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Artículo de método

Visualización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos en la sinapsis inmune de células B mediante microscopía de emisión (STED) el agotamiento

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DOI:

10.3791/57028

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9 de abril de 2018

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo para el uso de microscopia de STED simultáneamente las estructuras de actina imagen, microtúbulos y proteínas microtubule plus final en las células de B que se han diseminado en cubreobjetos recubierto con anticuerpos contra el receptor de células B, un modelo para la fase inicial de formación de la sinapsis inmune.

Resumen

Las células de B que se unen a los antígenos de membrana (p. ej., en la superficie de una célula presentadora de antígeno) forman una sinapsis inmune, una estructura celular especializada que optimiza la señalización de receptores (BCR) de células B y adquisición de antígeno mediada por BCR. La remodelación del citoesqueleto de la actinia y la reorientación de la red de microtúbulos hacia el sitio de contacto del antígeno son esenciales para la formación de la sinapsis inmune. Remodelación del citoesqueleto de actina en un anillo denso periférico de la F-actina se acompaña de polarización del centro organizador de microtúbulos hacia la sinapsis inmune. Proteínas de microtúbulos plus final, así como proteínas cortical final plus captura median interacciones físicas entre los citoesqueletos de actina y microtúbulos, que permitan reorganizar de manera coordinada. Elucidar los mecanismos que esta reorganización del citoesqueleto, así como entender cómo estas estructuras citoesqueléticas forma formación de sinapsis inmune BCR de señalización, de control pueden proporcionar nuevas visiones en la activación de la célula de B. Esto ha sido ayudado por el desarrollo de enfoques de microscopía de superresolución que revelan nuevos detalles de organización en red citoesquelética. Aquí describimos un método para el uso de microscopia de agotamiento (STED) emisión estimulada simultáneamente las estructuras de actina imagen, microtúbulos y transfected microtúbulos tagged GFP plus final proteínas en las células de B. Para modelar los acontecimientos tempranos en la formación de sinapsis inmune, permitimos que las células de B untar en cubreobjetos recubierto con anticuerpos de anti-inmunoglobulinas (anti-Ig), que inician BCR señalización y remodelación del citoesqueleto. Ofrecemos protocolos paso a paso para expresar proteínas de la fusión de GFP en células de linfoma B de A20, para la difusión de anti-Ig-inducida de la célula y para la fijación posterior de la célula, Immunostaining, adquisición de imágenes y pasos de deconvolución de imagen. Las imágenes de alta resolución obtenidas mediante estos procedimientos permiten visualizar simultáneamente estructuras de actina, microtúbulos y las microtúbulos plus final proteínas que pueden vincular estas dos redes citoesqueléticas.

Introducción

Cuando las células B se unen a polarizado matrices de antígenos (por ejemplo, aparece en la superficie del antígeno que presenta las células (APCs)), el resultante receptor de células B (BCR) la formación de una estructura de la sinapsis inmune clásico, que era el primer descrita en las unidades de señalización T las células1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inicialmente, micromasas de forma de BCR antígeno-limita en la periferia del sitio contacto B celular: APC. Estas micromasas luego moverse hacia el centro del sitio contacto antígeno, donde ellos se fusionan en un grupo central de activación supramolecular (cSMAC) que forma la base de la sinapsis inmune. Formación de sinapsis inmune optimiza el BCR señalización y facilita la extracción de antígeno mediada por BCR de membrana APC14. Esta adquisición de antígeno, que es seguida por internalización mediada por BCR antígeno y el antígeno subsecuente procesamiento, permite a las células B presentan péptido: MHC complejos II a las células T y obtener ayuda de la célula de T14. Porque promueve la formación de sinapsis inmune activación de células B, elucidar los mecanismos que establecen que este patrón funcional de la organización del receptor puede proporcionar nuevas penetraciones en la respuesta inmune humoral cómo se inició y regulados.

Reorganización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos es esencial para la formación de la sinapsis inmune. BCR localizado señalización estimulada por una variedad espacial polarizado de antígenos induce la rápida y espectacular remodelación del citoesqueleto actina1,15. La formación de estructuras dendríticas de la actina en la periferia de la célula de B ejerce fuerzas de empuje en la membrana plasmática y promueve la difusión de la célula de B. Esto permite a la célula de B explorar un área mayor de la superficie de cojinete de antígeno y aumenta el número de BCR que se unen antígeno y activar vías de señalización del BCR. Al mismo tiempo, la COMT y la red de microtúbulos son reorientados hacia el sitio de contacto del antígeno. Como el MTOC aproxima el sitio de contacto del antígeno, los microtúbulos que emanan de la COMT se extienden a lo largo de la cara interna de la membrana plasmática en la interfase entre la célula de B y la superficie de cojinete de antígeno16,17. Estos microtúbulos juxtamembrane pueden entonces actuar como vías para el movimiento centrípeto de antígeno-limita BCR micromasas18, conduciendo a la formación de un cSMAC mediado por dineína.

La reorientación y la polarización de la COMT hacia la sinapsis inmune requiere actina intacto y citoesqueletos de microtúbulos y a menudo depende de las interacciones entre la actina cortical red y microtúbulos16,17, 19,20. Proteínas de unión a actina corticales, como IQGAP1, pueden capturar microtúbulos interactúan con complejos proteínicos que decoran los microtúbulos más extremos21. Estos dinámicos complejos de proteínas final plus incluyen EB1 y CLIP-170, que se refieren colectivamente como microtúbulos plus-final seguimiento de proteínas (+ consejos)21,22. + Puntas en los extremos de los microtúbulos pueden atar a las proteínas que están asociadas con la membrana plasmática o con el citoesqueleto de actina cortical. Esto permite mecanismos de generación de fuerza (p. ej., al final menos dirigió movimiento de dineína cortical anclados a lo largo de los microtúbulos) ejercen fuerzas de tracción en microtúbulos, y así reposicionar el MTOC. CLIP-170 puede unir a la proteína de andamiaje de actina asociados IQGAP123, y hemos demostrado que ambas de estas proteínas son necesarios para la polarización inducida por el BCR MTOC hacia la sinapsis inmune17. Esta interacción IQGAP1-CLIP-170 puede jugar un papel clave en la coordinación de la remodelación del citoesqueleto de actina con la reposición de la red de microtúbulos en la sinapsis inmune de células B.

Microscopía de fluorescencia convencional ha puesto de manifiesto la dramática reorganización de los citoesqueletos de actina y microtúbulos en células B sinapsis inmune formación2. Sin embargo, este enfoque no puede resolver estructuras celulares pequeños detalles debido al límite de difracción de la luz, que, conforme a la ley de Abbe, depende de la longitud de onda de la luz utilizada para iluminar la muestra y la abertura del objetivo24. Este límite de difracción limita la resolución de los microscopios de luz convencionales a 200-300 nm en la dirección lateral y 500-700 nm en la dirección axial25. Por lo tanto, pequeñas estructuras subcelulares, así como los detalles de los citoesqueletos de actina y microtúbulos, sólo se pudieran observar mediante microscopía electrónica. Proyección de imagen de microscopia electrónica del citoesqueleto es lento, requiere protocolos de fijación y preparación muestra áspero que pueden alterar las estructuras biológicas y se limita a la detección de anticuerpo-mediada. La habilidad de immunostain y simultáneamente imagen múltiples proteínas o estructuras celulares es una ventaja sustancial de microscopía de fluorescencia. Además, la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en las células permite la proyección de imagen en tiempo real y es útil cuando no hay anticuerpos efectivos para la inmunotinción de la proteína de interés.

Recientes avances tecnológicos en microscopía de superresolución superar los límites de la difracción de la luz y permite la visualización de las estructuras celulares de nanoescala24. Una tal técnica de microscopía de resolución súper se llama estimulante de la emisión (STED) agotamiento de la microscopia. STED utiliza dos rayos láser, donde un láser excita el fluoróforo y un segundo láser con un patrón en forma de dona suprime selectivamente la emisión de fluorescencia en el fluoróforo. Esto reduce la función de punto de extensión (área aparente) de una sola partícula fluorescente y proporciona una secundario-difracción límite imagen fluorescente25,26. Microscopía-estado de agotamiento también emplea técnicas basadas en fluorescencia para adquirir imágenes de súper resolución. Sin embargo, los tiempos de adquisición y reconstrucción de imágenes largos, hay sólo un número limitado de fluoróforos que pueden utilizarse y la proyección de imagen alta resolución simultánea de múltiples componentes citoesqueléticos técnicamente es difícil porque mantener estructuras de actina y microtúbulos requiere fijación diferentes procedimientos. Por lo tanto, STED tiene múltiples ventajas sobre la microscopía electrónica y otra microscopía de superresolución enfoques que ofrece la adquisición de imágenes rápido, tiene requisitos mínimos del post-processing y emplea el mismo fluoróforos y técnicas de tinción se utilizan para microscopía de fluorescencia convencional de muestras fijadas26.

Microscopia de la estupendo-resolución ya ha sido utilizada para visualizar estructuras de actina en la sinapsis inmune en células de naturales del asesinas (NK) y26,de las células de T27,de29,de28,30, 31. sin embargo, la proyección de imagen de súper-resolución del citoesqueleto de microtúbulos, así como la reorganización coordinada de los citoesqueletos de actina y microtúbulos durante la formación de la sinapsis inmune, sólo recientemente ha sido reportado17. Se utilizó la microscopia de STED a imagen B células que habían sido autorizadas a difundir en cubreobjetos recubierto con anticuerpos de anti-inmunoglobulinas (anti-Ig), que estimulan el BCR señalización e inician la reorganización del citoesqueleto. Cuando plateado en anticuerpos anti-Ig inmovilizados, las células de B se someten a dramático dependiente de actina que se separa, que recapitula los acontecimientos iniciales durante la formación de la sinapsis inmune. Lo importante, microscopia de STED reveló los detalles del anillo dendrítico de la F-actina que forma en la periferia de la inmune sinapsis y demostró que la COMT, como los microtúbulos Unidos a él, se habían movido cerca el contacto antígeno del17. Estos microtúbulos se extendieron hacia fuera hacia el anillo periférico de la F-actina. Por otra parte, la proyección de imagen de STED multicolor de varias combinaciones de F-actina, tubulina, IQGAP1 y GFP-tagged CLIP-170 + consejos demostraron que microtúbulos plus-extremos marcados por CLIP-170-GFP eran estrechamente relacionados con la red de actina periférica y IQGAP1, un captura de cortical proteína17.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para la proyección de imagen los citoesqueletos de actina y microtúbulos en la sinapsis inmune usando microscopia de STED. Estos métodos han sido optimizados utilizando la línea A20 de células B murinas, que ha sido ampliamente empleada para el estudio de BCR señalización y formación de sinapsis inmune17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. porque anticuerpos comerciales para CLIP-170 no funcionó bien para la inmunotinción en experimentos anteriores, describimos en detalle la expresión de GFP-tagged CLIP-170 en celdas A20, junto con protocolos para visualizar simultáneamente hasta la coloración tres componentes citoesqueléticos o proteínas citoesqueleto asociadas. Métodos para el uso de microscopia de STED a actina imagen en sinapsis inmunes de la célula NK han sido descritos40. Aquí, nosotros extendemos esta adquisición de imágenes de múltiples colores súper resolución de citoesqueletos la actina y los microtúbulos en las células de B.

Una consideración crítica para microscopía de superresolución está utilizando los procedimientos de fijación adecuado para mantener las estructuras celulares y prevenir el daño a las proteínas fluorescentes. La fijación y tinción métodos presentados en este documento han sido optimizados para retener la fluorescencia de GFP y proporcionar imágenes de alta resolución de las redes de actina y microtúbulos. Cuando la expresión de proteínas fluorescentes, debe señalarse que las células B son generalmente difíciles de transfectar. Mediante este protocolo, 20-50% de A20 células típicamente expresan la proteína de la fusión de GFP transfected, y entre esta población los niveles de expresión de la proteína son variables. Sin embargo, la proyección de imagen de súper-resolución de actina y microtúbulos mediante los procedimientos que describimos es bastante robusta y fácilmente se obtienen imágenes de alta calidad. A pesar de su pequeño tamaño en relación con las células de la A20, nos muestran que estos procedimientos también pueden utilizarse para la red de microtúbulos en las células B primarias que han sido activados brevemente con lipopolisacárido (LPS) de la imagen. Hemos demostrado que las células primarias de LPS activa B pueden ser transfectadas con siRNAs con relativamente alta eficiencia (es decir, tal que agotamiento de proteínas se puede detectar por immunoblotting), haciendo que una buena alternativa a la utilización de líneas de células B para algunos estudios 17.

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Protocolo

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por la Universidad de Columbia Británica Comité de cuidado de animales.

1. expresión de proteínas de la fusión de GFP en células de linfoma B de A20

  1. Células en cultivo A20 en completan Medio RPMI (RPMI-1640 suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS), 50 μm 2-Mercaptoetanol, glutamina 2 mM, piruvato de 1 mM, 50 U/mL de penicilina y estreptomicina 50 de μg/mL) a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos con 5 % CO2.
  2. Preparar el reactivo de transfección (véase la Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante.
    Nota: Este protocolo ha sido optimizado para los reactivos específicos y Protocolo de la transfección se describe en la Tabla de materiales. Otros reactivos de transfección que hemos intentado no han producido suficiente eficacia de transfección.
  3. Contar las células usando un hemocitómetro. Células de6 A20 centrífuga 2,5 x 10 (para cada transfección) por 5 min a x 525 g. resuspender las células en 100 μl de reactivo de transfección que contienen 1-2,5 μg de ADN plásmido. Para el ADN codificación CLIP-170-GFP23, utilizar 2,5 μg por transfección. Mezclar suavemente.
  4. Transferir las células a un pozo de una placa de 6 pozos y ajustar el volumen de 2 ml con el Medio RPMI completo precalentado. Las células de 18 h a 37 ° C para permitir la expresión de la proteína de la cultura.

2. aislamiento de células primario de ratón B y activación con LPS

  1. Uso de herramientas quirúrgicas esterilizadas para extirpar el bazo de un ratón, siguiendo protocolos de actuación aprobados por el Comité de cuidado de animales de la institución.
  2. En la campana de cultivo de tejidos, coloque un filtro de célula estéril 70 μm en un plato de cultivo de tejidos de 35 mm que contiene 3 mL de PBS estéril temperatura ambiente. Use la parte de goma del émbolo de una jeringa de 5 ml para triturar el bazo a través de la coladera de la célula.
  3. Pipetear la suspensión unicelular de splenoctyes en un tubo de 15 mL estéril y centrifugar a 525 x g durante 5 minutos.
  4. Uso un aislamiento magnético basado en el grano de la célula de B kit (véase Tabla de materiales) para obtener una población altamente enriquecida de las células de B.
  5. Resuspender las células B a 3 x 106/ml de Medio RPMI completo suplementado con 2,5 μg/mL LPS más factor (BAFF, una citoquina de supervivencia) de activación de células B de 5 ng/mL.
  6. Las células de la cultura durante 6 h a 37 ° C.

3. capa de vidrio cubreobjetos con anticuerpos Anti-Ig

  1. Preparar la solución de anticuerpo para el revestimiento de los cubreobjetos. Diluir la solución madre de anticuerpos de cabra anti-mouse Ig en PBS estéril temperatura para hacer un 12,5 μg/mL de solución; 400 μL de solución de anticuerpo se requiere para cada cubreobjetos.
    Nota: Uso cabra anti-ratón IgG para las celdas A20; Utilice cabra anti-ratón IgM de las células B primarias. Anticuerpos de cabra IgG no se unen a receptores de Fc de ratón. Sin embargo, para evitar cualquier posible atascamiento del receptor de Fc, se puede utilizar F(ab) o F(ab')2 fragmentos de anti-ratón IgG o anticuerpos de anti-ratón IgM.
  2. Sumerja un cubreobjetos de vidrio redondo de 18 mm #1.5 en metanol al 100% y dejar secar completamente (~ 10 min).
  3. Utilizando pinzas, coloque un cubreobjetos seco un cultivo de tejidos 12-bien placa y pipetee 400 μL de la 12.5 μg/mL anticuerpos solución (5 total μg, 2 μg/cm2) sobre el cubreobjetos para que forma una burbuja en el centro del cubreobjetos y se extiende a los bordes.
  4. Tenga cuidado de cubrir el cubreobjetos todo, pero no permita que la solución de anticuerpo extender más allá del borde del cubreobjetos de vidrio y el plástico de cultivo de tejidos. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  5. Lavar los cubreobjetos por Pipetear 1 mL de PBS estéril en el bien y, posteriormente, aspirando la solución. Repetir dos veces más para eliminar los anticuerpos no Unidos.
  6. Añadir 1 mL de PBS estéril para el bien que contienen cubreobjetos recubiertos de anticuerpos hasta que las células están listas para añadirse.
    Nota: El cubreobjetos pueden conservarse a temperatura ambiente, cubierta con PBS, para su uso en el mismo día.

4. la célula de B que se separa en cubreobjetos recubierto de Ig Anti

  1. Preparar modificado tamponado con HEPES salina (mHBS): 25 mM HEPES, pH 7.2, 125 mM NaCl, KCl, 1 mM CaCl2de 5 mM, 1 mM de Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, dextrosa de 1 mg/mL, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y 50 μm 2-Mercaptoetanol). Filtro esta solución de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
  2. En el día del experimento, hacer 50 mL de mHBS con 2% FBS (mHBS-FBS) añadiendo 1 mL de SFB inactivado con calor a 50 mL mHBS. Caliente la mHBS SBF a 37 ° C antes de usar.
  3. Centrifugar las células transfected A20 o a las células B primarias que habían sido cultivadas con BAFF más LPS 525 x g durante 5 minutos.
  4. Resuspender las células en 1 mL de SBF mHBS, contar las células usando un hemocitómetro y diluir las células a 2 x 105 células/mL en mHBS FBS.
  5. Usando pinzas transfiera el cubreobjetos de la placa de cultivo de tejidos a un pedazo de la película de parafina.
  6. Añadir 250 μl de células de B (5 x 104 células) a cada cubreobjetos.
  7. Incubar el cubreobjetos a 37 ° C durante 15 min en la oscuridad para permitir que las células B para extender por la superficie anti-IgG-revestida.

5. la fijación y el Immunostaining, las células

  1. Preparar la solución de fijación diluyendo la solución madre de paraformaldehído al 16% y la solución glutaraldehído al 50% en agua a temperatura ambiente agua destilada para obtener concentraciones finales de glutaraldehido paraformaldehido y 0.1% de 3%. Preparar la solución de fijación en el día es para ser utilizado y desechar cualquier exceso.
    PRECAUCIÓN: Las soluciones stock paraformaldehido y glutaraldehído deben ser utilizadas en una campana de humos químicos. Siga las instrucciones en la hoja de datos de seguridad del material (MSDS).
  2. Preparar el buffer de permeabilización/bloqueo (BSA 3% y 0,1% Tritón X-100 diluido en PBS). Filtro esta solución de esterilizar y almacenar a 4 ° C. En el día del experimento, calentar la cantidad necesaria a la temperatura ambiente.
  3. Preparar el tampón de tinción (saponina 1% de BSA y un 0.1% en PBS). Esta solución utiliza un filtro μm 0.2 de esterilizar y almacenar a 4 ° C. En el día del experimento, calentar la cantidad necesaria a la temperatura ambiente.
  4. Pipetear 350 μl de la solución de fijación en cada cubreobjetos, asegurando que la superficie está totalmente cubierta. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min en la oscuridad.
  5. Retire la solución de fijación el cubreobjetos aspirando cuidadosamente desde el borde del cubreobjetos con una micropipeta.
    PRECAUCIÓN: La solución de fijación debe ser desechada como residuos químicos peligrosos.
  6. Lavar los cubreobjetos una vez con 500 μl de buffer de permeabilización/bloqueo. Pipeta el líquido.
  7. Permeabilizar y bloquear las células añadiendo 250 μl de buffer de permeabilización/bloqueo a cada cubreobjetos y incubando durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  8. Diluir el anticuerpo anti-tubulina de conejo 1: 100 en tampón de tinción.
  9. Aspirar apagado el buffer de permeabilización/bloqueo del cubreobjetos y añadir 50 μl de la solución diluida del anticuerpo anti-tubulina a cada cubreobjetos. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad.
  10. Preparar la solución de tinción de anticuerpo secundario/actina mediante la dilución del anticuerpo secundario de cabra Alexa Fluor 532-conjugado anti-conejo IgG y phalloidin Alexa Fluor 568 conjugado 1: 100 en tampón de tinción.
  11. Lavar los cubreobjetos 3 veces para quitar exceso de anticuerpo primario por agregar 500 μl de tampón de tinción y luego de aspiración.
  12. Añadir 50 μl de la solución de tinción de anticuerpo secundario/actina a cada cubreobjetos e incubar durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  13. Lavar los cubreobjetos 3 veces para quitar exceso de anticuerpo secundario agregar 500 μl de tampón de tinción y luego de aspiración.
  14. Añadir 10 μl de reactivo de montaje a un portaobjetos de microscopio. Monte el cubreobjetos sobre el portaobjetos con el lado de la celda hacia abajo.
    Nota: Un medio de montaje de "anti-fade" (véase Tabla de materiales) se recomienda para preservar la intensidad de fluorescencia de proteínas de la fusión de GFP. Evitar el uso de reactivos que contiene DAPI, que puede interferir con la proyección de imagen de los fluoróforos cuando se utiliza el láser STED de montaje.
  15. Deje que los portaobjetos se seque durante la noche en la oscuridad. Imágenes de las diapositivas el día siguiente.
    Nota: Las diapositivas de imágenes tan pronto como el cubreobjetos esté seco se recomiendan, como la fluorescencia de GFP disminuirá con el tiempo.

6. proyección de imagen usando el microscopio STED

Nota: Tenga en cuenta que todos los pasos de software se describen a continuación son específicos para el microscopio y el software que utilizamos (véase la Tabla de materiales). Los pasos y configuración necesitará ajustarse si la proyección de imagen se realiza utilizando un microscopio y software diferentes.

  1. En el microscopio STED, activar el láser y lámpara de iluminación epifluorescente y el software del microscopio.
  2. Establecer los parámetros para los lasers de agotamiento de STED.
    Nota: Esto dependerá del microscopio específico se utiliza y los láseres que se equipa. Algunas recomendaciones de configuración es de luz blanca (WLL) 70%; 592 nm láser 80%; 660 nm láser 80%.
  3. Activar los ajustes de STED y alinear los rayos de láser STED usando el objetivo X 100.
  4. Utilizando el ocular, enfoque la muestra y seleccionar una celda con moderada expresión de GFP.
    Nota: Expresión de GFP bajo no aparecerán ya que STED reduce la intensidad de emisión. Por el contrario, la alta expresión de CLIP-170-GFP induce la formación espontánea de grandes grupos, que no reflejan la normal microtubule final plus proteína compleja morfología y distribución. Seleccionando una celda con moderada expresión de GFP es esencial para la proyección de imagen con precisión las estructuras citoesqueléticas en el sitio de contacto del antígeno.
  5. Zoom en la celda seleccionada y elija la región de interés a ser reflejada. Ajustar el enfoque para que el plano x-y de la célula de B que está más cerca el cubreobjetos está en foco.
    1. Para ello, hacia el objetivo progresivamente más cerca el cubreobjetos para que las estructuras citoesqueléticas de células B entran en foco y luego ir fuera de foco. Entonces mueva gradualmente el objetivo en la dirección opuesta hasta que las estructuras citoesqueléticas de células B en primer lugar volver en foco.
  6. Optimizar la configuración, incluida la potencia del láser, haz de excitación y detector gama. Comenzar con la configuración recomendada por el fabricante. Luego hacer los ajustes necesarios para optimizar la señal de las muestras. Todas las muestras a comparar entre sí con la misma configuración de la imagen.
  7. En la pestaña de "adquirir" del software, establece la adquisición de la imagen en adquisición secuencial del marco en el panel inferior izquierdo de "Análisis secuencial" marcando la opción "entre bastidores".
  8. Establecer la secuencia de adquisición.
    Nota: Adquirimos la fluorescencia de GFP en primer lugar con el fin de evitar la degradación de la señal de la GFP.
    Dependiendo de la combinación de fluoróforos que sirven además de GFP, la señal de fluorescencia de longitud de onda más larga de la proyección de imagen primero puede obtenerse mejores resultados. Sin embargo, el orden en que los fluoróforos o proteínas fluorescentes están sujetos a agotamiento de la emisión estimulada y reflejadas debe ser optimizado para obtener las señales de fluorescencia más fuertes y mejor resolución.
  9. Seleccionar y ajustar la potencia del láser STED para cada fluoróforo en la pestaña de "Adquisición" del software y utilice la barra deslizante para 592-nm o el láser 660 STED para ajustar la potencia del láser. Ajustar la potencia para el agotamiento de 592 nm láser para GFP y Alexa Fluor 532. Ajustar la potencia para el láser 660 nm agotamiento para Alexa Fluor 568.
  10. Para aumentar la resolución y reducir la señal de fondo, vaya a la configuración de "Adquisición" en la pestaña de "Adquisición" del software, aumentar la línea marco un promedio mediante la selección de un valor mayor que 1 se puede usar el menú desplegable para cada opción.
  11. También, adquirir la señal fluorescente con STED tiempo cerrada la opción bloquea para el fluoróforo en la pestaña de "Adquirir", y especificando valores para sincronización de tiempo (ver nota más abajo). Aumentar la potencia del láser STED para mejorar la resolución, aunque esto también aumentará el fotoblanqueo de los fluoróforos.
    Nota: El tiempo bloquea necesitará optimizarse para el microscopio, la muestra y fluoróforos se utiliza. Una vez que bloquean de 0.3 a 6 ns se recomienda. Después de la fijación, GFP es particularmente sensible a la energía láser de alta. Para reducir el fotoblanqueo de GFP, sincronización de tiempo se debe aplicar y debe reducirse la potencia del láser STED.
  12. Para capturar imágenes 3D de STED, utilice el control deslizante para cambiar el punto extendido función (PSF) a "STED 3D".
  13. Manualmente adquirir múltiples imágenes para asegurar reproducibilidad. Deconvolve las imágenes (ver figura 1) utilizando un software de deconvolución paquete41(véase Tabla de materiales).

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Resultados

Para las células B separarse en inmovilizado anti-Ig, microscopia de STED utilizada en conjunción con el software de deconvolución proporciona imágenes de resolución más alta de estructuras citoesqueléticas de microscopía confocal. Esto es evidente en la figura 1, donde la red de F-actina se visualizó utilizando el protocolo descrito anteriormente. Una comparación de confocal y STED super-resolución imágenes de la misma muestra demuestra que las imágenes STED...

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Discusión

Imágenes detalladas de estructuras citoesqueléticas pueden obtenerse usando microscopia de STED súper resolución, que teóricamente puede alcanzar una resolución de 50 nm, en comparación con microscopia confocal convencional, para que la resolución de la difracción limitada es de ~ 200 nm 24. la capacidad para resolver las estructuras más finas es aún mayor utilizando software de deconvolución para calcular la posición más probable de la fuente de luz original de la señal observada fluorescencia "b...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a las instalaciones de proyección de imagen del Instituto de Ciencias de la vida de UBC (LSI) para apoyar y mantener el microscopio STED. Este trabajo fue financiado por beca #68865 de los institutos canadienses de investigación en salud (a M.R.G.). Agradecemos al Dr. Kozo Kaibuchi (Universidad de Nagoya, Nagoya, Japón) el plásmido CLIP-170-GFP.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
células < células >
fuerteA20 con linfomaATCCTIB-208Linfoma murino de células B de origen Balb/c que expresa un BCR que contiene IgG en su superficie
RPMI-1640Thermo Fisher Scientific  R0883
Suero fetal bovinoThermo Fisher Scientific 12483020Inactivar el calor a 56 oC durante 30 min
2-mercaptoetanolMillipore SigmaM3148
GlutaminaMillipore SigmaG5763
Piruvato de sodioMillipore SigmaP5280
Penicilina-EstreptomicinaThermo Fisher Scientific 15140122 Liquid, 10.000 unidades
Materiales adicionales para linfocitos B primarios
70-µ filtro de células mCorning352350
Kit de aislamiento de células B a base de perlas magnéticasStemcell Technologies19854EasySep Kit de aislamiento de células B
de ratón Lipopolisacárido (LPS)Millipore SigmaL4391LPS de E. coli 0111:B4
Factor activador de células B (BAFF)R& D Systems2106-BF-010
NameCompanyNúmero de catálogoComentarios
TransfectionCodificación de
plásmido CLIP-170-GFPRegalo del Dr. Kozo Kaibuchi (Universidad de Nagoya, Nagoya, Japón); descrito en Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Reactivos y equipos de transfección recomendados
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003Siga las instrucciones del fabricante para mezclar los reactivos de transfección con el DNA
Amaxa Nucleofector model 2bLonzaAAB-1001Programa L-013 utilizado
Placas de 6 pocillos Falcon, tratadas con TC, estérilesCorning353046
NameCompanyNúmero de catálogoComments
>Coating cubreobjetos
18 mm de diámetro redondo #1.5 cubreobjetosThomas Scientific1217N81Producto similar: Catálogo Marienfield-Superior #117580
PinzasFisher Scientific 1381242Pinza de disección de astillas extrafinas
Falcon Placa de cultivo de tejidos de poliestireno estéril de 12 pocillosCorning 353043
100% metanolFisher ScientificA412-4
Solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesioThermo Fisher Scientific 10010049
Anticuerpo IgG anti-ratón de cabraJackson ImmunoResearch115-005-008Para células A20
Anticuerpo IgM anti-ratónde cabra Jackson ImmunoResearch115-005-020Para células B primarias de ratón
NameCompanyNúmero de catálogoComentarios
Tinción
Paraformaldehído (solución madre al 16%)Electrónica Microscopy Sciences15710Diluir con PBS a concentración de trabajo
Glutaraldehído (solución madre al 50%)Millipore Sigma340855Diluir con PBS a concentración de trabajo
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
SaponinaMillipore SigmaS2149
Albúmina sérica bovina (BSA), fracción VMillipore Sigma 10735094001
Anticuerpo anti-tubulina de conejoAbcamab52866recomienda una dilución 1:250, pero debe optimizarse
Alexa Fluor 532 conjugada contra cabra anti-conejo IgGThermo Fisher ScientificA11009Se recomienda una dilución 1:100, pero debe optimizarse
Alexa Fluor 568-conjugada con faloidinaThermo Fisher ScientificA12380Se recomienda una dilución 1:100, pero debe optimizarse
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970sin DAPI
Portaobjetos de microscopio Superfrost PlusFisherbrand Fisher Scientific12-550-15
NombreEmpresaNúmero de catálogo>Comentarios
>Materiales
ParafilmVWRP1150-2
HEPESMillipore SigmaH3375
NaClFisher ScientificBP358
KClMillipore SigmaP9333
CaCl2Millipore SigmaC1016
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500
MgSO4Fisher ScientificM63
DextrosaFisher ScientificD16-500
NameCompanyNúmero de catálogoComments
Microscopía
Leica SP8 TCS Microscopio STEDSoftware
HuygensScientific Voume ImagingSee https://svi.nl/HuygensProducts
ratón B Se de de deconvolución Leica

Referencias

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