Con frecuencia se alteran mecanismos epigenéticos en glioma. Inmunoprecipitación de cromatina podría utilizarse para estudiar las consecuencias de las alteraciones genéticas en gliomas que resultan de cambios en las modificaciones de las histonas que regulan la transcripción de la cromatina estructura y gene. Este protocolo describe inmunoprecipitación de cromatina nativa de neuroesferas de tumor de cerebro murino.
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Artículo de método
Inmunoprecipitación de cromatina nativa usando neuroesferas del Tumor de cerebro murino
En este artículo
Resumen
Resumen
Las modificaciones epigenéticas pueden participar en el desarrollo y progresión de la glioma. Cambios en la metilación y acetilación de promotores y regiones reguladoras de oncogenes y supresores del tumor pueden conducir a cambios en la expresión génica y juega un papel importante en la patogenesia de los tumores cerebrales. Inmunoprecipitación de cromatina nativa (ChIP) es una técnica popular que permite la detección de modificaciones u otras proteínas estrechamente ligadas a ADN. En contraste con reticulado ChIP, chip nativo, las células no son tratadas con formaldehído a enlace covalente proteínas al ADN. Esto es ventajoso porque a veces reticulación puede fijar las proteínas que interactúan con el ADN sólo transitoriamente y no tienen significación funcional en la regulación génica. Además, los anticuerpos son criados generalmente contra péptidos no fijadas. Por lo tanto, especificidad de anticuerpo aumenta en viruta nativa. Sin embargo, es importante tener en cuenta que ChIP nativo sólo es aplicable para el estudio de las histonas u otras proteínas que se unen firmemente a la DNA. Este protocolo describe la inmunoprecipitación de la cromatina nativa de neuroesferas de tumor de cerebro murino.
Introducción
Eventos epigenéticos en los gliomas son frecuentes y probablemente juegan un papel importante en la patogénesis del tumor. De hecho, en el glioma pediátrico de alto grado, las mutaciones en genes que codifican variantes de la histona H3.3 y H3.1 ocurren con frecuencia1. Las mutaciones afectan a modificaciones de las histonas y tienen importantes consecuencias epigenéticas2,3. En el adolescente a adulto espectro, mutaciones recurrentes en el gene de la deshidrogenasa de isocitrato (IDH1/2), 1/2 una mutación que inhibe la histona dependiente de α-KG y de-methylasaes de ADN y alteraciones ....
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.
1. generación de tumor cerebral NS y las condiciones de cultivo.
- Preparar medio de células madre neurales (NSC) de Dulbecco modificado Eagle medio/F12B27 suplemento (1 x) suplemento de N2 (1 x) y un reactivo antimicrobiano. Suplemento medio de NSC en el día de uso con factor de crecimiento endotelial recombinante humano (EGF) y factor de crecimiento fibroblástico básico (FGF) a una concentración final de 20 ng/mL de cada una.
- Inducir el tumor de cerebro de ratón utilizando el ....
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Resultados
Una representación esquemática del tumor NS generados a partir de un tumor cerebral donde las células del tumor cerebral son Katushka positivo se presenta en la figura 1. Figura 2 es una representación esquemática de la técnica de ChIP toda. Figura 3 muestra los resultados representativos de la cromatina de tumor cerebral NS digerido con MNase de 12 min, dando una mayoría de mono, di y tri-nucleosoma.......
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Discusión
El protocolo que presentamos le permitirá al usuario realizar ChIP nativo en NS derivado de tumores cerebrales mediante ingeniería genética. En contraste con cross-linking el ChIP, este protocolo es limitado para el estudio de las proteínas que se asocian estrechamente con ADN6. El número de células utilizadas puede modificarse según sea necesario y el protocolo puede ampliarse. Se utilizaron 1 X 106 células por IP, sin embargo, ChIP nativo también se puede realizar con tan poco como 4 .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los institutos de salud nacional Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y derrame cerebral (NINDS/NIH) subvenciones R37-NS094804, NS074387 R01, R21-NS091555 a M.G.C.; NIH/NINDS becas R01-NS076991, NS082311 R01 y R01-NS096756 de P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; el Departamento de Neurocirugía; Lea, corazones felices y Chad aunque Fundación a M.G.C. y P.R.L. RNA biomedicina Grant F046166 a M.G.C. F.M.M. es apoyado por un F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. es apoyado por los NIH / NIGMS conceder 5T34GM007821-37.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Bioanalizador | Agilent | G2946-90004 | bioanalizador |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerado | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 |
| ratón Cloruro de calcio | Aldrich | 22350-6 | reactivo tampón |
| D-Luciferina, Sal de potasio Goldbio | LuckK-1g | ||
| Bastidor magnético DiaMag1.5 | Diagenode | B04000003 | para lavados magnéticos de perlas |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotador |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | Componente NSC |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | perlas magnéticas de proteína |
| A Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | proteína G perlas magnéticas |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | preparar 20 μ g/mL de stock en 0.1% BSA y alícuota. |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma | E-4884 | reactivo tampón |
| etilenglicol-bis(β-aminoetílicoéter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético) (EGTA) | Sigma | E-4378 | reactivo tampón |
| Fast SYBR Green Master Mix | 4385612 | qPCR | Applied Biosystems |
| Suero fetal bovino | Gibco | 10437028 | para la congelación de células |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Preparar 20 μ g/mL de stock en 0.1% BSA y alícuota. |
| Pinzas | Fine Science Tools | 11008-13 | para la disección de tumores |
| Glicerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | solución salina equilibrada |
| Fluriso | VETone | 501017 | anestésico inhalatorio |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | sistema de imagen óptico in vivo |
| Hyqtase HyClon | Medios de desprendimiento de células | SV3003001 | |
| cloruro de litio | Sigma | L8895 | reactivo tampón |
| Microtubos de baja unión | Corning Costar | CLS3207 | tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas Tubo |
| microcentrífuga | Fisher | 21-402-903 tubo de | microcentrífuga regular |
| Micrococcal Nucleasa | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | cada lote puede diferir; compre una cantidad suficiente para experimentos y alícuota. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC componente |
| Conejo normal IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | agente antimicrobiano, uso a 0,1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | reactivo tampón |
| Kimble Kontes Pellet Mortle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Cóctel inhibidor de proteasa | Sigma-Aldrich | P8340 | alícuota y almacenamiento a -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | hace un caldo de 10 mg/mL en agua; alícuota y almacene a -20 °C. |
| Kit de purificación de PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | kit de purificación de ADN |
| Bisturí | Fine Science Tools | 10007-16 | para la disección de tumores |
| Cloruro de sodio | VWR | 0241-5KG | reactivo tampón |
| Desoxicolato de sodio | Sigma-Aldrich | D670-25G | reactivo tampón |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma | L-4390 | reactivo tampón |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | reactivo tampón |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 éter de | octilfenilo de polietilenglicol |
| Mini centrífuga estándar | Fisherbrand | 12-006-901 | Mini centrífuga estándar |
| SZX16 microscopio | Olympus | SZX16 | microscopio de disección fluorescente |
| Sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 con biosistemas rápidos aplicados en bloque de 96 pocillos | 4453535 | ||
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Referencias
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma th....
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Reimpresiones y permisos
