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Generación de bibliotecas de captura de conformación de genoma cromatina desde etapas bien tempranas embriones de Drosophila

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DOI:

10.3791/57001

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3 de octubre de 2018

 , 
1Max Planck Institute for Molecular Biomedicine

En este artículo

Resumen

Este trabajo describe un protocolo para la generación de alta resolución en situ Hi-C bibliotecas de bien escenifica la gastrulación Drosophila melanogaster embriones.

Resumen

Investigar la arquitectura tridimensional de la cromatina ofrece una visión inestimable de los mecanismos de regulación génica. Aquí, describimos un protocolo para realizar la cromatina conformación captura técnica en situ Hi-C en las poblaciones de embriones de Drosophila melanogaster en escena. El resultado es una biblioteca de secuenciación que permite el mapeo de todas las interacciones de cromatina que se producen en el núcleo en un solo experimento. Clasificación de embriones se realiza manualmente utilizando un microscopio estéreo fluorescente y una línea de mosca transgénica que contiene un marcador nuclear. Usando esta técnica, las poblaciones de embrión de cada ciclo de división nuclear y con el estado del ciclo celular definida, puede obtenerse con una pureza muy alta. El protocolo también se puede adaptar a ordenar más embriones más allá de la gastrulación. Embriones clasificados se utilizan como entradas para en situ Hi-C. Todos los experimentos, incluyendo la preparación de la biblioteca, la secuencia pueden realizarse en cinco días. El protocolo tiene bajos requisitos de entrada y trabaja confiablemente usando 20 embriones en fase blastoderm como material de entrada. El resultado final es una biblioteca de secuenciación para la siguiente secuencia de generación. Después de la secuencia, los datos pueden procesarse en mapas de interacción genoma cromatina que pueden analizarse utilizando una amplia gama de herramientas disponibles para obtener información acerca de asociar topológico estructura de dominios (TAD), bucles de cromatina y cromatina compartimientos durante el desarrollo de Drosophila .

Introducción

Captura de la conformación de la cromatina (3C) ha surgido como un método excepcionalmente útil para el estudio de la topología de la cromatina en el núcleo1. La variante de 3C Hi-C permite medir las frecuencias de contacto de todas las interacciones de cromatina que se producen en el núcleo en un solo experimento2. Aplicación de Hi-C ha jugado un papel importante en el descubrimiento y caracterización de muchos principios fundamentales de organización de la cromatina, como TADs, compartimentos y lazos3,4,5.

Estudios de arquitectura de la cromatina en el contexto de las transiciones del desarrollo y diferenciación de la célula se utilizan cada vez más para desentrañar los mecanismos de regulación génica durante estos procesos6,7,8, 9. Uno de los organismos modelo de gran interés es la Drosophila melanogaster, cuyo desarrollo y genoma están bien caracterizadas. Sin embargo, pocos estudios que investigan la arquitectura de la cromatina en Drosophila fuera en vitro el cultivo de tejidos han sido ajustes realizaron10,11. En embriones de 16-18 h. post fertilización, TADs y compartimientos de estructuras similares en los mamíferos fueron identificados10, que plantea la cuestión de qué papel juegan en la regulación de los genes en el embrión de Drosophila desarrollo. Especialmente en las primeras etapas de desarrollo, antes de la gastrulación, tales estudios son un desafío técnico. Antes de la gastrulación, Drosophila embriones pasan por 13 divisiones nucleares sincrónicas que proceden a un ritmo extremadamente rápido de 8 a 60 min por ciclo de12,13. Además, la falta de características visuales para distinguir las diferentes etapas hacen difícil obtener material de embrión bien escenificada en cantidades suficientes.

Para desarrollar un protocolo que permite el estudio de arquitectura de la cromatina en el desarrollo temprano de la Drosophila en resolución del ciclo nuclear, se combinaron dos técnicas existentes: en situ Hi-C, que permite la generación de alta resolución de todo contacto mapa de genoma5y puesta en escena embrión utilizando una línea transgénica de Drosophila expresaban eGFP-PCNA transgene13,14. Este transgén se localiza en el núcleo durante la interfase y se dispersa en el blastoderm sincitial durante la mitosis. Usando esta propiedad, es posible distinguir fácilmente distintas etapas por su densidad nuclear y mitóticos embriones por la dispersión de la señal de la GFP.

En conjunto, estas técnicas permiten estudiar la estructura tridimensional de la cromatina en alta resolución de tan sólo 20 embriones de Drosophila . Este protocolo incluye las instrucciones para la recolección y clasificación de embriones de Drosophila para obtener poblaciones de embriones de un ciclo único de división nuclear. Además describe cómo los embriones obtenidos se utilizan para llevar a cabo en situ Hi-C. El resultado final es una biblioteca de nucleótido adecuada para secuenciación de máquinas de secuenciación de próxima generación. La Lee de la secuencia resultante se puede procesar luego en cromatina detallados mapas de interacción que cubren el genoma completo de Drosophila .

Protocolo

1. colección de embriones de drosophila

Nota: Una colección equivalente embrionario puede realizarse como se muestra en una anterior publicación15.

  1. Transferencia de moscas jóvenes eGFP-PCNA (< 1 semana de edad) en jaulas de colección de huevo con yeasted colección placas de16 (1% de etanol, ácido acético al 1% y 4% de agar).
  2. Mover jaulas de colección a una incubadora a 25 ° C. Incubación de 1 a 2 días antes de la recogida de huevos aumenta significativamente la producción de huevo. Cambiar las placas de la colección dos veces al día.
  3. Retire las placas que contienen los embriones de la cámara de recogida en intervalos de 30 a 60 min. Intervalos más pequeños resultan en menos embriones, pero la mayor distribución de etapas de desarrollo. Recoger de varias jaulas en paralelo así que idealmente > 200 huevos se colocan cada 30 – 60 min.
  4. Almacenar las placas a 25 ° C hasta que los embriones alcancen la edad deseada. De embriones en fase de blastoderm (ciclo nuclear 14), incuban durante aproximadamente 2 horas.
  5. Después de 2 h de incubación, añadir agua del grifo de una botella de squirt a la placa de la colección para que toda la superficie se cubre con agua. Suspender los embriones y la levadura con un cepillo suave.
  6. Vierta resuspendidos embriones de la placa de la colección en una canasta de la colecta de embriones (coladores celulares comerciales con tamaño de poro de 100 μm o cestas caseras17 funcionan bien), agregando más agua del grifo de una botella de squirt, si es necesario. En esta etapa, se combinan los embriones de todas las placas que se recolectaron en paralelo. La muestra colectiva representa un único lote.
  7. Lavar los embriones bien aclarando la cesta con agua del grifo de una botella de squirt por 30 s, hasta que todo el residuo de la levadura se lava lejos.
  8. Dechorionate de embriones mediante la colocación de la canasta en una solución de hipoclorito de sodio al 2,5% en agua. Ligera agitación agitando facilita la eliminación del corión. Continuar hasta que los embriones son suficientemente hidrofóbicos que flotan en la superficie de la solución cuando la cesta está levantada y sumergida de nuevo, que debe tomar ~1.75–2 min.
    PRECAUCIÓN: hipoclorito de sodio es corrosivo. Use equipo de protección personal. Soluciones que contengan < 10% hipoclorito de sodio generalmente pueden eliminarse en el fregadero, asegúrese de consultar la normativa del Instituto anfitrión.
  9. Retire la cesta de la solución y enjuague con agua del grifo de una botella de squirt hasta que el olor de la lejía no es sensible.

2. embrión fijación

Nota: Las condiciones de fijación óptima, sobre todo la concentración de detergente, formaldehído y la duración de la fijación, deben ser determinados empíricamente para adaptarse a la etapa de los embriones. Para los estadios en el blastoderm sincitial, una concentración final de 0,5% Tritón X-100 y 1,8% formaldehído en la fase acuosa funciona bien. Para etapas posteriores más allá de la etapa de embrión 9, mayor optimización de estos parámetros puede ser necesario. Todas las soluciones utilizadas durante la fijación y ordenación deben contener inhibidores de la proteasa.

  1. Invierta la canasta y coloque sobre un tubo de centrifugación cónicos de 15 mL. Enjuague los embriones de la cesta en el tubo con una pipeta Pasteur dispensación PBS-T (PBS, 0,5% Tritón X-100).
  2. Dejar embriones colocan en la parte inferior y ajustar el volumen total de 2 mL con PBS-T.
  3. Añadir 6 mL de heptano y 100 μl de formaldehído al 37% en agua.
    PRECAUCIÓN: Heptano y formaldehído son tóxicos cuando se inhalan o después de la piel en contacto con. Usar equipo de protección personal y trabajar en una campana de humos. Residuos que contengan heptano o formaldehído debe desecharse por separado según las regulaciones del Instituto anfitrión.
  4. Después de añadir el formol, iniciar un temporizador de 15 minutos y agite vigorosamente el tubo hacia arriba y abajo durante 1 minuto a mano. La fase acuosa y orgánica se combina para consistencia forma un como shampoo.
  5. Agitar en un mezclador rotatorio hasta 10 minutos después de la adición de formaldehído.
  6. Centrifugar a 500 x g durante 1 min a temperatura ambiente para recolectar embriones en la parte inferior del tubo.
  7. Aspirar el líquido shampoo-como todo y desecharlo, teniendo cuidado de no para aspirar cualquier embriones. Pequeñas cantidades restantes de champú como sobrenadante no causan problemas.
  8. 15 minutos después de la adición de formaldehído, resuspender los embriones en 5 mL de PBS-T con glicina 125 mM para saciar el formaldehído. Mezcle vigorosamente agitando arriba y abajo durante 1 minuto.
  9. Centrifugar a 500 x g durante 1 min y aspirar el sobrenadante.
  10. Lavado de embriones por resuspender en 5 mL de PBS-T. helada Deje el settle de embriones y Aspire todo el sobrenadante.
  11. Repetir el lavado en el paso 2.10 dos veces más.
  12. No embriones en hielo hasta su clasificación. Por lo general, es una buena idea para recoger 3 o 4 lotes de embriones mosca antes de proceder a la clasificación. Sin embargo, los embriones deben ordenarse el mismo día. Almacenamiento prolongado en hielo o en la nevera lleva a morfología embrionaria alterada.

3. embrión de clasificación

Nota: La clasificación se puede hacer en cualquier fluorescente microscopio estéreo equipado con un filtro GFP con aumentos de 60 – 80.

  1. Con una pipeta de 1000 μl, transferir un lote de aproximadamente 100 embriones a un recipiente de vidrio adecuado para clasificar, preferiblemente de un color oscuro y coloque en hielo.
  2. Embriones de tipo nuclear estado densidad y ciclo celular (figura 1) empujando embriones deseables en una pila separada usando una punta de aguja o jeringa.
    1. Quite todos los embriones con distribución dispersa, no nuclear de eGFP-PCNA (Figura 1E). Además, deben eliminarse embriones que parcialmente muestran una señal GFP no nucleares.
    2. Para ayudar en la clasificación, montar una line de embriones de referencia en el ciclo nuclear 12, 13 y 14 de cada lote utilizando los cuadros en la figura 1 como guía. Use esta line a embriones de una etapa desconocida con uno de los embriones de referencia para determinar su estado.
    3. Para comprobar la etapa de desarrollo de embriones de la referencia, medir la densidad nuclear proyección de imagen del embrión y contar el número de núcleos en la superficie del embrión en un área de 2.500 μm2 utilizando el software de imágenes que proporciona información de la distancia.
      Nota: El número esperado de núcleos para un área de 2.500 μm2 es 12 a 16 núcleos en el ciclo nuclear 12 y 20 a 30 núcleos en el ciclo nuclear 1313.
  3. Una vez que se separan todos los embriones en la etapa adecuada, tomar fotografías de los embriones para la documentación y control de calidad. Si el microscopio estéreo no es equipado con un módulo de cámara, puede utilizarse cualquier microscopio de epifluorescencia con filtros GFP.
  4. Pipeta hasta los embriones deseados utilizando una pipeta de 1000 μl, traslado a un lugar y tubo fresco en hielo.
  5. Continúe hasta que suficientes embriones se clasifican para el experimento planeado. Mayor de embriones de etapa 9, generalmente 20 embriones son suficientes para uno en situ Hi-C experimento. En el ciclo nuclear 12, 80 embriones son un buen punto de partida. En ciclos anteriores, el número de embriones debe doblarse aproximadamente para cada ciclo.
  6. Piscina y dividir los embriones en tubos de 1,5 mL de tal manera que un tubo contiene suficientes embriones para un solo en situ Hi-C del experimento. Es aconsejable utilizar tubos con bajo características de enlace de ADN, ya que el mismo tubo se utilizará para el conjunto del protocolo y adsorción del ADN puede llevar a importantes pérdidas a bajas concentraciones de ADN.
  7. Girar los tubos brevemente a 100 x g a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Los embriones deben estar tan secos como sea posible para la congelación.
  8. Flash congelar embriones sumergiendo los tubos en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C.

4. in Situ Hi-C

  1. Lisis de
    1. Colocar tubos con embriones congelados en el hielo.
    2. Resuspender los embriones en 500 μl de tampón de lisis helada (10 mM Tris-Cl de pH 8.0, 10 mM NaCl, 0,2% IGEPAL CA-630, inhibidores de la proteasa, disuelto en agua). Espere 1 minuto para permitir que los embriones colocar en la parte inferior del tubo.
    3. Embriones de molienda usando un mortero micro metal, previamente enfriado en hielo, está diseñado para caber firmemente un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      1. Para evitar la agitación de los embriones, inserte la mano lentamente hasta que toque la parte inferior del tubo de empuje hacia abajo y luego moler girando la mano dos veces en ambas direcciones.
      2. Levante la mano ligeramente empuje hasta el fondo del tubo de nuevo y repita el pulido.
      3. Repetir 4.1.3.2 10 veces, o hasta que los embriones son completamente lisados. La solución debe ser homogénea, y no trozos residuales de embriones deben permanecer.
    4. Incubar la suspensión homogeneizada en hielo por 15 min centrifugado a 1.000 x g, 4 ° C por 5 min y descartar el sobrenadante.
    5. Lavar el pellet a resuspender en 500 μl de tampón de lisis helada, pipeteo arriba y abajo.
    6. Vuelta otra vez como en 4.1.4 y descartar el sobrenadante.
    7. Resuspender el precipitado lavado en 100 μl de 0.5% sodio dodecil sulfato (SDS), pipetear arriba y abajo. Permeabilizar los núcleos por incubar 10 min a 65 ° C en un bloque de la calefacción. Quench SDS agregando 50 μl de 10% Tritón X-100 y 120 μl de agua. Mezclar agitando el tubo.
    8. Incubar a 37 ° C durante 15 min en el bloque de calor.
  2. Digestión de la enzima de restricción
    1. Añada 25 μl de 10 x buffer de la enzima de la restricción y 20 U de 5 U/μl MboI. Mezclar agitando el tubo.
    2. Digerir el ADN por incubación durante 90 minutos a 37 ° C en el bloque de calor bajo agitación leve (750 rpm).
    3. Añadir otro 20 U de MboI y continuar la incubación durante 90 minutos.
    4. Inactive por calor el MboI por incubación a 62 ° C por 20 min.
  3. Relleno de la proyección
    Nota: Llenar en el alero con dATP biotinilado permite la selección de fragmentos específicos ligados. Biotina-dATP en ensambladuras de la ligadura está protegido de la actividad de exonucleasa de T4 DNA polimerasa (sección 4.6), mientras que la biotina-dATP en unligated extremos romos se elimina eficientemente. El menú desplegable con perlas recubiertas de estreptavidina en la sección 4.7 por lo tanto específicamente enriquece para fragmentos de ADN ligados, quiméricos.
    1. Añadir 18 μL de 0.4m m biotina-14-dATP, 2.25 μl de una mezcla sin modificar de la dCTP/dGTP/dTTP (3,3 mM) y 8 μl de 5 U/μl ADN polimerasa I Klenow fragmento.
    2. Mezclar agitando el tubo e incubar a 37 ° C durante 90 min en el bloque de calor.
  4. Ligadura de
    1. Añadir 657 μl de agua, 120 μl de tampón de Ligase de la DNA de 10 x T4, 100 μl de 10% Tritón X-100, 6 μl de 20 mg/mL albúmina sérica bovina (BSA) y homogeneizar agitando el tubo. Finalmente añadir 5 μl de 5 U/μl T4 ADN ligasa y mezcle agitando el tubo.
    2. Gire el tubo suavemente (20 rpm) a temperatura ambiente durante 2 h.
    3. Añadir una segunda entrega de 5 μl de 5 U/μl T4 ADN ligasa y continúe girando para 2 h más.
    4. Desactivación de los núcleos a 2.500 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
  5. Extracción de ADN
    1. Resuspender el precipitado en 500 μl de tampón de extracción (50 mM Tris-Cl de pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1% SDS, disuelto en agua) y agitando el tubo, añada 20 μl de proteinasa K. Mix de 20 mg/mL.
    2. Digerir proteínas por incubar a 55 ° C por 30 min, agitando a 1.000 rpm.
    3. De reticulación, añadir 130 μl de 5 M NaCl e incubar durante una noche a 68 ° C, agitando a 1.000 rpm.
    4. Muestra de la pipeta en un tubo nuevo de 2 mL, preferentemente con bajas características de enlace de ADN.
    5. Añadir 0,1 volúmenes de x (63 μL) de acetato de sodio de 3 M pH 5.2 y 2 μl de 15 mg/mL GlycoBlue. Mezclar bien por inversión del tubo. Añadir volúmenes de x 1,6 (1.008 μL) de etanol absoluto puro y mezclar por inversión del tubo.
    6. Incubar a-80 ° C durante 15 minutos la centrifugadora a 20.000 x g a 4 ° C durante al menos 30 minutos. El pellet de DNA es a menudo muy pequeña, casi invisible y sólo puede ser identificado por el color azul de GlycoBlue.
    7. Eliminar sobrenadante cuidadosamente, moviendo la punta de la pipeta en el tubo a lo largo de la pared opuesta de donde se encuentra el pellet de DNA. Pequeñas gotitas restantes se eliminan a menudo fácilmente durante este paso y los siguientes lavados, empujando fuera de los tubos usando una punta de P10 en lugar de pipeteado hacia fuera.
    8. Lavar el pellet al añadir 800 μl de etanol al 70%. Mezclar por inversión del tubo y centrifugar a 20.000 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos repetir este lavado al menos una vez.
    9. Eliminar los restos de etanol y dejar el pie del tubo con la tapa abierta para 5 minutos deje secar al aire. Una vez que se queda sin líquido, añada 50 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0. Pipetear repetidamente la solución sobre el área en la pared del tubo donde se encontraba el pellet para solubilizar el ADN.
    10. Añadir 1 μl de Rnasa A, homogeneizar agitando el tubo, de 20 mg/mL e incubar a 37 ° C por 15 min de digerir RNA. La muestra se puede guarda en la nevera durante la noche o congelada a-20 ° C indefinidamente.
    11. Compruebe la concentración de ADN usando un colorante fluorescente basado en análisis según las instrucciones del fabricante. La cantidad total de ADN en la muestra debe ser al menos 10 ng, de lo contrario demasiado poco material está disponible para la amplificación y complejidad de biblioteca probablemente será baja. Cuando esto sucede, probablemente no era suficiente la cantidad de material de partida, o material se perdió en el camino, tal vez durante la lisis y la precipitación.
  6. Eliminación de biotina y ADN de corte
    1. Añadir a 12 μl de tampón de polimerasa de la DNA de T4 x 10, 3 μl de 1 mM de dATP, 3 μl de 1 mM dGTP y 46 μl de agua. Mezclar agitando el tubo. Añadir 5 μl de 3 U/mL T4 DNA polimerasa, mezclar agitando el tubo e incubar a 20 ° C por 30 min.
    2. Agregar 3 μl de EDTA de 0,5 M para detener la reacción y utilizar el agua para llevar la muestra a un volumen de aproximadamente 120 μl.
    3. Corte del ADN a un tamaño de 200 – 400 bp usando un dispositivo de sonicación según las instrucciones del fabricante. Con el sonicador mencionado en la Tabla de materiales, el siguiente programa es apropiado: 2 ciclos cada uno de los 50 s, deber del 10%, intensidad 5, 200 ciclos/explosión.
  7. Desplegable de biotina
    1. Pipetear 30 μl de granos magnéticos de streptavidin recubierto de 10 mg/mL en un tubo nuevo, separado en un soporte magnético y descartar el sobrenadante.
    2. Resuspender los granos en 1 x buffer B & W (5 mM Tris-Cl de pH 7.4, EDTA 0,5 mM, 1 M NaCl, disuelto en agua) + 0,1% Tritón X-100 y mezclar con un vórtex. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere por 1 – 5 min hasta que los granos son separados, dependiendo de la marca y modelo.
    3. Aspirar y descartar sobrenadante mientras desliza la punta de la pipeta a lo largo de la pared opuesta de donde se encuentran los granos. Resuspender los granos en 120 μl de 2 x tampón B & W (10 mM Tris-Cl pH 7.4, EDTA 1 mM y 2 M de NaCl). Mezclar con un vórtex.
    4. Transferencia de ADN esquilado a un nuevo tubo de unión de ADN bajo y mezclar con 120 μl de la suspensión de grano en buffer X B & W 2 Vortex. Gire los granos con la muestra de ADN a 20 rpm por 15 minutos.
    5. Separar los granos en un soporte magnético y descartar el sobrenadante.
    6. Resuspender granos en 600 μl de 1 x B & W + 0,1% Tritón X-100 e incubar a 55 ° C por 2 min, agitando a 1.000 rpm. Después de la separación, deseche el sobrenadante. Repita este lavado una vez.
    7. Lavar los granos una vez con 600 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0 y desechar el sobrenadante después de la separación.
    8. Resuspender los granos en 50 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0.

5. secuencia biblioteca elaboración

Nota: Los pasos de la biblioteca se realizan utilizando componentes de una preparación comercial de la biblioteca de DNA kit (véase Tabla de materiales). Sin embargo, se pueden sustituir otros reactivos o kits alternativos. Precipitación tiende a formarse en los agentes de preparación de la biblioteca durante el almacenaje de congelador. Por lo tanto es importante asegurarse de que toda precipitación se disuelve antes de usar los reactivos.

  1. Reparación final
    1. Transferir la suspensión de grano en 50 μl de 10 mM de Tris-Cl de pH 8.0 en un nuevo tubo PCR.
    2. Agregar 3 μl de mezcla de enzima preparación final y 7 μl de tampón de reacción preparación final. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
    3. Transferir el tubo a un termociclador y ejecutar el siguiente programa: 20 ° C por 30 min, 65 ° C durante 30 minutos y mantenga a 4 º C.
  2. Ligadura de adaptador
    1. Añadir 30 μl de mezcla maestra de ligadura, 2.5 μl de 1,5 μm adaptador de secuencia (diluir a 1.5 μm de la acción) y 1 μl de reforzador de la ligadura a la suspensión de grano. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
    2. Incubar a 20 ° C durante 15 minutos en un termociclador.
    3. Agregar 3 μl de enzima de usuario. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
    4. Incubar a 37 ° C durante 15 minutos en un termociclador.
    5. Separar los granos en un soporte magnético y eliminar el sobrenadante.
    6. Lavar granos, suspender cuentas en 100 μl de 1 x buffer B & W + 0,1% Tritón X-100. Mezcla por Vortex y transfiéralo a un tubo nuevo de microcentrífuga. Separar los granos en un soporte magnético y eliminar el sobrenadante.
    7. Repita este lavado una vez con 600 μl de la solución de la misma.
    8. Suspender cuentas en 600 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0, mezcla por Vortex y transferir los granos a un tubo nuevo.
    9. Separar los granos en un soporte magnético, deseche el sobrenadante y granos de resuspender en 50 μl de 10 mM de Tris-Cl de pH 8.0.
  3. Amplificación por PCR
    1. Preparar dos tubos PCR y en cada uno, mezclar 25 μl de polimerasa Master Mix, 1,5 μl de 10 μm hacia adelante () primer PCR y 1,5 μl de reversa (indexadas) PCR primer de 10 μm.
      Nota: Reenviar (indizada) cartilla de la polimerización en cadena:
      5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T 3´.
      Inversa (indexada) cartilla PCR:
      5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T 3´. * indica fosfotioato bonos y Ns en la cartilla PCR indexada.
    2. En cada tubo, agregue 22 μL de suspensión de grano y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
    3. Ejecutar mediante el siguiente programa PCR: 98 ° C por 1 min, (98 ° C por 15 s, 65 ° C durante 75 s, rampa de 1,5 ° C/s) repite 9 - 12 veces, 65 ° C durante 5 min y mantener a 4 ° C.
      Nota: El número de ciclos de amplificación debe determinarse empíricamente. Sin embargo, encontramos que las bibliotecas que requieren más de 12 ciclos eran en general de baja complejidad y no dio lugar a alta calidad que HI-C mapas. Por otra parte, las bibliotecas que requieren menos de 12 ciclos no fueron afectadas negativamente por amplificación para un total de 12 ciclos. Por lo tanto, es posible defecto a 12 ciclos de amplificación.
    4. Piscina las dos reacciones de PCR en un tubo de microcentrífuga sola, separar los granos en un soporte magnético y transferir el sobrenadante que contiene la biblioteca a un tubo nuevo.
  4. Selección del tamaño
    1. Traer Ampure XP suspensión de grano a temperatura ambiente y mezclar bien por agitación.
    2. Llevar el volumen de la reacción de PCR combinada a exactamente 200 μL con agua. Durante la PCR y la separación magnética, algo del volumen original se pierde generalmente. Verificar el volumen mediante el establecimiento de la pipeta de 200 μl y aspirar todo el volumen de la reacción. Si se aspira aire, más agua necesita ser añadido. Si el volumen es superior a 200 μL, ajustar el volumen de granos agregado en los pasos 5.4.3 y 5.4.6 proporcionalmente.
      Nota: Los volúmenes en paréntesis son válidos si el volumen total de las reacciones de PCR combinados es exactamente 200 μl.
    3. Añadir volúmenes de x 0,55 (110 μl) de suspensión de grano Ampure XP y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo por lo menos 10 veces.
    4. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min., cuentas separadas en un soporte magnético para 5 minutos.
    5. Pasar el sobrenadante a un tubo nuevo. Desechar el tubo que contiene los granos. Los granos han consolidado ADN > 700 bp, que es demasiado grande para ser secuenciado.
    6. En el sobrenadante, agregar 0,2 volúmenes de x (40 μl, resultando en un total de 0,75 x Ampure buffer de la muestra) de suspensión de grano Ampure XP y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces.
    7. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min., cuentas separadas en un soporte magnético para 5 minutos.
    8. Deseche el sobrenadante que contiene ADN < 200 bp, que incluye cartillas gratis, dímeros de primer y fragmentos demasiado pequeños para ser secuenciado.
    9. Dejar el tubo en el soporte magnético. Lavar los granos, añadir 700 μl de etanol al 80%, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento de grano e incube durante 30 s.
    10. Deseche el sobrenadante, tomar el tubo del soporte magnético y granos de resuspender en 100 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
    11. Añadir volúmenes de x 0,8 (80 μL) de suspensión de grano de Ampure XP. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Esta segunda ronda de selección de tamaño de límite inferior asegura que la biblioteca final está totalmente libre de cartillas y dímeros de primer.
    12. Separar los granos en un soporte magnético para 5 min y descarte el sobrenadante.
    13. Lavar el sedimento de grano dos veces con 700 μl de etanol al 80% para 30 s cada uno, dejando el tubo en el soporte magnético, como el anterior.
    14. Con el tubo en el soporte magnético, eliminar todos los restos de etanol. Ayuda a empujar las gotas de etanol del tubo con una pipeta P10. Que etanol residual se evapora hasta un máximo de 5 minutos.
    15. Tomar el tubo del soporte magnético y granos de resuspender en 50 μl de 10 mM Tris-Cl de pH 8.0. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces.
    16. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, a continuación, los granos separados en un soporte magnético.
    17. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Esta es la biblioteca de Hi-C final, lista para ser cuantificado y secuenciado en máquinas de secuencia de la generación siguiente, según las instrucciones del fabricante.

Resultados

Ordenadas poblaciones de embriones en el ciclo nuclear, 12, 13 y 14 (correspondiente a la 1:30, 1:45 y 2:10 horas post fecundación, respectivamente12) y fertilización post de 3 – 4 h (hpf) fueron obtenidos según los procedimientos descritos en el protocolo. Por tomar fotografías de la señal de eGFP-PCNA de cada lote de embriones ordenados, es posible documentar el estado precisa de la etapa y el ciclo celular de cada embrión individual que se utiliza en experimentos posteriores. Imágenes de ejemplo de embriones de poblaciones ordenadas se muestran en la figura 1B-E. La salida del protocolo en situ Hi-C es una biblioteca de nucleótido lista para ser ordenados en máquinas de secuenciación de próxima generación. Para ello, una concentración final de la biblioteca de al menos 2-4 nM es generalmente necesaria. Utilizar las cantidades recomendadas de material de entrada, esta concentración es confiablemente alcanzado (tabla 1).

La distribución del tamaño esperado de fragmentos de ADN después de selección de tamaño entre 300 – 600 bp, con un máximo de alrededor de 500 bp ()figura 2A), dependiendo el corte exacto y parámetros de selección de tamaño. Secuenciación, se recomiendan extremo apareado lecturas de al menos 75 longitud bp para reducir al mínimo el número de fragmentos de restricción no asignable en el genoma. Mapas de alta resolución con tamaño de cubo de 1 – 2 kb pueden obtenerse lecturas 400 millones. Recomendamos secuenciar múltiples repeticiones biológicas a una profundidad menor de 150 millones cada uno, en lugar de secuenciar una sola repetición en profundidad muy alta Lee. Esto permite la evaluación de la variación biológica y conduce a un número inferior de desechados Lee debido a duplicaciones de PCR. Para la representación visual, las repeticiones pueden combinarse. Antes de comprometerse a secuenciar una muestra en profundidad, se recomienda ejecutar muestras usando secuencia superficial (unos pocos millones lecturas por muestra) para determinar parámetros de calidad de la biblioteca básica como en la figura 2B.

Análisis de datos Hi-C requiere considerable experiencia computacional de recursos y la bioinformática. Como una descripción áspera, lecturas emparejadas se asignan independientemente para el genoma de referencia, los alineamientos resultantes se filtran por la calidad y orientación, luego una matriz de contactos a nivel de resolución o fragmento bin dada puede ser generada de la filtrada alineaciones. La matriz de contacto es la base para todos más abajo análisis explorar TADs, bucles y compartimientos. Para el análisis inicial de la Lee de la secuencia, existen varias tuberías de Bioinformática que permiten la transformación de la materia prima lee en contacto matrices sin mucho conocimiento especializado bioinformática18,19, 20,21,22,23. Como análisis adicional depende en gran medida la cuestión biológica exacta bajo estudio y podría requerir experiencia en programación y scripting en Python o en R. Sin embargo, varias herramientas y algoritmos para llamar TADs están disponibles5,24,25,26,27,28, así como software para analizar y explorar los datos Hi-C en el navegador web y aplicaciones de escritorio independientes29,30,31,32.

Una vez procesada, la calidad de la biblioteca puede ser determinada utilizando diferentes métricas (figura 2B). En primer lugar, la tasa de duplicados de la polimerización en cadena, que es el número de secuenciadas leerlas pares derivados de la misma molécula original, debe ser tan baja como sea posible limitar la cantidad de Lee de la secuencia perdida. Sin embargo, incluso las bibliotecas con > 40% duplicación de PCR se puede procesar en mapas de contacto de alta calidad si se filtran los duplicados. En segundo lugar, la tasa de filtrado Lee debido a su orientación, como se describe en4, constantemente debe inferior al 10% de pares alineados de leer.

Durante el desarrollo pre-gastrular de Drosophila entre ciclo nuclear 12 y 14, la arquitectura nuclear es drásticamente remodeladas33 (figura 3). En el ciclo nuclear 12, TADs pocos son detectados, y la distribución general de contactos es muy suave sin muchas características discernibles. Esto es dramáticamente cambió en el ciclo nuclear 13 y 14, cuando TADs son cada vez más prominentes y contactos a larga distancia se agotan.

figure-results-1
Figura 1: cuadros representativos de embriones de eGFP-PCNA durante clasificación. Señal de eGFP-PCNA (A) de una población base de embriones después de que colección de 60 min y 2 h de incubación a 25 ° C (B-E) ejemplos de embriones de poblaciones clasificadas en el ciclo nuclear 12 (B), nuclear ciclo 13 (C), (14) ciclo nuclear D) y de embriones que experimentan mitosis síncrono (E). Barras de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Ejemplos de en situ Hi-C métricas de calidad de biblioteca. Rastros del equipo Bioanalyzer (A) que muestra la distribución de tamaños de fragmento de ADN de una éxito Hi-C biblioteca (1, arriba) y de una biblioteca que muestra un pico de fragmentos que son demasiado grandes para la secuencia (biblioteca 2, abajo). Biblioteca 2 fue secuenciado con éxito, pero incluso grandes cantidades de fragmentos de ADN no deseados pueden conducir a la secuencia de la disminución de rendimientos. (B) filtrado estadísticas de dos bibliotecas de Hi-C: muestra es el número de pares de leer alineados que están excluidos del análisis debido a leer orientación y distancia (interior, exterior)4 o duplicación de PCR (duplicada). En cada barra, el número de lecturas, pasando por el filtro (restante) y falla (filtrado) se traza. Además, el porcentaje de lecturas pasa el filtro se muestra como texto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: interacción-C mapas de embriones escenificados. Mapas de interacción-C son agrupadas en 10 kb resolución y equilibradas como se describe antes33. Es una región en el cromosoma 2 L. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

BibliotecaEtapaNúmero de embrionesCantidad de ADN antes de corte (ng)Ciclos PCRConcentración final de la biblioteca (nM)
1ciclo nuclear 1271461228.2
2ciclo nuclear 1246401222.2
3ciclo nuclear 1260131312.3
4ciclo nuclear 1336391222.2
5ciclo nuclear 133510125.0
6ciclo nuclear 134818128.7
7ciclo nuclear 1433301239.8
8ciclo nuclear 1424361220.4
9ciclo nuclear 14148124.2
103-4 hpf17301224.0
113-4 hpf18421119.1
123-4 hpf22631148.4

Tabla 1: lista de las estadísticas de biblioteca de secuencias representativas. Para cada biblioteca en la lista, el número de embriones que fueron utilizados para su generación, la cantidad de ADN total antes de telecine de biotina y de corte medido por Qubit, el número de PCR ciclos usados para la amplificación y la concentración final de la biblioteca de la secuencia después de la purificación y el tamaño de la selección son los indicados.

Discusión

El protocolo presentado aquí es muy eficaz en la generación de mapas de alta calidad de la arquitectura de la cromatina en los primeros embriones de Drosophila . En comparación con un anterior protocolo34, el enfoque descrito aquí utiliza una actualizada en situ Hi-C procedimiento5, resultando en el proceso más rápido, mayor resolución y menos uso de reactivo. Se espera que el procedimiento general, incluido el protocolo en situ Hi-C para trabajar en una amplia gama de escenarios y sistemas experimentales además de Drosophila. Puesto que el protocolo tiene un requisito de entrada de bajo, también podría utilizarse en poblaciones aisladas de la célula. En Drosophila, cuando utiliza el protocolo de embriones fuera del rango se describe aquí, algunos parámetros, en particular la fijación del material, que tenga que ajustarse. Puesto que más embriones desarrollan una cutícula muy impermeable, elevando la concentración de formaldehído y prolongar la fijación pueden ser apropiados. Para la recogida de embriones en etapas que no sean de ciclo nuclear 14, los tiempos de incubación de los embriones a 25 ° C en el paso 1.4 deben ajustarse como se indica a continuación: ciclo nuclear 12, minuto 70; ciclo nuclear 13, 90 min; hpf de 3 – 4, 3:30 h.

Durante las divisiones de la 13 división (etapa 1-4), la densidad de núcleos se duplica aproximadamente con cada división. Los núcleos se pueden identificar fácilmente por su fluorescencia de GFP brillante. Durante la mitosis, eGFP-PCNA no se encuentra en el núcleo, y su señal se dispersa en todo el embrión. Esta característica hace identificar los embriones que se someten a una posible división de hendidura sincrónica. Para estudiar la conformación de la cromatina, estos embriones mitóticos generalmente no son deseables, puesto que la organización mitotic de la cromatina es drásticamente diferente de la interfase organización35. Es posible adaptar el protocolo para seleccionar específicamente los embriones sometidos a una división mitótica sincrónica. En este caso, deben conservarse embriones sólo con distribución dispersa, no nuclear de eGFP-PCNA y todos los otros embriones deben ser descartados. Puesto que no puede determinarse la densidad nuclear, se deben emplear métodos alternativos a los embriones de etapa por su morfología en microscopía de luz transmitida. Presencia de células del polo y los núcleos en la periferia del embrión indican que el embrión ha completado por lo menos nuclear ciclo 9, mientras que cellularization visible en la periferia indica ciclo nuclear 1412.

Experimentos-C se pueden realizar con éxito usando una variedad de enzimas de restricción5. Enfoques actuales suelen utilizan enzimas que reconocen o una secuencia de base 4, como MboI, o un sitio de reconocimiento de la base de 6, como HindIII. La ventaja de base de 4 cortadores sobre base de 6 cortadores es que ofrecen mayor resolución posible, dada suficiente profundidad de la secuencia y una cobertura más uniforme de sitios de restricción en todo el genoma. Hay clara ventaja en la elección de una base de 4 cortador sobre otros5,23,36,37. Las dos enzimas más comúnmente utilizadas, MboI y DpnII, ambos reconocen el mismo sitio de reconocimiento GATC. DpnII es menos sensible a la metilación CpG, que es motivo de ninguna preocupación en Drosophila. El protocolo presentado aquí puede también completarse con éxito usando DpnII como una enzima de restricción. En la sección 4.2. enzima de la restricción y el tampón tienen que ajustarse para compatibilidad de DpnII, según las recomendaciones del fabricante.

Si el tamaño del fragmento de la biblioteca de la secuencia se desvía significativamente de la gama que se muestra en la figura 2A, formación de grupos durante la secuencia puede ser menos eficiente o fracasan completamente. En este caso, debe revisarse la distribución de tamaño después de la esquila y parámetros de corte ajustado en consecuencia. Picos en la distribución de fragmentos de ADN de muy pequeño (< 100 bp) o muy grandes (> 1.000 bp) tamaños indica problemas con selección de tamaño, como llevar encima de granos o de sobrenadante que deben descartarse. A menudo estas bibliotecas con picos pequeños en estos tamaños no deseados, como la foto, son todavía secuenciaron con éxito con solamente una disminución menor en clustering eficiencia.

Altas tasas de duplicación de PCR deben evitarse ya que esto reduce drásticamente el número de lecturas de secuencia utilizable. El índice de PCR duplicados está directamente relacionada con la cantidad de material de entrada. Por lo tanto generalmente con el ingreso de más alivia problemas con la duplicación de la polimerización en cadena.

Números más altos de lectura filtrada debido a leer orientación ()figura 2B) indican la digestión insuficiente, que puede ser el resultado de utilizar muy poca enzima material demasiado entrada y homogenización incompleta de los embriones.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por la sociedad Max Planck. C.B.H. fue apoyado por una beca de la International Max Planck Research School – biomedicina Molecular. Agradecemos Shelby Blythe y Eric Wieschaus amablemente ofreciendo la línea de eGFP-PCNA Drosophila melanogaster.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Biotina-14-dATPLife Technologies19524016
MboINew England BiolabsR0147L
ADN polimerasa I Fragmento de KlenowNew England BiolabsM0210L
T4 ADN ligasaThermo FisherEL0012T4 T4 ADN Ligasa T4 Tampón incluido
T4 ADN polimerasaNew England BiolabsM0203L
Proteinasa KAppliChemA4392
GlycoBlueLife TechnologiesAM9516
Inhibidores completos de la proteasa ultra libres de EDTARoche5892791001
NEBNext Multiplex Oligos para Illumina ( 1)El adaptadorE7335de New England Biolabs, el cebador de PCR directo (no indexado) y el cebador de PCR inverso (indexado) y la enzima USER utilizados en la sección de preparación de la biblioteca son componentes de este kit
El kit de preparación de la biblioteca NEBNext Ultra IINew England BiolabsE7645el tampón de reacción de preparación final, el potenciador de la ligadura, la mezcla maestra de ligadura y la mezcla maestra de polimerasa utilizados en la sección de preparación de la biblioteca son componentes de este kit
Covaris S2 AFA SystemCovaris
DNA LoBind Tubes, 1,5 mLEppendorf0030108051
Falcon cell strainer 100 µ mCorning352360Cestas de recogida de embriones
37% formaldehídoVWR437536C
HeptaneAppliChem122062.1612
M165 FC Microscopio estereoscópico fluorescenteLeica
M165 FC Cámara DFCLeica
Micro morteroCarl RothP985.1Se utiliza para lisar embriones en paso 4.1.4
ARNasa AAppliChemA3832,0050
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies65002Perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina Perlas
Ampure XPBeckman CoulterA63881
Qubit 3.0 FluorímetroThermo Fisher ScientificQ33216
Tubos de ensayo QubitThermo Fisher ScientificQ32856
Qubit dsDNA HS Kit de ensayoThermo Fisher ScientificQ32854
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma-AldrichP4417
moscas eGFP-PCNARegalo de S. Blythe y E. Wieschaus
Hipoclorito de sodio 13%Thermo FisherAC219255000
Triton X-100AppliChemA4975
Tampón Tris pH 8,0 (1 M) para biología molecularAppliChemA4577
NaCl AppliChemA2942
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL GreinerBio-One
SDS para biología molecularAppliChemA2263
10x TampónCutSmartNew England BiolabsB7204STampón enzimático de restricción
Mezcla de nucleótidos de PCRSigma-Aldrich11814362001dCTP, dGTP, dTTP BSA sin modificar
biología molecularNew England BiolabsB9000S
EDTA 0.5 M solución para biología molecularAppliChemA4892
Acetato de sodio 3 M pH 5.2Sigma-AldrichS7899
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321DSoporte magnético
Intelli-Mixer RM-2LOmnilab5729802Rotator
ThermoMixer F1.5Eppendorf5384000012 Mixer
Jaulas de recolección de embriones pequeñosFlystuff.com59-100 Jaula de recolección dehuevos
Centrífuga 5424  REppendorf5404000413
C1000 Touch TermocicladorBio-Rad1851148
tiras de tubo PCRGreiner Bio-One673275
NEBuffer 2.1New England BiolabsB7202ST4 T4 Tampón de ADN polimerasa
de secuenciación DNA Library Mix de , metálico 616201 , grado de

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