Colección de tejido adiposo ratón y procesamiento para el análisis de ARN

Resumen

El objetivo de este trabajo es presentar un procedimiento paso a paso para recoger diferentes tejidos adiposos blancos de ratones, procesar las muestras de grasa y extracto de RNA.

Resumen

En comparación con otros tejidos, tejido adiposo blanco tiene un contenido considerablemente menos RNA y proteína para aplicaciones posteriores como PCR en tiempo real y Western Blot, ya que en su mayoría contiene lípidos. Aislamiento de RNA de las muestras de tejido adiposo también es un reto como pasos adicionales son necesarios para evitar estos lípidos. Aquí, presentamos un procedimiento para recoger tres anatómicamente diferentes blancos los tejidos adiposos de los ratones, para procesar las muestras y realizar aislamiento de RNA. Además describimos la síntesis del cDNA y del gene experimentos de expresión usando PCR en tiempo real. El protocolo aquí descrito permite la reducción de la contaminación de pelo y sangre en almohadillas de grasa, así como la contaminación cruzada entre diferentes cojines gordos durante la recogida de tejido del animal. También se ha optimizado para garantizar la adecuada cantidad y calidad del ARN extraído. Este protocolo puede ser ampliamente aplicada a cualquier modelo de ratón donde las muestras de tejido adiposo son requeridas para experimentos de la rutina como PCR en tiempo real pero no está diseñado para el aislamiento de cultivos celulares de adipocitos primarios.

Introducción

La obesidad es una epidemia en todo el mundo que puede conducir a complicaciones tales como tipo 2 diabetes¹. Modelos animales obesos y modificados genéticamente inducida por la dieta se utilizan con frecuencia para la investigación en la obesidad y sus complicaciones asociadas. Tradicionalmente, el tejido adiposo blanco es conocido como un compartimiento de almacenamiento para el exceso de energía y sobre todo se compone de lípidos y tejido adiposo marrón convierte la energía en calor^2,3. Tejido adiposo es dinámico y ampliará y encogen dependiendo de muchos factores como el consumo de ....

Protocolo

Cuidado de los ratones utilizados en los procedimientos de cumplimiento de normas para el cuidado y uso de animales de experimentación establecida por el Consejo Canadiense para la protección de los animales. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de cuidado Animal y uso en el centro de investigación CHUM.

1. autopsia y colección de tejido adiposo de los ratones macho

1. Hacer grupos experimentales según objetivos del estudio. En este estudio, se recolectaron muestras de dos grupos de ratones machos en un fondo de C57Bl/6 (n = 12-14/grupo). Asegúrese de que ratones utilizados aquí son 12-15 semanas de edad y se ....

Resultados

Siguiendo el procedimiento de necropsia, tres tejidos adiposo blanco fueron recogidos y ponderados de los dos grupos de ratones (N y HF alimentados con dieta). Como era de esperar, ratones en la dieta HF habían aumentado peso final y ganancia de peso en comparación con hermanos de camada en dieta de N (tabla 1). Estas observaciones fueron acompañadas por más de un aumento de 2 dobleces en el peso de la PGF, el PRF y el SCS en ratones obesos en comparación con aquellos en .......

Discusión

Siguiente HF-dieta alimentación, encontraron a ratones obesos tengan más cuerpo y peso del tejido adiposo blanco en comparación con ratones alimentados con una dieta de N. RNA extraído con fenol solución rindió muestras de buena pureza. La leptina es un adipoquinas producidas principalmente por el tejido adiposo y se sabe que correlacionan positivamente con la masa grasa¹⁶. Como se esperaba, la expresión de mRNA de leptina aumentó en ratones obesos en concomitancia con su masa grasa.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 mL de seringes
1X solución TE (10 mM de Tris-HCl y 1 mM de EDTA• Na2. pH 8.0)
Agujas de 22 G Agujas
de 26 G
			75%
Calentador de bloque (baño seco)
Cloroformo	Sigma	C2432-500mL
dATP	Termo científico	R0141
dCTP	Termo científico	R0151
dGTP	Thermo scientific	R0161
DNasa I (1 U/µ l)	Termo científico	EN0521
dTTP	Thermo scientific	R0171
Faststart Universal SYBR green Master (Rox)	Roche	4913922001
Faststart universal SYBR green master (Rox) colorante fluorescente	Roche	4913914001
Pinzas de puntas
	Instrumentarium	HB275
gasa
Dieta
para roedores con alto contenido de grasa	Bio-Serv, Frenchtown, NJ	F3282
Isopropanol	Laboratoire MAT	IH-0101
Imprimación de PCR directa de leptina (5'-GGGCTTCACCACCATTGA-3') 10 uM
Cebador de PCR inversa de leptina (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 uM
Nitrógeno
Máxima transcriptasa inversa (enzima y tampón 5x)	Thermo scientific	EP0742
Agua nanopura (denominada agua ultrapura)
Guantes de examen de nitrilo Guantes
			nitrilo
Dieta normal para roedores	Harlan Laboratories, Madison, WI	Harlan 2018
P1000 pipetman
P2 pipetman
P20 pipetman
P200 pipetman
Solución de fenol (TRIzol)	Ambion Life Technologies	15598018
Papel
			espectrofotómetro de cuarzo
Rack para tiras de tubos de
Racks para tiras de tubos de RT-PCR
aleatorios	Invitrogen	58875
Sistema genético de rotor de PCR en tiempo real	Corbett research	RG-3000 Rotor-Gene termociclador
			refrigerada de sobremesa
RiboLock Inhibidor de RNasa	Thermo scientific	EO0381
Tubos eppendorf de 1,5 mL sin RNasa Tubos
con tapón de rosca de 1,5 mL sin RNasa Tiras
de tubos de PCR (0,2 mL) y tapones sin
RNasa Agua sin RNasa	Hyclone	SH30538.02
Máquina RT-PCR	Qiagen	Rotor-Gene Corbett 3000
RT-PCR tiras (0,1 mL) y tapas
S16 cebador de PCR directo (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM
S16 cebador de PCR inversa (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') Espectrofotómetro de 10 uM
	Biochrom	Ultrospec 3100 pro
Mortero
Almohadillas quirúrgicas	Hecho en casa una tabla de espuma envuelta en una almohadilla
Tijeras quirúrgicas	Instrumento	130.450.11
Termociclador
Termociclador	Biometra	Termociclador
			de vórtice
Espátula de

Etanol filtradas Martillo de líquidodede aluminio preidentificadoCubeta dePCR Hexámeros Centrífuga de acero inoxidableabsorbente desechableMezclador pesaje