En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

La comunicación neuronal se basa en la liberación del neurotransmisor, que se produce a través de la fusión regulada de neurotransmisor que contienen vesículas sinápticas con la membrana plasmática¹. Este proceso llamado exocitosis^2,3,4,5,6 es altamente dinámico y puede ser regulado de arriba o abajo según las fluctuaciones de la tasa de estimulación⁷. Las proteínas implicadas en estos procesos están sujetos a movimiento browniano y por lo tanto Mostrar nanoscópicas organización capaz de sostener una serie de enlace acciones que apuntalan estas funciones fisiológicas. Las proteínas de la membrana plasmática son altamente dinámicas, permitiendo captura lateral de las moléculas en nanoclusters en la membrana del plasma^{7,8,9,10,11, 12}. Por lo tanto, investigar la movilidad de estas proteínas ayuda a aclarar su modo de acción⁸. Proteínas sinápticas como las N-etilmaleimida sensible factor accesorio proteínas receptores solubles (trampas), por ejemplo sintaxina-1A, ahora se sabe que exhiben movilidad lateral rápido, así como la lateral reventado dentro de nanoclusters que pueden servir como molecular depósitos y sitios de vesícula fusión^9,13,14,15.

El desarrollo reciente de las proteínas fluorescentes photoconvertible, como monómero (m) Eos^16,17 y¹⁸de Kaede, ha permitido la resolución nanoscópicas de proteínas de la membrana plasmática neuronal mediante el uso de enfoques tan como microscopía de localización foto-activado (PALM) y estocástico reconstrucción óptica microscopia (tormenta)^14,15,19. Estos desarrollos han permitido que las investigaciones sobre la movilidad y la nanoclustering de proteínas biológicas en células vivas cultivadas y las neuronas. Más recientemente, han se han realizado estudios para aclarar (en altas resoluciones similares) la dinámica y organización de estas proteínas de membrana en las neuronas de organismos vivos intactos tal Mus musculus, Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster^14,20,21,22.

Investigación de la dinámica y organización de una proteína en vivo requiere no sólo el uso de las herramientas de imagen resolución súper desarrollados recientemente (tales como fluoróforos Palma, tormenta y photoconvertible), pero también la capacidad para superar obstáculos tales como la accesibilidad de la proteína y la profundidad de penetración del láser de proyección de imagen. Imágenes de proteínas intracelulares en un animal intacto es inherentemente difícil como es la proyección de imagen proteínas en estructuras profundamente encajadas los tejidos vivos del animal intacto, como el hipocampo de un ratón intacto. Por lo tanto, más fácilmente se reflejada proteínas en o cerca de la superficie del tejido. Otra dificultad con la proyección de imagen en vivo es para garantizar la reproducibilidad a través de animales. Como la anatomía puede diferir de una muestra a otra, seleccionar una estructura con facilidad de replicación en diferentes muestras de animales intactas también podría desafiar. El uso de estructuras estereotipadas, tales como sinapsis, ayudar a superar algunas de estas dificultades.

Estudios recientes han reflejado movilidad de la proteína en los animales con una epidermis ópticamente transparente como Caenorhabditis elegans²², mientras que otras investigaciones han reflejado la organización de proteínas en la superficie de un tejido/órgano, por ejemplo proyección de imagen de actina en las neuronas corticales a través del cráneo de un ratón vivo²¹. En algunos casos, se han utilizado anestésicos para mantener el animal inmóvil; sin embargo, anestésicos específicos pueden afectar adversamente la proteína de interés. Medios alternativos para mantener animales inmóviles durante proyección de imagen en vivo por lo tanto deberían estudiarse para minimizar el error.

Otra advertencia a super-resolución imágenes en vivo es que el láser utilizado para iluminar las proteínas de interés que podía afectar el tejido circundante, y por lo tanto, mantener la intensidad de excitación tan bajo como sea posible se recomienda. Iluminación de los tejidos circundantes por el láser también tiende a aumentar la señal de fondo. El uso de la intensidad de excitación baja ayuda a reducir el fondo, la salvedad de que él también podría conducir a una disminución en el rendimiento de proteína fluorescente del fotón. Sustracción de fondo durante el análisis podría ser utilizado como una alternativa reducir la señal de fondo antes de análisis de imagen.

Drosophila presenta un organismo ideal para en vivo la proyección de imagen ya que proporciona herramientas genéticas bien establecidas para la investigación de la función de la proteína específica. La secuencia de activación ascendente (UAS)-sistema de Gal4 permite expresión temporal y espacial de las proteínas y por lo tanto puede utilizarse para manipular la neurotransmisión²³, que estimulación termo genético utilizando Drosophila transitoria Subfamilia potencial receptor A1 (dTRPA1)²⁴ o estimulación opto-genética usando far-rojos-cambiado de puesto CsChrimson²⁵ puede combinarse con la proyección de imagen¹⁴. Han superado muchas de las complicaciones de llevar a cabo en vivo imágenes de una sola molécula en este sistema y ahora describir cómo rastreo de partículas solo pueden realizarse en melanogaster del Drosophila larvas de tercer estadio.

1. diseño de transgénicos Drosophila expresando las proteínas con etiqueta mEos2

1. Seleccione la proteína a ser etiquetados con la proteína mEos2. Para aumentar la tasa de éxito de imagen, seleccione las proteínas con un dominio de transmembrana en la membrana plasmática neuronal¹⁴ (p. ej., sintaxina-1A), proteínas de vesículas sinápticas o autophagosomes^26,27 (p. ej., Synaptobrevin-2), o proteínas citosólicas con estrecha interacción con las proteínas de la membrana plasmática neuronal (por ejemplo, Munc18-1).
2. La construcción de los transgenes que codifican la proteína mEos2-la etiqueta (figura 1). Diseño de los cebadores para la proteína y mEos2 hacia adelantados y hacia atrás.
   Nota: La secuencia de codificación de mEos2 puede ampliarse desde el plásmido pmEos2-N1, que está diseñado para fundirse en el c-término de la proteína de interés. La clonación puede realizarse por ejemplo por la recombinación en vivo en Saccharomyces cerevisiae mediante el pFL44S-attB-MCS-w + vector de^14,28, alternativamente se podrían utilizar otros métodos de clonación como Gibson Protocolo de Asamblea²⁹.
   1. Alinear el vector con BamHI y XbaI y co se transforman en células de levadura ura3- junto con los fragmentos PCR codificación mEos2 y la proteína de interés. Inyectar la construcción para generar una línea de mosca transgénica³⁰embriones de Drosophila .
3. Posterior de las culturas mosca transgénicas en medio estándar de levadura y melaza o algunos otros sustituto adecuado contenidas en frascos de plástico. Para garantizar el sano y bastante grande de botones sinápticos³¹, evitar hacinamiento moscas en los frascos y tapa vuela a viales nuevos después de cada día de la puesta de huevos; de esta manera las larvas de tercer estadio se alimentan bien y alcanzan el tamaño adecuado en el momento en que comienzan vagando en el medio. Levantar la mosca transgénica a temperatura ambiente (25 ° C).
   Nota: Botones sinápticos más grandes tienden a producir mayor cantidad de proteínas visualizadas durante proyección de imagen.

2. disección de la Larva de tercer estadio

1. Hacer un ≤20 base cilíndrica o semicilíndrica forma polydimethylsiloxane (PDMS) mm de diámetro y ≤20 mm de altura usando un kit de elastómero de silicona adecuado (figura 2A). Mezcla de elastómero de silicón con una silicona de endurecimiento a agente a una relación de 10:1.
   1. Removemos la mezcla durante 5 minutos, verter la mezcla en un molde con los dimsensions mencionada. Dejar endurecer en el horno a 100 ° C por 45 min. La base PDMS servirá como la base sobre la que realizar la disección. Asegúrese que la base PDMS se en el pozo de una placa de cultivo con fondo de cristal.
2. Seleccione un errante tercera larva de estadio de la pared del frasco. Usar un microscopio estéreo óptico aumento 4.5 para visualizar la larva a la base cilíndrica de PDMS con el lado dorsal hacia arriba.
3. Curva y ángulo de pinzas palillo minutien alfileres en la cabeza sobre los ganchos de la boca, entre los dos extender espiráculos anteriores y en la cola durante el ano, entre los dos espiráculos posteriores. Agregar 40 μl de medio insectos de Schneider a temperatura ambiente sobre la larva inmovilizada.
   Nota: Hemolyph-como soluciones (HL3 o HL6) pueden usarse en lugar solución^{32,33 de Schneider}.
4. Acceso por el lado dorsal de la pared abdominal del cuerpo de la larva por el uso de un pin minutien para incidir en la línea media de la pared.
5. Uso muelle tijeras para cortar la pared del cuerpo se abren desde el punto de incisión. Corte a lo largo de la línea media en la dirección antero-posterior³⁴.
6. Usar pinzas finas y tijeras para desentrañar la larva del resorte: retirar los órganos internos, incluyendo las glándulas salivales, tráquea y el intestino. Lave la larva dos veces con medio insectos de Schneider.
7. Con pinzas finas, mantener las dos aletas de la pared del cuerpo, suavemente estira hacia fuera y pegar minutien pasadores a cada lado. Esto deberá producir una preparación en forma de hexágono (figura 2A).
8. Separar el cerebro de la cuerda ventral del nervio con unas tijeras de muelle para reducir la posibilidad de movimiento de los músculos durante la proyección de imagen; también sirve para mantener la preparación contra el plato de imagen. Utilice las pinzas curvas para empujar los seis pernos de minutien en la base PDMS.
   Nota: Sólo una pequeña porción de los pernos debe ser embebida dentro de la pared abdominal.
9. Para confirmar que la larva ha sobrevivido el procedimiento de disección, empujar ligeramente el cordón nervioso ventral, esto debe provocar una contracción peristáltica de la pared abdominal de la larva.

3. microscopía de rastreo de la solo-partícula iluminación ligeramente oblicua

1. Invertir la base disecada larva-PDMS en una placa de cultivo con fondo de cristal. Llene el plato de imagen con 2 mL de insectos medio temperatura ambiente Schneider (figura 2B).
2. Localizar las neuronas motoras en los segmentos segundo y terceros con sinapsis en los músculos abdominales 6 y 7³⁵ usando el x 63 / 1.2 objetivo de inmersión en agua de NA en un microscopio de fluorescencia (TIRF) fluorescente reflexión interna total.
3. Usar los oculares del microscopio para localizar a la larva disecada; identificar el músculo 6 por el uso de la iluminación de campo claro.
4. Utilizar el software de adquisición de microscopio (véase Tabla de materiales), en configuración de TIRF. Deslice el ángulo de la cámara de colimador para 1° a aumentar la profundidad de penetración, de lo contrario salir de ángulo crítico TIRF para lograr iluminación oblicua.
5. Encienda el láser de 488 nm para visualizar mEos2 en verde. Utilizar una potencia de láser de baja (menos del 5% de 22.8 mW) para evitar el blanqueo de la fluorescencia verde. Localizar a las uniones neuromusculares (que parecen perlas en una cadena) y adquirir una imagen de baja resolución TIRF.
6. Al mismo tiempo encienda el 405 nm láser (mEos2 de photoconverts de verde a rojo especies) y 561 nm láser (imagen de la mEos2 de photoconverted rojo) estocástico localizar proteínas fluorescentes solo mEos2.
   Nota: Se recomienda usar de baja potencia de laser 405 nm (0.005 a 0,9% de 4.78 mW), esto permite una tasa de photoconversion relativamente constante durante la adquisición de película. Entre 50 y 75% de los 561 nm láser (20.1 mW), ya que esto es suficiente para adquirir la fluorescencia de las especies de mEos2 rojo sin afectar la morfología del tejido muscular que rodea la Unión neuromuscular.
7. Para cada cadena de la Unión neuromuscular, adquieren un tiempo serie compuesta por Marcos de 15.000 o más a 33 Hz. guardar formato de as.czi para preservar el acompañamiento metadatos de referencia.
8. Utilizar ImageJ para convertir archivos de películas de '.czi' 'TIFF'.
9. Analizar las películas adquiridas con una sola molécula conveniente seguimiento de software analítico^11,14,36 como TrackMate en FIJI/ImageJ³⁷ (véase Tabla de materiales). Localiza la 'x' e 'y' extensión de coordenadas de cada localización por el ajuste gaussiano intensidad del punto de la función (PSF).
   Nota: resolución de problemas: Si la fluorescencia verde no se observa o es muy débil en la Unión neuromuscular a la exposición al láser de 488 nm, brevemente encender el photoconverting y proyección de imagen láser (405 nm y 561 nm), ya que esto ayuda a producir más de la red especie de mEos2. Cambiar a los láser de 488 nm y tomar una imagen TIRF.

4. una sola molécula localización en larvas fijadas

1. Para medir el tamaño de nanoclusters de proteínas vía Palma, sustituir medio insectos de Schneider después de la disección con un fijador - paraformaldehído al 4% diluido en tampón fosfato salino (PBS).
2. Incubar la larva durante 30 min a temperatura ambiente.
3. Quitar la disección de los pernos y coloque la larva fija de 1,7 mL transparente tubo de microcentrífuga de cierre rápido.
4. Disecar y fijar como muchas otras larvas según sea necesario, luego lavan tres veces con PBS.
5. Reemplazar el PBS con tampón de bloqueo (una solución de suero normal de cabra PBS, 0,1% Tritón X-100 y 3%).
6. Lavar las larvas con PBS tres veces y luego incubar con el anticuerpo primario necesario (diluido en la solución de tampón de bloque).
7. Incubar durante una noche a 4 ^oC.
8. Lavar las larvas tres veces con PBS, luego incubar con el anticuerpo secundario necesario (diluido en la solución de tampón de bloque).
9. Lave las larvas tres veces con PBS, fije la larva en la base PDMS y la imagen como se describió anteriormente para el rastreo de una sola molécula.

Utilizando el Protocolo mencionados, sintaxina-1A-mEos2 transgénicos Drosophilamelanogaster fueron generados (figura 1). Transgénicos tercer ínstar Drosophila larvas fueron disectadas en la base cilíndrica de PDMS (figura 2A-F). Para visualizar las moléculas individuales de la sintaxina 1A, se utilizó Palma en un microscopio TIRF con láser ligeramente oblicuos iluminación14.

Las moléculas individuales de la sintaxina 1A fueron seguidas en las terminales presinápticas de los nervios motores musculares 6 del segundo segmento abdominal. Como se muestra en la imagen de baja resolución de sintaxina-1A-mEos2 en botones de 1b de tipo cuando se excitó con el láser de 488 nm (Figura 3A), se pudo detectar la fluorescencia verde de mEos2. En los experimentos de proyección de imagen, el 405 nm y las 561 nm excitación láser imágenes profundidades fueron 133,5 nm y 165.6 nm, respectivamente. La imagen verde adquirió un promedio de 16 fotogramas individuales. Esta imagen verde se usó para crear la región de interés utilizado para limitar el análisis de localizaciones de la película photoconverted a las terminales presinápticas de los nervios motores solos.

El análisis de las películas de sptPALM de photoconverted adquirido generan una intensidad muy resuelta, coeficiente de difusión, y mapas de la trayectoria (Figura 3A). Movilidad de sintaxina-1A-mEos2 más se cuantificó mediante el análisis del desplazamiento cuadrático medio (MSD) de las trayectorias individuales (figura 3B). Las comparaciones estadísticas se pueden hacer usando el área bajo la curva MSD (figura 3B). Análisis de la movilidad produce la distribución del coeficiente de difusión de sintaxina-1A-mEos2, y esto puede ser evaluado estadísticamente en comparación del móvil a las poblaciones inmóviles (figura 3).

Figura 1 : Generando construcciones tagged mEos2. El pFL44S-attB-MCS-w + vector es linearizado con BamHI y XbaI. Superposición reacción en cadena de polimerasa (PCR) fragmentos de codificación de la proteína de interés (POI) y mEos2, respectivamente, puede ser reproducido, por ejemplo, en vivo la recombinación en células de levadura ura3 - o Asamblea de Gibson. Tenga en cuenta que para generar el transgén sintaxina-1A-mEos2, hemos clonado el constructo flanqueado por las secuencias de promotor y terminador de sintaxina 1A endógenas. La construcción resultante se puede inyectar posteriormente en Drosophila embriones para crear una línea de mosca transgénica expresando la proteína de interés (POI) fundida a mEos2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Drosophila disección de la larva y la iluminación oblicua. (A) esquema que muestra la disección de la larva de Drosophila en medio cilíndrica base PDMS. Una larva de fileteado se llevó a cabo en el PDMS del gel por el uso de pernos minutien. (B-C) La preparación de larva-PDMS se colocó dentro de una placa de cultivo con fondo de cristal que contiene medio insectos de Schneider. Un microscopio TIRF en una configuración de iluminación ligeramente oblicua fue utilizado para visualizar la sintaxina-1A-mEos2 en los terminales del nervio motor. (D-F) Una base PDMS medio cilíndrico con larva Drosophila disecada. La preparación de larva-PDMS se colocó en un plato de imagen con medio de Schneider, y la larva era reflejada en el microscopio de súper-resolución Palma. Barra de escala, 10 mm. (esta cifra ha sido modificada desde el14). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : En vivo seguimiento de sintaxina-1A-mEos2 en el presináptica del nervio motor terminal. (A) A baja resolución TIRF imagen de sintaxina-1A-mEos2 en un tipo 1b nervio motor terminal. Análisis de películas de photoconversion había reflejado en intensidad Super resuelto sptPALM, coeficiente de difusión y trayectoria 33 Hz generado mapas. 5.309 trayectorias individuales fueron imagen adquisición de película de más de 16.000 fotogramas. Barra de escala, 3 μm. (B-C) Desplazamiento de la media cuadrada (MSD) de sintaxina-1A-mEos2 fue trazada de 6 terminales diferentes de los nervios motores; área bajo la curva (AUC) de MSD se utilizó para cuantificar el nivel de movilidad. La distribución del coeficiente de difusión revela las poblaciones de sintaxina 1A móviles e inmóviles que pueden cuantificarse como cocientes de ellos; se obtuvo un promedio de 2.400 ~ trayectorias por nervio motor terminal (n = 3 larvas). Datos presentados como la media error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.