento, asegurar que las muestras no se han secado.

5. adquisición de imagen de Microscopía Confocal de fluorescencia

1. Encienda todas las unidades necesarias del sistema de microscopía confocal en el orden correcto según las instrucciones del fabricante.
2. Seleccionar el objetivo deseado con la máxima apertura numérica y adaptado las longitudes de onda de excitación y de emisión (por ejemplo, objeto 60 x, N.A. 1.2. Canal de Autofluorescencia: λ_ex 405 nm, λ_em 450 nm 25; Canal de H_AZ SPAAC: λ_ex 488 nm, λ_em 525 nm 25; CuAAC G_ALK canal: λ_ex 561 nm, λ_em 595 nm 25; modo secuencial).
3. Seleccione los parámetros deseados para la generación de imágenes en el software (12 - o 16-bit requerido, tamaño de pixel adaptado al criterio de Nyquist).
4. Colocar el portaobjetos/g H_AZALK en la platina del microscopio y colocar la muestra bajo la lente del objetivo.
5. Observar y buscar la región deseada del tejido de la planta.
6. Adquirir imágenes confocal de alta calidad de doblemente marcada H_AZ/G muestra_ALK .
   1. Seleccione el plano más fluorescente en el eje z.
   2. Ajuste de ganancia, alimentación offset y láser para conseguir la distribución óptima de la señal a lo largo de la toda gris nivel para cada canal (autofluorescencia, H_AZ y G_ALK). Deben aplicarse los mismos parámetros para todas las adquisiciones siguientes.
   3. Iniciar la adquisición de la imagen seleccionada y guarde el archivo. Repita para cada área relevante de la muestra.
      Nota: reconstrucciones 3D de la Z-stack también pueden ser adquiridas si es necesario.
7. Con la misma configuración, adquisición de imágenes de muestra sin etiquetar sólo incubada en MS ½ para determinar el nivel de Autofluorescencia (control de fondo de la fluorescencia como se describe en la sección 2).
8. Con la misma configuración, adquisición de imágenes para las muestras control negativo que se incubaron con nativos monolignols H/G para determinar adherencia inespecífica fluoróforo a la muestra.
9. Tratamiento de los datos se aplican a las imágenes adquiridas a restar fondo autofluorescence señales en tanto H/G control negativo y/g H_AZALK imágenes.

Resultados

Mediante el protocolo BLISS presentado con bioorthogonal y análogos sintéticos monolignol química click, es posible visualizar la dinámica del proceso de lignificación en plantas vivas. A diferencia de técnicas establecidas para lignina visualización (como histoquímicas tinción, inmunolocalización o autofluorescencia), esta 'doble clic' protocolo exclusivamente dirigida la lignina producida de novo durante la incorporación metabólica paso y se diferencia de la lignina preexistente de la muestra con la proyección de imagen celular triple-channel por microscopía de fluorescencia confocal (figura 3). H _AZ-unidades se detectan utilizando las longitudes de onda de excitación y emisión de la DBCO-PEG de₄-5/6-carboxyrhodamine 110 que específicamente se hace clic en funciones azida de incorporado H_AZ moléculas durante el paso SPAAC (λex 501 nm /λ_em 526 nm, canal verde), mientras que G_ALK-unidades del mismo modo se detectan en las longitudes de onda característica de la sonda de azidefluor 545 que específicamente se hace clic en las etiquetas del alquino terminal incorporado de G _ALK durante el paso de CuAAC (λex 546 nm /λ_em 565 nm, rojo canal); el tercer canal corresponde a lignina preexistente, que se detecta con su intrínseca autofluorescence a 405 nm (canal azul). Este enfoque conduce a la generación de mapas de localización tricolor de lignina en las paredes celulares que proporcionan información espacial precisa de la presencia o ausencia de maquinaria activa lignificación entre diferentes tejidos de un órgano (Figura 3A ), entre diferentes tipos de células dentro del tejido del mismo (figura 3B-C) y dentro de capas diferentes de la pared de la misma célula (figura 3D). En otras palabras, esta metodología nos permite resaltar y específicamente localizar los sitios de 'active' lignificación (H_AZ y G_ALK canales) por diferenciación de zonas donde la lignina se formó en una anterior etapa de desarrollo de las plantas (canal de Autofluorescencia). Además, la sensibilidad de la técnica se ha mejorado dramáticamente en comparación con autofluorescencia, y menor cantidad de lignina recién sintetizada puede ser detectada (figura 3B).

Figura 3: proyección de imagen de reporteros química monolignol incorporado en los tallos del lino. (A) la mitad de una sección transversal de un tallo de lino, imagen reconstruida hechos a mano. (B) primer plano de las primeras capas de diferenciación de xilema. Panel de la izquierda: autofluorescence de lignina (azul, 405 nm), el panel central: combinado autofluorescence de lignina (azul) y H_AZ de la fluorescencia (verde, 526 nm) canales, panel de la derecha: fusionado autofluorescence de lignina (azul) y G_ALK fluorescencia (rojo, 565 nm) canales. La flecha indica la primera pared celular marcada desde el cambium que ilustra el aumento de la sensibilidad de la dicha en comparación con autofluorescencia. (C) etiquetado en celda diferente tipos de xilema secundario y (D) de cerca en las células de xilema secundario que ilustra las variaciones Etiquetadoras en diferentes capas de la pared celular mismo. Panel de la izquierda: combinado autofluorescence de lignina (azul) y H_AZ de la fluorescencia (verde, 526 nm) canales, panel central: fusionado autofluorescence de lignina (azul) y fluorescencia G_ALK (565 rojo, nm) canales, derecho panel: combinado autofluorescence de lignina (azul), H_AZ (verde) y los canales de fluorescencia G_ALK (rojo). H_AZ y G_ALK co-localización es representado en amarillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estrategias de reportero químico como el método de BLISS presentado aquí o los procedimientos de etiquetado individual previamente publicados por Tobimatsu et al. ⁸ por lo tanto puede permitir un estudio mucho más fino que los métodos previamente accesibles como inmuno - tinción histoquímica siendo muy sencillo de implementar. Por ejemplo, la figura 4 muestra que la intensidad de la señal de H_AZGincorporación de_ALK en fibras traqueidas/vasos (FT) del lino xilema secundario es muy alta en las primera algunas paredes celular del cambium, pero disminuye progresivamente en las células más viejas. Este perfil es contraria a la de la autofluorescencia e indica que lignificación máxima se alcanza muy rápidamente en las capas primeras dos a tres pies de cambium. En cambio, células de los radios (R) parecen seguir lignificación hasta mucho más tarde de su desarrollo como H_AZG_ALK incorporación es mucho más constante en las paredes de todas las células del cambium de la corteza. No es sorprendente que FT y R tipos de células muestran dinámica contrastada lignificación, puesto que estos tipos celulares tienen diferentes funciones biológicas asociadas diferencias en su programa de desarrollo. FTs son tubos hecho alargados que maduran y mueren rápidamente, deja células muertas vacías con paredes lignificadas gruesas que desempeñan un papel esencial en el soporte mecánico y transporte vertical de agua y minerales, mientras que las estrechas filas de R las células componen el xilema los rayos están vivos en su estado maduro y funcional sin necesidad de paredes lignificadas gruesas.

Figura 4: incorporación de reportero de monolignol celular específica en el xilema lino. Vista de microscopía confocal de campo brillante (A) de parte de un corte transversal a mano alzada de un tallo de lino. Rosa (células de parénquima de ray, R) y amarillo (celulas traqueaba fibra FT) las flechas indican vectores que abarca desde la zona de cambium hacia la médula y se analiza para la autofluorescencia de la lignina a 405 nm (B), H_AZ fluorescencia a 526 nm (C) y G _ALK fluorescencia en 565 nm (D). (E) vista del xilema secundario. Panel de la izquierda: combina canales de fluorescencia (roja) de Autofluorescencia (azul), H_AZ (verde) y G_ALK de lignina. H_AZ y G_ALK co-localización es representado en amarillo. Panel de la derecha: ilustración esquemática de la estructura del xilema secundario en tallo lino. V, buque; FT, traqueaba fibra; R, células de parénquima de ray. Esta figura ha sido modificada desde León et al. ²³ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además, el uso de dos distintos reporteros química correspondiente a H y G-unidades con dos reacciones de bioorthogonal en el protocolo de dicha permite más resultados cuantitativos obtenidos. Multiplexado de etiquetado estrategias tales como BLISS podría proporcionar perspectivas adicionales sobre el control de monolignol cocientes de la incorporación en condiciones diferentes y podría contribuir a descifrar el proceso de lignificación esquivo. Si los porcentajes relativos de H, G y S monolignols en ligninas de hecho son muy variables según la especie, tejido, edad o condiciones ambientales de la planta, los intrincados mecanismos que regulan esta composición son aún no totalmente comprendidos. La tecnología de etiquetado dual representa una poderosa manera de investigar algunos de los parámetros que regulan la composición de la lignina. Por ejemplo, variando la H_AZ: G_ALK relación con BLISS nos permitió demostrar que la composición de la lignina en los tejidos del xilema secundario es depende directamente de la disponibilidad de monolignol dentro de las paredes celulares, en lugar de especificidad de peroxidasa/Lacasa (figura 5).

Figura 5: Efecto de la incubación de secciones de tallo de lino con diferentes porcentajes proporciones de H_AZ y G_ALK. H_AZ: G_ALK% relaciones se dan por encima de cada columna de cifras. Arriba: combinan canales H_AZ y G_ALK . Abajo: histogramas que indica intensidad de fluorescencia media de H_AZ y G_ALK para las proporciones de diferentes %. Los valores se expresan como la media de la intensidad de fluorescencia media en niveles de gris escala de SD. de la barra = 100 μm. esta figura ha sido modificada desde León et al. ²³ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Lino se cultiva por sus fibras de líber (BF) que se utilizan para la fabricación de textiles, artículos de lujo o materiales compuestos ecológicos. Un aspecto importante de su valorización industrial es que contienen niveles muy bajos de lignina en sus paredes celulares, que se caracterizan por un S2/G extremadamente gruesa capa secundaria^19,24. BLISS puede resaltar las diferencias de dinámica de lignificación entre las diferentes capas de la pared celular mismo. La figura 6A muestra que H_AZ y G_ALK la incorporación de reportero se limita a las esquinas de celular y laminilla media primario pared de célula de las fibras de líber de algunos pero no todos. La ausencia total de lignificación en la capa de la pared celular secundaria gruesa fibra de estopa incluso cuando reporteros química monolignol exógeno suministrado revela que su estado de hypolignified surge de la ausencia de un entorno molecular adecuado para oxidación enzimático mediada y de monolignols incorporación a una cadena creciente del polímero, y que no es sólo debido a la regulación transcripcional de los genes de biosíntesis de monolignol previamente reportaron²⁵. Esta observación también correlaciona bien con el hecho de lino peroxidasa genes para arriba-se regulación en los tejidos del tallo exterior del químico lino lbf1 mutante que posee fibras lignificadas de bast²⁶.

Figura 6: BLISS destaca diferencias específicas de la subestructura o la capa de la pared celular. (A) panel de la izquierda: imagen de campo claro de una sección de tallo de lino. El círculo indica un haz de fibras. Panel derecho: cerrar en fibras de líber. Combina canales H_AZ y G_ALK (con y sin campo brillante) mostrando que lignificación se limita a las esquinas de la célula () y laminilla media primario pared de célula de algunas fibras de líber. BF, fibra de la estopa; Par, células de parénquima; M, laminilla media; P, pared de célula primaria; S1, la primera capa de la pared celular secundaria; S2/G, secundaria capa/gelatinoso capa de la pared celular secundaria. Corte 2D (B) y reconstrucción 3D de zoom z-pila confocal de la región de la endodermis de la raíz lino. La banda de Caspary () sólo muestra Autofluorescencia y no incorporar H_AZ o G_ALK. El fluorogram asociado muestra una GALK/h_AZ la correlación: alta fluorescencia verde se asocia a baja señal roja (corteza) y viceversa (endodermis). Periciclo (P), Endodermis (E), Cortex (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por último, esta metodología dos colores también puede proporcionar información valiosa sobre el 'estado de lignificación' de subestructuras de la pared celular en las distintas etapas del desarrollo y en órganos de la planta que no sea la madre. Por ejemplo, el endodermis de las raíces de lino se caracteriza por la existencia de una banda de Caspary en sus paredes celulares transversales y radiales durante las primeras etapas de desarrollo. Esta banda de biopolímero hidrofóbica, de suberina y lignina, evita que el agua y solutos por la raíz entren pasivamente a través del apoplasto y les obliga a pasar a través de la membrana del plasma vía simplástica contribuyendo así a la capacidad de absorción selectiva de raíces de la planta. Cuando se aplica a las raíces de lino, nuestra estrategia demostró que H_AZ y G_ALK sean incorporadas en las paredes tangenciales de las células endodermales, así como en partes de las paredes radiales donde la banda de Caspary es ausente (Figura 6B). Sin embargo, la ausencia total de monolignol incorporación de reportero en la banda de Caspary sí mismo indica que es madura en esta etapa del desarrollo mientras que las otras paredes son todavía el sitio de deposición del biopolímero más. La vista 3D reconstruida de una pila de z claramente saca la banda de Caspary a la luz. Curiosamente, las paredes de algunas células corticales adyacentes al endodermis también demostró ser capaces de incorporar H_AZ preferencial (lo que indica la presencia de lignina/suberina en la corteza de la raíz lino) pero no G_ALK. Análisis de colocalización demostraron una correlación contra entre H_AZ y G_ALK, que sugieren la existencia de maquinaria enzimática/estructura pared celular específica en estos dos tipos de células adyacentes.

Suplemento tabla 1: preparación del medio sólido de MS ½ Haga clic aquí para descargar este archivo.

Suplemento tabla 2: preparación de soluciones stock de reportero químico Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Como se mencionó anteriormente, el protocolo de dicha etiquetado doble presentado en este documento es uno de los primeros ejemplos de una combinación SPAAC/CuAAC en vivo^12,23. Cada paso fue completamente optimizado y validado, y es muy importante que se respete el orden en que los dos haga clic en química reacciones Etiquetadoras se realizan secuencialmente (es decir, SPAAC primero, seguido por CuAAC). Todos los controles de Cruz-demostraron que cada paso etiquetado específico cuando el protocolo BLISS es aplicada²³ : primero llevar a cabo el paso SPAAC conduce a la altamente estereoselectiva de H_AZ azida funciones el fluoróforo cyclooctyne funcionalizados mediante una reacción de cicloadición [3 + 2] con cinética rápida. Una vez que se han etiquetado H_AZ unidades, puede realizar el paso CuAAC requiere activación de cobre (i) catalizada de G_ALK alquinos terminales para generar enlaces de triazol por reacción con la sonda 545 azida-fluor. En contraste, el orden inverso (es decir, CuAAC en primer lugar, seguido de SPAAC) no debe utilizarse ya que conduce a la unidad G_ALK y H_AZ Cruz-acoplamiento, que compite con el fluoróforo ligadura e induce una pérdida dramática de la señal . También es importante hacer hincapié en la necesidad de los pasos de lavado intermedio para evitar la tinción inespecífica.

Hemos demostrado que nuestro método puede aplicarse a varios diseños de experimento biológico. La dicha etiqueta protocolo primero fue aplicada a cortes transversales a mano alzada de tallos de lino (aproximadamente 150-250 μm de espesor) que previamente se corte y se incubaron con el monolignols haga clic en listo. Aunque este diseño tiene la ventaja de minimizar las cantidades necesarias de reportero químico (como se reducen los volúmenes de incubación) y de facilitar la producción de estadística se replica, no es, estrictamente hablando, un sistema en vivo y en algunos casos, puede no reflejar todos los aspectos de la dinámica espacio-temporal real lignificación. En un segundo diseño experimental, por lo tanto adaptamos el protocolo de felicidad a un método que fue utilizado previamente para estudiar la incorporación de monolignols radiomarcado en pino y gingko²⁷. En este enfoque, las raíces y el tallo de la planta están físicamente separados y la base del tallo entero se incuba en la solución de monolignol en lo que puede ser llamado el enfoque 'florero'. Después de dejar los tallos el tiempo deseado (incubación), secciones transversales son corte y el protocolo de BLISS realizada. Esto nos permitió mostrar (i) que el monolignols modificados son transportados a través de la espiga de la vida y se incorporan en el crecimiento de polímeros de lignina en las paredes celulares y (ii) que el patrón de localización era esencialmente idéntico a la de la sección transversal enfoque. Este tipo de experimento tiene el mérito de ser realizada en una planta de la vida real / células vivas acercamiento permitiendo más experimentos y estudios más exhaustivos, pero requiere mayores cantidades de reportero químico. Finalmente, el protocolo de felicidad también se usó con plántulas de la planta del lino, que representan un verdadero modelo de planta en la que los reporteros química deben ser absorbidos por las raíces antes de ser transportados hasta la madre de vivir. Mientras que este modelo tiene la clara ventaja de ser realizada en plantas vivas, en la práctica, se limita a las plántulas jóvenes y no es realmente adecuado para investigar la dinámica de la lignificación en plantas más viejas por razones prácticas (tiempo de incubación largo, elevado cantidad de reporteros química). Sin embargo, estos diseños de tres experimento son complementarios y todos tienen sus pros y contras con respecto a los aspectos prácticos y significación biológica dependiendo del tipo de cuestión biológica a ser contestadas.

Desarrollado para estudiar la dinámica de la lignificación en lino, nuestro protocolo es altamente adaptable, no sólo en términos de diseño de experimento biológico, sino también en cuanto a su aplicación a otras plantas de especies y órganos/tejidos. Por ejemplo, felicidad puede ser fácilmente transferida a la Arabidopsis o los géneros Populus que son más susceptibles a los estudios con mutantes knock-out o knock-down para varios genes. En principio, estudios de etiquetado doble con nuestro enfoque pueden extenderse también a otras biomoléculas mediante el uso de dos distintos precursores modificadas de polímeros de pared celular de plantas - incluyendo todos tres monolignols principal o sus precursores metabólicos así como varios monosacáridos que constituyen la matriz de polisacárido. Desde sus inicios, bioorthogonal química de hecho fue principalmente desarrollado para investigar glycans/polisacáridos a oligosacáridos metabólica Ingeniería (MOE)^4,5,17,28, Pero sorprendentemente ha habido solamente muy pocas aplicaciones a biología de la planta hasta^{7,8,9,10,11,12}. En cuanto a la compatibilidad de las reacciones, el estudio de la lignina fue de hecho un caso complejo para resolver como dos reporteros químicos se incorporan en el mismo polímero reticulado. La posibilidad de H_AZ-G_ALK reticulación formación era el principal problema a superar debido a la proximidad espacial de G_ALK y H_AZ unidades dentro de la 3D estructura de lignina²³, una limitación que no puede estar presente si no se incorporan los dos reporteros de químicos en el mismo tipo de biopolímero o en la misma región espacial de cualquier célula dada.

En un ámbito más amplio la dicha metodología esencialmente podría aplicarse a cualquier estudio de imágenes de fluorescencia de dos colores en modelos animales o bacterianos utilizando dos reporteros química distintos teniendo una azida y etiqueta del alquino terminal, respectivamente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(E)-4-(3-(2-(2-2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)prop-1-en-1-il)fenol (HAZ)			Sintetizado como en Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
>(E)-4-hidroxi-3-propargiloxicinamil alcohol (GALK)			Sintetizado como en Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
2% hipoclorito
sodio 20 cm de alto tubo
250 mL Botella
de 48 pocillos Placa
5/6-TAMRA-PEG3-Azide	Jena Bioscience	CLK-AZ109-1
Papel
Gasa
Compost que contiene arcilla
Alcohol de coniferílico (G)	Sigma Aldrich	MFCD00002922
Sulfato de cobre (II) pentahidratado
DBCO-PEG4-5/6-Carboxirodamina 110	Jena Bioscience	CLK-A127-1
Milli-Q Agua
Eppendorf 1,5 mL
EtOH
lino (L. usitatissimum L.)
Fluoromount-G™ Montaje de portaobjetos Medio	Microscopía Electrónica Sciences	17984-25
Cubreobjetos
Portaobjetos
Cámara de crecimiento	CLF-Plant Climatics		Para el cultivo de plantas de 2 semanas de edad
Cámara de crecimiento	Angelantoni Life Sciences		Para el cultivo de plantas de 2 meses
Planta magenta caja			de cultivo Para el cultivo de plántulas de 2 semanas de edad
Metanol			tóxico (SGH02, SGH06, SGH08), trabaje con guantes debajo de una capucha
Micropipeta
Esmalte
Nikon A1R Microscopio confocal	Nikon
p-Alcohol cimario (H)	Carbosynth	FC145653
Tapa
Pipeta
Maceta			Para el cultivo de plantas de 2 meses
Hoja de
Banda		elástica
Ascorbato
Pinza estéril Soporte
Vórtice
Reactivos para líquidos y sólidos ½ MS medio
KH2PO4
KNO3
NH4NO3
MgSO4.7H2O
CaCl 2.2H2O
MnSO4. H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO< sub>4.5H2O
CoCl2.6H2O
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
Tiamina.HCl
Piridoxina.HCl
Glicina
Ácido
Mio-inositol
Sacarosa
MES hidrato
Agar