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Visualizar leucocitos del balanceo y adherencia en angiotensina II-infundido ratones: técnicas y trampas

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DOI:

10.3791/56948

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4 de enero de 2018

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1Center for Thrombosis and Hemostasis Mainz, University Medical Center Mainz, 2Center for Cardiology, University Medical Center Mainz, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe el uso de ratones transgénicos reportero y vías de administración diferentes de colorantes fluorescentes en angiotensina II-hipertensión inducida por usando microscopia intravital video de vasos sanguíneos para evaluar la activación de células inmunes y sus capacidad de rollo y se adhieren al endotelio.

Resumen

Intravital video microscopía de epifluorescencia (IVM) de los vasos sanguíneos es un método establecido para evaluar la activación de células inmunes y su capacidad de papel y se adhieren a la capa endotelial. Visualización de células circulantes por la inyección de colorantes fluorescentes o anticuerpos fluoróforo acoplado es de uso general. Alternativamente, pueden utilizarse ratones reportero fluorescente. Interacciones de los leucocitos, en particular lisozima M+ (LysM+) monocitos, con la pared vascular desempeñan un papel fundamental en la promoción de la disfunción vascular e hipertensión arterial. Aquí presentamos la técnica para visualizar y cuantificar leucocitos del balanceo y la adherencia en las arterias carótidas en angiotensina II (AngII)-inducida por la hipertensión en ratones por IVM.

La implantación de un catéter daña la pared vascular y conduce a respuestas alteradas del glóbulo. En comparación con técnicas de inyección diferentes y las rutas de administración para visualizar leucocitos en un LysMCre++ de IRG ratón con expresión condicional de la proteína verde fluorescente en LysM y generalizada expresión de proteína fluorescente roja + las células. Para estudiar la activación de la célula LysM+ , utilizamos AngII infundido ratones en que rolling y la adhesión de los leucocitos al endotelio se incrementa. Inyectamos o catéter usando una yugular naranja de acridina o directamente aunque la cola de la vena y en comparación con la cantidad de rolling y la adhesión de las células. Encontramos que la implantación de catéter yugular por sí aumentó el número de balanceo y adheridas células LysM+ en sham-infundieron LysMCre+ratones IRG+ comparados a los controles. Esta activación fue aumentada en los ratones AngII-infundido. Curiosamente, inyección de adhesión celular de acridina naranja directamente a través de la cola vena no aumentar LysM+ o balanceo en ratones sham-infundido. Así demostramos la importancia de los ratones transgénicos reportero expresando proteínas fluorescentes para no interferir con procesos en vivo durante la experimentación. Además, cola vena inyección de trazadores fluorescentes podría ser una posible alternativa a las inyecciones de catéter yugular.

Introducción

La hipertensión arterial aumenta el riesgo de enfermedad cardiovascular y muerte y promueve el desarrollo de la aterosclerosis, enfermedad coronaria y tromboembolismo arterial o venoso1. El desarrollo de hipertensión depende de la interacción de factores ambientales, genéticos, endocrinos y hemodinámicas. Actualmente, la inmunidad y la inflamación relacionados con son apreciados para jugar un papel importante en la etiología de la hipertensión arterial2.

Entre las células inmunes, los macrófagos y monocitos y linfocitos T fueron encontrados para ser causalmente implicados en inflamación vascular inducida por la AngII y la hipertensión, en la parte relacionada con su capacidad para desencadenar de especies reactivas de oxígeno3. Macrófago colonia-que estimulan factor deficientes ratones mostraron disminución en la respuesta a AngII sobre aumento de la presión arterial y la inflamación vascular4. En un trabajo anterior, podríamos mostrar que LysM + monocitos maneja disfunción vascular y la inflamación en la hipertensión inducida por AngII5. Más recientemente, hemos descrito una nueva vía en que la coagulación factor XI colabora con las plaquetas y la pared del vaso para inducir inflamación vascular dependiente de trombina6. El conocimiento actual sobre el papel del sistema inmunológico en la hipertensión arterial fue recientemente resumido y revisado por Rodriguez-Iturbe et al. 7

Puesto que la participación de las células inmunes en el desarrollo de la hipertensión arterial se hizo evidente, modelos y técnicas para el estudio de la interacción entre la nave y las células inmunes llegó a ser necesarias. Epifluorescence IVM de vasos sanguíneos es una herramienta útil para observar en vivo las interacciones entre la circulación de células de la sangre y el endotelio8,9,10. Con esta técnica, la inyección de colorantes intercalantes con ADN (tales como naranja de acridina) puede visualizar células nucleadas (circulación, así como desde el endotelio). Las plaquetas aisladas mancharon ex vivo con rhodamin - 6 G o Diclorofluoresceína (DCF) puede ser inyectado para visualizar el trombo rico en plaquetas en modelos de lesión arterial o venosa.

Por lo general, un catéter de la vena yugular se utiliza para inyectar trazadores o marcado las plaquetas. Alteración del endotelio y la subsiguiente activación de la cascada de la coagulación son conocidos efectos en la activación de monocitos. Lesión endotelial inmediatamente conduce a la activación plaquetaria a través de moléculas de matriz subendothelial para sellar el tejido, con la consiguiente monocito atracción y activación de11. Por el contrario, un endotelio intacto es conocido por tener propiedades anticoagulantes (por ejemplo, mediante tejido factor vía inhibidor o trombomodulina)12 y efectos inhibitorios directos sobre los monocitos, por ejemplo, a través de la secreción de vesículas extracelulares que contiene microRNA (s)13. Monocitos son conocidos por producir un factor del tejido fino, el activador extrínseco de la cascada de coagulación y expresados activado por proteasa receptores (PARs) que pueden ser activados por la trombina y participan en la activación de monocitos14,15 . Por lo tanto, cualquier activación de plaquetas o de la cascada de la coagulación debido a una lesión vascular puede tener efectos inesperados en la activación de monocitos e interferir en el fenómeno observado. Con la ayuda de IRG LysM Cre transgénicos ratones transgénicos, un ratón fluorescente doble de reportero Cre (LysMCre++de IRG), nos proponemos estudiar en detalle el efecto de las inyecciones con un catéter y alternativa en LysM+ células myelomonocytic en un modelo de ratón de la hipertensión arterial16.

Protocolo

Experimentos se realizaron en la edad de ratones machos 8 a 12 semanas de edad bajo la aprobación de la Comisión de ética de experimentación animal de Renania-Palatinado (número de autorización de 23 177-07/G12-1-002 y 23 177-07/G15-1-051).

1. anestesia y cirugía preparación del ratón

  1. Antes de la cirugía, verificar la buena salud y condición de los animales. Antes de la cirugía, seguimiento de animales una vez al día durante 2-3 días por su estado general (aspecto, postura, comportamiento espontáneo) y peso corporal, alimentos, consumo de agua.
  2. Preparación la mezcla principal para anestesia con midazolam (5 mg/kg de peso corporal), medetomidina (0.5 mg/kg de peso corporal) y fentanilo (0,05 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal (i.p.) inyectar 200 ratón μL/30 g en jeringa de 1 mL con una aguja de 26 G.
  3. Implantación de bomba osmótica y preparación de animales para experimentos IVM se realizan en un campo de operación con un 39 ° C calentamiento plataforma. Todas las herramientas en un baño de desinfección de esterilizar y para desinfectar la plataforma de calentamiento.
  4. Durante los procedimientos, proteger los ojos del animal con ungüento oftálmico. Quitar la piel con cuchillas de afeitar antes de la implantación de bomba osmótica. Usar hisopos de algodón y una crema de depilación para el aislamiento de carótidas y la implantación del catéter yugular en experimentos IVM. Desinfectar la piel de un animal mediante dos desinfectantes de la piel: un antiséptico y desinfectante con yodo povidona y una piel octenidine antiséptico que contiene en solución basada en alcohol.
  5. Preparar la mezcla principal para antagonizar la anestesia ("mix antisedan") con atipamezol (0,05 mg/kg de peso corporal) y el flumazenil (0,01 mg/kgbody peso) y preparar 200 μL/ratón en jeringa de 1 mL con una aguja de 26 G que por vía subcutánea (s.c.) inyectado.

2. implantación y preparación de la bomba osmótico

Nota: La infusión subcutánea de AngII usando una bomba osmótica fue descrita en detalle por Lu et al. 17

  1. Preparar la AngII por reconstituir el liofilizado con solución salina estéril y ajustar la concentración con el peso de los animales y el caudal de la bomba. Mantenga la AngII reconstituido en tubos de plástico (no usar tubos de vidrio).
  2. Llene las bombas con la solución de AngII para entregar 1 mg/(kg·d) por 7 días. Después de la preparación, mantener las bombas en solución salina estéril para 4-6 h mínimo a 37 ° C.
  3. Prueba de la anestesia completa del ratón después de la inyección de la mezcla de anestesia con posterior reflejos del pie y coloque en el campo de operación caliente. Inducción de la anestesia tarda 10-15 minutos y funciona mejor si los animales son colocados en un ambiente oscuro.
  4. Afeitarse la parte trasera del ratón inferior y desinfectar con una antiséptico la piel alcohólica.
  5. Haga una incisión de 1 cm perpendicular a la espina dorsal con unas tijeras. Crear un bolsillo para la bomba con una pinza hemostática estrecha e insertar la bomba (flujo moderador primero). El bolsillo debe permitir el movimiento libre de la bomba sin presión sobre la herida.
  6. Cerrar la herida con suturas y no clips, para limitar la inflamación; luego desinfectar con antiséptico la piel.
  7. Antagonizar la anestesia por inyección s.c. de 200 μL de la mezcla de antisedan y retomar el ratón de su jaula.
  8. Realizar analgesia postoperatoria con buprenorfina (0,075 mg/kg s.c.) una vez después de la cirugía y en la demanda según el comportamiento de los animales.

3. implantación de catéter yugulares y carótidas preparación

  1. Prueba de la anestesia completa del ratón después de la inyección de la anestesia se mezclan con reflejos de alimentación posterior y colocar el animal anestesiado en postración dorsal en la placa quirúrgica de 39 ° C con una sonda rectal con el fin de mantener la temperatura y poner el ungüento sobre los ojos para protegerlos durante el procedimiento.
  2. Quite los pelos del cuello con la crema depilatoria. Utilice un hisopo de algodón y frotar la crema por 2 minutos hasta que los pelos empiezan a caer. Después de un adicional 2 minutos, retire la crema y los pelos con una espátula y desinfectar la piel con una antiséptico la piel alcohólica.
  3. Realizar la cirugía bajo un estereomicroscopio. Hacer una incisión de 1-1.5 cm de largo en la piel longitudinalmente en la nuca, 1 cm al lado de la tráquea. Luego realizar dos otras incisiones perpendicular a ambas extremidades de las incisiones de la primera.
  4. Retirar los tejidos la piel cuidadosamente y retire el pedazo de piel que cubre la izquierda de la vena yugular y la tráquea.
  5. Aislar cuidadosamente la glándula parótida; glándulas sublinguales y submaxilares de la zona de interés con 2 pinzas curvas. No cortar o dañar las glándulas, lugar para permitir el mejor acceso a la vena yugular y a las carótidas.
  6. Para aislar la vena yugular, usar pinzas finas y lentamente abrir y cerrarlo para liberar suavemente el vaso de los tejidos circundantes. Una vez que la vena esté completamente limpia, coloque la pinza debajo de la embarcación y dos suturas 7-0 de 10 cm debajo de él.
  7. Cerca de la sutura proximal a la cabeza con dos nudos. En la otra sutura, preparar un nudo pero no la cierre.
  8. Mantenga el catéter (0,28 mm diámetro, diámetro externo de 0,61 mm interior) llenado de 37 ° C solución salina estéril con pinza de un lado; mientras con la otra mano, haga una pequeña incisión en el recipiente con una tijera fina o una aguja de 26 G curvado. Luego inserte el catéter en la vena yugular y cierre el nudo dos veces. Cerca de la sutura proximal a la cabeza sobre el catéter para asegurar la inmovilización completa.
  9. Para aislar y preparar las arterias carótidas, disecar el área que cubre la tráquea usando fórceps curvo fino.
  10. Una vez libres de los tejidos circundantes los carotids, quitar el nervio de nervio vago (se ve como una línea blanca junto a la carótida) del recipiente (pero no la corte). El fórceps fino puede ser cerrado y abrió lentamente para movilizar suavemente el nervio.
  11. Una vez que ambas arterias son completamente limpios, coloque la pinza debajo de la primera arteria carótida y un trozo plástico pequeño negro 3 mm ancho x 2,5 cm longitud bajo el buque. Es muy importante no sobrecargar el recipiente y comprobar que el flujo de sangre está presente una vez que se coloca el soporte del recipiente. Coloque la segunda arteria sobre el titular del buque. Si el ratón no se coloca directamente bajo el microscopio, vuelva a colocar las glándulas sobre la tráquea y aplicar solución salina estéril de 37 ° C para evitar la sequedad de la zona.

4. evaluación de Rolling y la adhesión de leucocitos / LysM + células con IVM

  1. Preparación de una solución 2 mg/mL almacenada a-20 ° C naranja de acridina y diluirlo 1:4 en solución salina estéril (concentración final de 0,5 mg/mL) en jeringa de 1 mL.
Proteger la jeringa de la luz y utilizar 200 μL por un ratón.
  1. Diferentes condiciones de prueba: (1) inyección de acridina naranja con el catéter yugular; (2) inyección de naranja de acridina directamente en la vena lateral de la cola (con esta condición que no se implantó catéter yugular); (3) medición sin ratones utilizando la fluorescencia LysMCre++ de IRG naranja de acridina (aquí de nuevo no se implantó catéter yugular).
  • Una vez que el catéter está en el lugar y las dos carótidas están aislados, coloque el ratón en el microscopio. Realizar mediciones con un microscopio de fluorescencia de campo amplio alta velocidad usando un condensador de larga distancia y una 10 X (NA 0.3) objetivo de inmersión de agua con un monocromador, un divisor de haz y una cámara de dispositivo de carga acoplada. Realizar análisis con sistema de proyección de imagen en tiempo real y adquisición de la imagen.
  • Enfocar el objetivo del microscopio en el centro de la arteria carótida en la superficie del endotelio. Lentamente inyectar 50 μl de naranja de acridina (0.5 mg/mL) (tomar en cuenta el volumen muerto del catéter para la primera inyección). Configure el software para grabación de 100 imágenes con un tiempo de exposición de 120 milisegundos por imagen.
  • Hacer cuatro videos por la arteria carótida (izquierda y derecha) en diversas localizaciones en la arteria para cada vídeo. Si la señal de fluorescencia disminuye, inyectar otro 50 μl de naranja de acridina.
  • Después de grabar todos los videos eutanasia a los animales por dislocación cervical.
  • Ajustar la velocidad del video en 10 imágenes por segundo y cuantificar las células balanceo y adherentes μm 200 μm x 250 rectángulo vistas en medio de la embarcación para cada vídeo. Contar las células adherentes y ondulantes; las células adherentes se definen como células que no mueva ni desprenderse del endotelio dentro de los 10 s de vídeo. Para simplificar la cuantificación, quitar el canal con la fluorescencia roja y use sólo la fluorescencia verde para contar las células adherentes y ondulantes.
  • Para los experimentos utilizando naranja de acridina, hacer un umbral manual de la fluorescencia para quitar fondo de las células endoteliales.

    • Resultados

    Carótidas de LysMCre++ de IRG ratones con AngII observaron con IVM. Naranja de acridina se inyectó un catéter yugular. El objetivo fue observar la proporción de células LysM+ en contacto con la pared vascular en comparación con todas las células circulantes nucleadas (que también podrían interactuar con el vaso puesto que la discriminación del tipo de la célula interactuar con el recipiente seguía abierto pregunta de nuestro trabajo anterior). Al inicio, la presencia de un catéter yugular provoca adherencia de células LysM+ (figura 2A, D). Después de la inyección de naranja de acridina, las mismas células fluorescentes, pero también las células endoteliales fluorescentes (figura 2B, E). Después de la reducción del fondo para limitar endotelial relacionado con fluorescencia, los datos indican que todas las células nucleadas adherentes son LysM+ (figura 2, F); Estos resultados ser verdaderos después de la infusión de AngII confirma nuestros resultados anteriores y demostrar que el LysMCre++ del IRG es un buen modelo para observar el efecto de la AngII de activación de la célula LysM+ .

    Se evaluó el papel de vías de administración de acridina naranja en LysM+ la activación de la célula después de la infusión de AngII en LysMCre++de IRG. Después de una semana de la infusión de la AngII, interacciones de leucocito endotelio en arterias carótidas de LysMCre++ de IRG ratones fueron reflejados y visualizados por IVM con o sin inyección de naranja de acridina través de un catéter yugular o la vena de la cola. Sin catéter o inyección, balanceo de células LysM+ fue aumentado después de infusión de AngII comparada con ratones no tratados y adherencia mostró un aumento (figura 3). Inyección de acridina naranja con una adherencia del catéter yugular aumentado y rodando en AngII trata ratones en mayor medida en comparación con los ratones sin un catéter (figura 3). Inyección en la vena de la cola naranja de acridina conduce a adherencia similar y balanceo en comparación con los ratones que no recibieron la inyección de naranja de acridina (figura 3).

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    Figura 1. Esquema para la infusión de angiotensina II y evaluación de LysM+ células de rolling y la adhesión en ratones. LysMCre++ de IRG ratones fueron infundidos 7 días con AngII y adhiere como rodante LysM+ las células sobre las carótidas se cuantificaron con o sin inyección de acridina naranja a través de un catéter yugular o vena de la cola inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Figura 2. Evaluación de adherencia de célula LysM+ y balanceo en arterias carótidas de LysMCre+ratones IRG+ . Adherencia de LysM+ células en LysMCre+ratones IRG+ antes (A, D) y después de la inyección de acridina (B, E) a través de un catéter yugular. Fluorescencia roja y verde se registraron, se veían LysM+ las células (en verde) y las células musculares lisas (en rojo). Después de la inyección de naranja de acridina, las células endoteliales también son visibles en verde pero quitando la fluorescencia del fondo permite circular única nucleadas visualización celular (C, F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Figura 3. Evaluación de rutas de la administración de colorantes fluorescentes en angiotensina II había infundido LysMCre+ratones IRG+ . Cuantificación de balanceo (A) y adhesión (B) LysM+ células en simulado operado o animales AngII-infundido con o sin inyección de naranja de acridina usando un catéter yugular o por inyección en la vena la cola. Cuadros representativos de las diferentes condiciones (C). Los resultados son la media ± error estándar de la media. realizó 2-way ANOVA y prueba post hoc de Bonferroni, n = 3-12 y grupos; p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Discusión

    LysM+ monocitos fueron demostrados previamente para estar implicado en el desarrollo de hipertensión arterial5. Aquí demostramos que las células inmunes LysM+ el rodillo y se adhieren a la capa endotelial en respuesta a la infusión de la AngII. Este hallazgo se obtuvo utilizando LysMCre++ de IRG ratones de nuestros estudios anteriores explorando el papel de las células inmunes en hipertensión en vivo visualizando leucocitos con inyección de naranja de acridina6,10. Así, la discriminación de tipos de células adheridas al endotelio no fue posible.

    El IVM es una herramienta muy útil para estudios vasculares y observaciones en vivo de las células directamente en el sistema vascular, pero el impacto de la inyección de colorantes con la ayuda de un catéter insertado quirúrgicamente en el contexto inflamatorio de la hipertensión sigue siendo desconocido. Para evaluar el efecto potencial de catéter y naranja de acridina inyección aprovechamos la LysMCre+ratones IRG+ . AngII infusión aumentó el número de balanceo LysM+ las células al endotelio. Inserción de un catéter en la vena yugular había amplificado el efecto y más balanceo y adhesión de leucocitos fueron detectados en ratones AngII-infundido instrumentados con un catéter en comparación con ratones sin catéter implantes. Esto indica que la implantación de una causas de catéter carotídeo una reacción inflamatoria sistémica en el contexto de la cicatrización recubrimientos con la reacción inmune en hipertensión arterial18. Además, debido a la proximidad de la vena yugular a la arteria carótida una activación inmune adicional podría haberse producido por que afectan a la vena yugular. Puesto que este efecto no estaba presente cuando las inyecciones se realizaron directamente en la vena de la cola, podemos suponer que el efecto era debido no al tinte pero el procedimiento de insertar el catéter. Aquí demostramos la importancia de los ratones transgénicos reportero expresando proteínas fluorescentes para no interferir con procesos en vivo durante la experimentación. Además, cola vena inyección de trazadores fluorescentes podría ser una posible alternativa a las inyecciones de catéter yugular.

    Un paso fundamental del procedimiento es la infusión de la AngII. Cola del pun ¢ o evaluación de la presión arterial se puede hacer para controlar la eficacia de la AngII entrega la bomba. Debe aumentar la presión arterial después de 2−3 días de infusión. Para limitar la inflamación que podría influir en la activación de las células LysM+ , cierre de la incisión donde se implanta la bomba debe hacerse con suturas en vez de clips. Debe señalarse una limitación sobre la inyección de la vena de la cola: para hacer la mejor adquisición de datos, 4 videos se toman generalmente para cada carótida. Si disminuye la señal fluorescente, se inyectan 50 μl de naranja de acridina pero con inyección de cola es más difícil hacer varias inyecciones y para mantener las carótidas estable bajo el objetivo del microscopio. La duración de la presencia de un catéter en la vena yugular también puede modular la activación de células inmunes ya que afecta a la activación de la coagulación en plasma rico en plaquetas preparado 4 h después de la implantación de catéter19. Este aspecto de la implantación de catéter necesita la posterior investigación.

    Por último, aun si apreciar el impacto de la implantación del catéter yugular en LysM+ la activación de la célula después de la infusión de la AngII, no podemos completamente estimamos que el papel de la preparación, remoción de piel y carótida aislamiento en una celda potencial de LysM+ activación. Concluimos que el uso de ratones de reportero de fluorescencia como el LysMCre++ de IRG ratón se recomienda para evitar la interrupción de la integridad del buque durante la preparación de animales para la proyección de imagen en vivo .

    Divulgaciones

    Los autores no tienen nada que revelar

    Agradecimientos

    Este trabajo fue apoyado por el Ministerio alemán de educación e investigación (BMBF 01EO1003 y 01EO1503 BMBF).

    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    MidazolamRatiopharm GmbHMezcla de anestesia
    MedetomidinaPfizer Deutschland GmbHMezcla de anestesia
    FentaniloJanssen-Cilag GmbHMezcla de anestesia
    AlzaneZoetisMezcla de antisedán
    FlumazenilHikma pharmaMezcla de antisedán
    BraunolB Braun
    OctenidermSchü lke
    Bombas osmóticasAlzet1007DImplante de bomba osmótica
    Angiotensina IISigma-AldrichImplante de bomba osmótica
    7-0 sutura de proleneEthiconImplante de bomba osmótica
    Naranja de acridinaCatéter Sigma-Aldrich
    Smiths Medical Deutschland GmbHDiámetro interior, 0,28 mm; diámetro exterior, 0,61 mm
    MicroscopioOlympusBX51WI Microscopio
    Beam SplitterFotometríaCMR-DV2-SYS - Objetivo DualView2 MicroImager
    OlympusUMPLFLN10XObjetivo de inmersión en agua con un monocromador
    CámaraHamamatsu PhotonicsORCA-R2
    Adquisición y análisis de imágenes software:OlympusRealtime Imaging System, eXcellence RT
    Ratones, The Jackson Laboratory, Jax 008705B6. Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J
    RatonesEl Laboratorio JacksonJax 004781LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )
    de fluorescencia, ,

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    Etiquetas

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