Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Daniel Villarreal; Geetali Pradhan; Chia-Shan Wu; Clinton D Allred; Shaodong Guo; Yuxiang Sun

doi:10.3791/57048

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Artículo de método

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

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DOI:

10.3791/57048

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30 de agosto de 2019

Daniel Villarreal¹ , Geetali Pradhan² , Chia-Shan Wu¹^,² , Clinton D Allred¹ , Shaodong Guo¹ , Yuxiang Sun¹^,²

¹Department of Nutrition and Food Science, Texas A&M University, ²Children's Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine

En este artículo

Resumen

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Resumen

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que produce hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Los islotes consisten principalmente en cinco tipos de células que secretan hormonas: las células secretan el glucagón, las células secretan insulina, las células secretan somatostatina, las células secretan la ghrelina y las células PP secretan polipéptido pancreático. Sesenta al 80% de las células de los islotes son células, que son la población celular más importante para estudiar la secreción de insulina. Los islotes pancreáticos son un sistema modelo crucial para estudiar la secreción de insulina ex vivo. Adquirir islotes de alta calidad es de gran importancia para la investigación de la diabetes. La mayoría de los procedimientos de aislamiento de islos requieren un sitio de inyección de colagenasa técnicamente difícil, procedimientos de digestión agresivos y complejos y pasos de purificación de gradiente de densidad múltiple. Este papel cuenta con un sencillo método de aislamiento de islotes de ratón de alto rendimiento con descripciones detalladas y demostraciones realistas, que muestra los siguientes pasos específicos: 1) inyección de colagenasa P en la ampolla de Vater, un área pequeña que une el conducto pancreático y el conducto biliar común, 2) la digestión enzimática y la separación mecánica del páncreas exocrino, y 3) un único paso de purificación de gradiente. Las ventajas de este método son la inyección de enzima digestiva utilizando la ampolla más accesible de Vater, una digestión más completa utilizando una combinación de enfoques enzimáticos y mecánicos, y un paso de purificación de un solo gradiente más simple. Este protocolo produce aproximadamente 250—350 islotes por ratón; e islotes son adecuados para varios estudios ex vivo. Las posibles advertencias de este procedimiento son islotes potencialmente dañados debido a la digestión enzimática y/ o incubación prolongada de gradiente, todo lo cual puede evitarse en gran medida mediante una cuidadosa justificación ad del tiempo de incubación.

Introducción

Hay dos métodos comunes en la literatura para el aislamiento de islotes pancreáticos. Se requiere extirpar el páncreas y picarlo en trozos pequeños usando tijeras quirúrgicas, y luego digerirlo en una solución de colagenasa¹^,²^,³. Otro método más preciso es utilizar la red de conductos presentes en el páncreas para introducir enzima digestiva. Los siguientes sitios se han utilizado para la inyección de enzimas digestivas: la unión de la bilis y el conducto quístico, la vesícula biliar en el conducto biliar común o el propio conducto biliar común¹^,<....