Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química

Summary

Hemos diseñado la proteína de la cápside del virus de la hepatitis E como una nanopartícula de teranosis (HEVNP). HEVNP uno mismo-monta en una jaula icosaédrica estable en la prestación de la mucosa. Aquí, describimos la modificación de HEVNPs para el tumor por mutando residuos superficie expuesta a las cisteínas, que conjugan sintético ligandos que se unen específicamente a las células del tumor.

Abstract

Virus-como partículas (VLPs) se han utilizado como nanocarriers para mostrar epítopos extranjeros y/o entregar pequeñas moléculas en la detección y tratamiento de diversas enfermedades. Esta aplicación se basa en la modificación genética, uno mismo-Asamblea y verbal de la cisteína para cumplir con la aplicación de metas de tumor de VLPs recombinantes en comparación con genética verbal solo, químicos de la modificación de péptidos extraños a VLPs ofrece una significativa ventaja ya que permite una variedad de entidades, tales como péptidos sintéticos u oligosacáridos, al ser conjugado con la superficie de VLPs de forma modular y flexible, sin alteración de la Asamblea VLP.

Aquí, nos muestran cómo utilizar la hepatitis E virus nanopartícula (HEVNP), una cápsula de teranosis modular, como un portador de múltiples funciones de la entrega. Funciones de HEVNPs incluyen metas de tejido, imágenes y entrega terapéutica. Basado en la investigación estructural bien establecida de HEVNP, los residuos estructuralmente independientes y superficie expuesta fueron seleccionados para el reemplazo de cisteína como Conjugación de grupos químicos maleimida vinculado mediante enlaces tiol-selectivo. Una particular cisteína-modificado HEVNP (un reemplazo de Cys de la asparragina en el 573 aa HEVNP - 573C) conjugado con un ligando de célula-específica de cáncer de mama, LXY30 y etiquetados con el infrarrojo cercano (NIR) fluorescencia tinte (Cy5.5), representación dirigida por el tumor HEVNPs como cápsulas diagnóstico eficaces (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Estrategias similares de ingeniería pueden ser empleados con otros complejos macromoleculares con estructuras atómicas conocidas para explorar posibles aplicaciones en la entrega de la teranosis.

Introduction

El desarrollo de vectores de tamaño nanométrico en entrega diagnóstica y terapéutica, conocidas como nanotheranostics, ha cambiado mucho el campo biomédico de tratamientos generalizados hacia entrega específicas¹. Entrega de nanotheranostic objetivo integra vectores de tamaño nanométrico (nanopartículas) con moléculas de teranosis para dirigir estable teranosis moléculas específicas del tejido enfermo o vía bioquímica^2,3,4 . Nanomedicina ha llegado a la vanguardia de entrega específica porque óptimo tamaño de nanopartículas tienen la capacidad para est....

Protocol

1. HEVNP producción en células de los insectos

Nota: Todos los pasos siguientes deben realizarse en una campana de cultivo celular. Consulte nuestra publicación anterior para más HEVNP producción procedimientos¹¹.

1. Las células Sf9 en medios celulares de insectos (véase Tabla de materiales) a 50-75% confluencia en placas de 6 pocillos de cultivo.
2. Utilizando reactivos de transfección de células de insectos según los protocolos del fabricante, transfectar Bacmids con HEVNP - 573 C ORF2 en células Sf99 para producir baculovirus recombinante. Incube las células transfected a 27 ° C dura....

Results

Similar a HEV-VLPs, Cys todos modificado soluble cápsida icosaédrica formadas HEVNPs y no se agregan en la solución durante la producción o purificación. Antes y después de conjugación solo paso maleimida-biotina, cada una de las Cys modificado HEVNPs eran indistinguibles de HEV-VLPs en la tinción negativa de EM (figura 2). Eficiencia de conjugación de maleimida-biotina para Cys HEVNPs modificadas fue probaron con Western Blot mediante Unión quimioluminiscent.......

Discussion

En contraste con el procedimiento de ingeniería genética desperdiciador de tiempo, que generalmente toma semanas, aquí demostramos dos simple pasos y procedimientos de química verbal un solo paso, que pueden terminar dentro de 3 días, de añadir el cáncer dirigidos a ligando o tinte de detección de fluorescencia a los sitios de Cys/Lys de HEVNPs. La técnica puede ser usada para detectar el mejor destino de ligando de un grupo de candidatos y así se aprovecha de los servicios de síntesis de pequeños péptidos disponibles mo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unidades de diálisis MINI, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini unidad de diálisis
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	células Tn5
células SF9	Thermo Fisher Scientific	11496015	células Sf9
Sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Sistema de expresión
de baculovirus Sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac	Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	insecto medio celular
Cy5.5 NHS éster, 5 mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS ester
Zeba Columnas de desalinización de espín, 40K MWCO, 0,5 mL	Thermo Scientific	87766	columna de desalinización de espín
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	Centrífuga ultraclara MES
Tubos de ultracentrífuga de pared delgada	Beckman Coulter, Inc	Depende del rotor	tubo de ultracentrífuga
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS gel de proteínas Reactivo
Cellfectin II Reactivo	transfección	Thermo Fisher Scientific	10362100
EMS Glow Discharger	Microscopy Electrónica Science