Artículo de método

Examinar las conexiones Monosynaptic en Drosophila utilizando canales de sodio Tetrodotoxin resistentes

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DOI:

10.3791/57052

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14 de febrero de 2018

 , 
1Department of Biology, University of Maryland

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un método para probar las conexiones monosynaptic entre neuronas mediante el empleo de tetrodotoxin y el canal de sodio tetrodotoxin resistentes, NaChBac.

Resumen

Aquí, se aplica una nueva técnica denominada Tetrotoxin (TTX) resistencia diseñado para sondeo sinapsis (TERPS) para probar conexiones monosynaptic entre neuronas de destino. El método se basa en la expresión de un activador de transgénico con el canal de sodio tetrodotoxin resistentes, NaChBac, en la neurona presináptica específico. Conexiones con supuestos socios postsinápticos dependen de grabaciones de celulares en presencia de TTX, que bloquea la actividad eléctrica de las neuronas que no expresan NaChBac. Este enfoque puede ser modificado para trabajar con cualquier activador o proyección de imagen de calcio como un reportero de conexiones. TERPS agrega al conjunto creciente de herramientas disponibles para determinar la conectividad en redes. Sin embargo, los TERPS es único en que confiablemente también divulga a granel o transmisión de volumen y derrame transmisión.

Introducción

Una meta importante de la neurociencia es mapear las conexiones entre las neuronas para entender cómo fluye la información a través de circuitos. Numerosos enfoques y recursos se han convertido en disponibles para probar la conectividad funcional entre las neuronas en una gama de modelo sistemas1,2. Para generar los diagramas más precisos utilizando electrofisiología, es importante resolver si las conexiones observadas entre dos células son directos y monosynaptic versus indirecta y polysynaptic. Un estándar de oro para hacer esta distinción en las neuronas mamíferas es medir la latencia entre action potentials solo en las células presinápticas y la aparición de corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) en la segunda neurona. Conexiones monosynaptic deben tener latencias cortas de unos pocos milisegundos y baja variabilidad3. Este enfoque puede ser complicado en invertebrados neuronas porque las sinapsis pueden ocurrir en sus dendritas lejos del sitio de grabación somáticos, provocando retrasos en la detección debido a las distancias largas electrotónicos entre conductancias postsinápticas y la grabación electrodo. Estos retrasos pueden introducir ambigüedad con respecto a poli-versus contribuciones monosynaptic. Además, pequeños eventos sinápticos puede decaer antes de llegar a la página grabaciones somática y conducir la actividad presináptica más fuerte, es probables que contratar eventos polysynaptic.

Han desarrollado varias técnicas para probar las conexiones monosynaptic en invertebrados. Un método utiliza soluciones de cationes divalentes alta (Hi-Di) que contiene exceso de magnesio++ y Ca++. Esta solución bloquea conexiones polysynaptic reduce probabilidad de liberación y aumento umbral potencial de acción a favor de la detección de monosynaptic entrada4,5. Determinar la proporción exacta de Mg++ ++ de CA requiere, sin embargo, no es trivial y polysynaptic contribuciones pueden persistir incluso modesta estimulación6. Un enfoque alternativo denominado reconstitución GFP a través de socios sináptica (GRASP) aprovecha la proximidad entre las membranas previas y postsinápticas en sinapsis para inferir una conexión monosynaptic 7. Aquí, un componente de la proteína verde fluorescente (GFP) se expresa en una neurona, y el fragmento complementario de la molécula se expresa en un supuesto socio postsináptico. La presencia de fluorescencia indica que las dos neuronas están lo suficientemente cerca para permitir la reconstitución de la molécula GFP e implica la existencia de sinapsis. ASIMIENTO puede Informe sinapsis falso, sin embargo, si dos celdas han estrechamente apposed membranas, como en un nervio o fascículo. Variantes del asimiento de eliminan tales falsos positivos por atar el presináptico fragmento de GFP directamente a synaptobrevin, permitiendo así la reconstitución solamente en sinapsis activa8. Mientras que asimiento y sus variantes han sido instrumentales en la determinación de conectividad funcional en la Drosophila del CNS, algunas conexiones pueden no hacerse visibles por comprensión si las distancias entre los socios pre- y postsinápticas es relativamente grande. Esto es particularmente pertinente en la evaluación de la transmisión de volumen asociada a neuromodulación9 o GABAérgicas inhibición10.

Aquí, se demuestra una técnica complementaria y novedosa para probar conexiones monosynaptic directas en Drosophila del CNS. Este método, llamado tetrodotoxina resistencia diseñado para sondeo sinapsis (TERPS), funciona por la coexpresión de la tetrodotoxina (TTX)-canal sodio resistente, NaChBac y un activador de optogenetic en una célula presináptica durante la grabación de la supuesta socios postsynaptic9. En presencia de TTX, se suprime toda actividad mediada por el potencial de acción en células distintas de las que NaChBac. El canal de NaChBac selectivamente restaura la excitabilidad en las celdas presinápticos específicos, permitiendo la transmisión sináptica evocada por la luz. Este método permite la fuerte activación de las neuronas presinápticas, tal que las conexiones se pueden resolver postsynaptically somática grabación mientras reduce la probabilidad de contratar circuitos polysynaptic. Importante, esta técnica permite el estudio de la transmisión de volumen y revela la difusión del transmisor liberado de una sola neurona a lo largo de un circuito. Además, los TERPS puede revelar la naturaleza química de la conexión a través de la farmacología convencional. TERPS es conveniente para el uso en cualquier modelo de sistema que permite la expresión transgénica de los canales de sodio TTX-insensible.

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Protocolo

1. preparar moscas y promotor de GAL4 identificar líneas

  1. Seleccione una línea de promotor de GAL4 y cruzar con las moscas con el transgén de UAS-NaChBac y un transgen de optogenetic para la activación.
    Nota: CsChrimson UAS11 se selecciona debido a su alta conductancia y la facilidad con la cual activa mediada por NaChBac los potenciales de acción. UAS-NaChBac y UAS-CsChrimson están disponibles en el repositorio de las poblaciones de Bloomington.
  2. Preparar todo-trans retinal como una solución en etanol (35 mM) y guardar la solución en el congelador a-20 ° C.
  3. Mix 28 μl de este stock en aproximadamente 5 mL de patata rehidratado escamas alimento y añadir esta mezcla a la parte superior de un frasco de medios convencionales de Drosophila .
  4. Criar moscas adultas expresar csChrimson en alimentos que contienen 0,2 mM all-trans-retinal para 1 – 3 días11.

2. preparar Stock TTX

  1. Crear una solución stock de 1 mM TTX en agua destilada o desionizada. Almacenar esta solución en un refrigerador de laboratorio durante varios meses. Revise las políticas de las instituciones en relación con el almacenamiento de TTX como muchas instituciones clasifican TTX como una sustancia peligrosa o controlada.

3. preparar moscas para electrofisiología

  1. Recoger 1 – 3 días adulto viejo vuela que sobresalen en la comida con todo-trans-retinal.
    Nota: Consulte Murthy y Turner en 2013 para una descripción detallada del parche sujeción Drosophila las neuronas12,13.
  2. Poner las moscas en un vial de centelleo de vidrio. Coloque el frasco en hielo durante 1 minuto inmovilizar a las moscas.
  3. Utilizar pinzas gruesas para insertar una mosca en una cámara de grabación a medida. La cámara consta de un 3 ½" círculo corte láser de acrílico de 1/16". Corte un agujero de ¾" está en el centro donde se une una hoja personalizada con epoxy en 2 partes. La hoja contiene un triangular en forma de esperanza de que la mosca se le introduce.
  4. Aplique cera o epoxi curable UV alrededor del animal para fijarla firmemente dentro de la cámara de grabación.
  5. Iluminar la preparación con un cuello de cisne de fibra óptica para visualización bajo un estereomicroscopio. Fijar las fibras de cuello de cisne para la iluminación oblicua ajustando para que iluminan la marcha directamente desde el lado.
  6. Ajustar el nivel de luz a la posición más baja posible que todavía permite la clara visualización de la mosca. Esta intensidad de la luz variará a través de experimentos individuales.
    Nota: Este protocolo puede ser adaptado mediante el uso de un in situ cerebro explante método14.
  7. Recuperar la solución salina de grabación externos. La solución salina contiene en mM: NaCl 103, 3 KCl, 5 N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoethane-sulfónico, trehalosa 8, glucosa 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1.5 CaCl2y 4 de MgCl2 (ajustado a mΩ 270 – 275). La solución salina es burbujeada con 95% O25% CO2 (carbogen) y cuenta con un pH ajustado a 7.315.
  8. Coloque 4-6 gotas de solución salina de grabación extracelular sobre la preparación de la mosca. En este punto, aumentar el nivel de luz en el microscopio de disección para una mejor visibilidad.
  9. Afilar un alambre de tungsteno mediante electrólisis. Para hacer el cable, preparar una solución saturada de KNO3 y aplicar aproximadamente 20 V de CA corriente sumergir la punta del alambre en la solución 20 veces para 100 ms hasta que la punta es afilada. Use el alambre de tungsteno afilada para quitar la cutícula sobre la cabeza de la mosca y exponiendo el cerebro.
  10. Además exponer el cerebro quitando tráquea y cuerpos grasos que lo rodean. Si acceder a los lóbulos antenales, use un alambre de tungsteno doblado o una herramienta similar a meter suavemente antenas por debajo de la hoja de grabación cámara para aumentar la visibilidad. Utilice pinzas afiladas para rasgar suavemente lejos el revestimiento glial que cubre el área de interés donde se harán grabaciones.
  11. Transferencia de la cámara de grabación a la plataforma de electrofisiología. Inmediatamente iniciar la perfusión con solución salina de grabación externo burbujas con carbogen para preservar el cerebro. El depósito de solución salina se coloca sobre la platina del microscopio y es gravedad-alimentó a la preparación. Utilice una línea de vacío y un matraz de Erlenmeyer de 2 L para recoger los residuos salinos.

4. obtener el registro de celulares

  1. Tire un extractor comercial pipeta pipetas de parche. Consulte el manual de configuración conseguir una pipeta adecuada con una resistencia de punta cerca de mΩ 7.
  2. Añadir 4 μL de solución de grabación interno en una pipeta de parche. La solución salina interna consta de aspartato de potasio 140, 10 HEPES, MgATP 4, Na 0,53GTP, 1 EGTA y 1 KCl en mM.
  3. Configurar el amplificador de abrazadera de parche para registro de celulares. Cero offset del amplificador y el amplificador para entregar pulsos de prueba. Aquí, se utiliza un amplificador de abrazadera AM sistemas parche 2.400.
  4. Aplicar presión positiva a través de la pipeta y acercarse a la célula. Uso de un micromanipulador para dirigir la pipeta y en contacto con la célula. Libere la presión positiva. Conjunto del explotación potencial de la membrana a -60 mV. La pipeta debe formar un sello gigaohm con membrana de la célula según lo evidenciado por una sub-picoamp bajo tenencia actual.
    Nota: Si usando GFP celular objetivo, intentar minimizar el uso de la luz epifluorescente para evitar activación de ChR2 y potencial depresión sináptica. También espere unos minutos antes de aplicar el paso 5.
  5. El amplificador para entregar pulsos de prueba de -50 mV a -60 mV. Esta opción es estándar en los amplificadores de la abrazadera del remiendo. Pulsos de prueba revelará un gran capacitativa transitorio que representa la corriente necesaria para cargar la pipeta patch. Eliminar transitorios capacitativa ajustando las perillas de la compensación de capacidad en el AM 2400 o similar amplificador.
  6. Se aplican breves impulsos de presión negativa para romper la membrana celular y obtener configuración de celulares.
    Nota: Una configuración de células enteras se observa cuando hay un gran aumento en los transitorios capacitativa mostrando la capacitancia de la neurona. Un pequeño aumento en la explotación actual (línea base) es probable que también se observará. El amplificador a modo de pinza y ajuste potencial de la célula de -50 a -60 mV.

5. probar la conectividad sináptica

  1. Configurar el sistema de adquisición (DAQ) de datos para activar un controlador LED para generar pulsos de luz. Aquí, se utiliza un sistema DAQ instrumentos nacionales con Matlab para entregar una señal analógica a un conductor del LED. La intensidad del LED se ajusta a través de la señal analógica al conductor. El LED es 620-630 nm longitud de onda LED.
  2. Coloque el LED rojo alta potencia directamente debajo de la preparación. Ajustar la intensidad de luz para que la mosca llegue a 0.238 mW/mm2 .
  3. Activar las neuronas presinápticas durante la grabación de la célula postsináptica de interés. Lograr optogenetically de activación de la célula, pharmacogentically, o a través de la estimulación nerviosa. Aquí, se aplican csChrimson y pulsos breves de luz roja.
    Nota: Las conexiones sinápticas pueden ser monitoreadas en pinza como EPSPs o abrazadera del voltaje como EPSCs. Una conexión sináptica debe ser visible antes de aplicar la TTX en respuesta a un pulso de luz de 40 ms. Si no se observa ninguna conexión, no es probable que las neuronas synaptically están conectados ya sea mono - o polysynaptically. La explotación potencial puede ajustarse para enfatizar las conexiones excitatorias o inhibitorias en consecuencia.
  4. Si una conexión se observa en solución salina normal, añadir TTX al sistema de perfusión para lograr una concentración final de 1 μm. Utilice una bomba de recirculación para capturar y reutilizar la solución salina para conservar la TTX. La bomba peristáltica se dibuja la solución salina del baño y volver al depósito de solución salino.
  5. Ajustar la velocidad de la bomba para proporcionar un fuerte vacío constante que no permite ese nivel salino en el baño al subir y bajar.
    Nota: La aplicación de TTX dará lugar a la cesación de clavar la actividad en la neurona que se está controlando en célula entera. Esto confirma que suficiente TTX ha sido añadido a la solución salina.
  6. Volver a aplicar pulsos breves de luz roja (40 ms para cada pulso). En este punto, es probable que cualquier conexión sináptica que permanece monosynaptic. Añadir a antagonistas farmacológicos a la solución salina recirculación para probar la naturaleza química de las conexiones sinápticas que permanecen en la TTX.
    Nota: Cuando se combinan optogenetics y focalización fluorescente de neuronas, puede ser importante no activar persistentemente la población presináptica de las neuronas, tratando de obtener una grabación. Esto puede conducir a la depresión sináptica y hace difícil ver las conexiones. Porque csChrimson tiene una banda de excitación larga que se extiende ampliamente en la gama de la proteína verde fluorescente, un fluoróforo rojo puede utilizarse para visualizar neuronas y channel2rhodopsin (Ch2R) puede utilizarse para excitar a las poblaciones de la célula. Hacerlo requiere genética específica y un cubo de filtro personalizado. Para generar moscas adecuadas, hacer moscas que expresan el fluoróforo rojo (RFP o mCherry) bajo los sistemas de expresión binaria de sistema LexA o Q. Estos tendrán que ser cruzado con moscas expresando un promotor Gal4 y UAS-Ch2R y UAS-NaChBac genes efectores. El cubo de filtro óptimo para epifluorescencia tendrá una gama estrecha de excitación excitar el fluoróforo rojo, pero no excita Ch2R. Además, el sistema de filtro debe incluir un filtro de emisión del pase largo para recoger la mayor cantidad de luz emitida. Se utilizó un filtro personalizado de croma que incluía números de parte et580/25 x y t600lpxr (del conjunto 49306), pero con un filtro de barrera/emisión de et610lp.

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Resultados

TERPS se utiliza para distinguir entre mono - y polysynaptic en conexiones sinápticas entre las neuronas. Mientras que una estimulación débil de una célula puede utilizarse para probar las conexiones directas, conduciendo a una mayor actividad presináptica a menudo reclutas polysynaptic conexiones (figura 1A). TERPS funciona Co expresando el canal de sodio TTX-insensible NaChBac y un activador de optogenetic y pruebas de conexiones en presencia de TTX para el...

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Discusión

Análisis TERPS complementan técnicas actuales utilizadas para circuito agrietarse permitiendo la detección de las sinapsis entre las neuronas identificadas. Específicamente, el enfoque revela conexiones monosynaptic por silenciamiento ampliamente los potenciales de acción con TTX restableciendo la excitabilidad en una población selecta de neuronas con el canal de sodio TTX-insensible NaChBac. Liberación sináptica se produce por el estímulo de optogenetic mientras que eventos postsinápticos son monitoreados con grabacione...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Joshua Singer, Jonathan Schenk, así como revisores pensativos por comentarios en el manuscrito. También nos gustaría agradecer a Ben White y Harold Zakon debates sobre la técnica. Jonathan Schenk proporciona los datos de la Figura 3A. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación de Whitehall y un R21 de NIH a QG.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
UAS-csChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55135Utilizado como activador neuronal
UAS-NaChBacBloomington Drosophila Stock Center9466Recupera la excitabilidad en las células en TTX
TetrodotoxinaTochris1078Es posible que se necesite un permiso especial para comprar TTX, ya que es una sustancia controlada
en su totalidad. trans-RetinalR2500Requiere cofactor para el
acero inoxidable 321 soldable con cidoopsina   Hoja,  0.002"  Grueso,  10"  WideMcMaster Carr3254K7Se utiliza para hacer un soporte para moscas personalizado. La lámina personalizada se puede cortar con láser en pololu.com del archivo PDF proporcionado
Microscopio de disecciónZeissStemi 2000-CSe utiliza para la disección de la preparación
CeraAlmoreEectra Waxer 66000Se utiliza durante la disección para asegurar la mosca en la lámina
Cera de parafinaJoann 4917217Se utiliza con las
pinzasHerramientas de ciencia fina#5COSe utiliza para la disección y el desenvainado
Tijeras de disecciónFine Science Tools15001-08Se utiliza para eliminar partes de la cutícula durante la disección
Alambre de tungstenoA-M Systems797500Úselo con electrólisis para hacer agujas afiladas para la disección
Bomba peristáltica recíprocaSimply Pumps (Amazon)PM200Spara recirculación
para bomba peristálticaZitrades (Amazon)N/APWM Controlador de atenuación para luces LED o cinta, 12 voltios 8 amperios, interruptor de luz de brillo ajustable Controlador de atenuación DC12V 8A 96W para tira de luz LED B
Versa-Mount  Regulador de aire comprimido de precisiónMcMaster Carr1804T1Para aplicar presión positiva durante el parcheo
Capilares de vidrioWorld Precision InstrumentsTW150F-3Para pipetas de parche
Manómetro multipropósitoMcMaster Carr3846K431Manómetro para regulador
de presión Cámara de electrofisiologíaDage MTI IR-1000Cualquier cámara que funcione en el rango IR (850 nm) funcionará. No desea utilizar la iluminación roja, ya que puede activar csChrimson
IR LEDThorlabs M850F2Para iluminación oblicua
de fibra óptica para IR LEDThorlabsM89L01Se acopla a la
lente del objetivo IR LED Olympus 40XLUMPlanFLNSe puede utilizar en la mayoría de los microscipes y funciona bien para visualizar las neuronas de las moscas.
LED ámbarThorlabsM590L3dPara visualizar RFP y
mCherry BlueLED ThorlabsM470L3dPara visualizar GFP
filtros GFPChroma49011Para visualizar GFP o estimular el canal2rodopsina
Juego de filtros mCherrypersonalizado Chroma  ET580/25X y T600LPXR (del conjunto 49306) pero con una óptica de barrera/emisión ET610LPÚselo solo si desea parchear las neuronas identificadas con channel2rhodopsin
Dichroic para combinar LED ámbar y azulThorlabsDMLP550RUse solo el parche debajo de mCherry y excite channel2rhodopsin con luz azul.
LED rojoLEDSupplyCree XPE 620 - 630 nmSe utiliza para accionar el controlador LED csChrimson
LEDSupply3021-D-E-1000Se utiliza para accionar LEDs para la estimulación optogenética
ManipuladorSutter InstrumentsMP-225Se utiliza para posicionar la pipeta durante las grabaciones
Amplificador de abrazadera de parcheA-M Systemsmodelo 2400Un amplificador equivalente es adecuado
Filtro BesselWarner Instruments LPF 202AFiltro auxiliar utilizado para filtrar la traza de corriente al osciloscopio durante la aplicación de parches.
Sistema de adquisición de datos National InstrumentsNI PCIe-6321            781044-01Se utiliza para registrar datos del amplificador al ordenador Bloque de
conectores - Terminal BNC BNC-2090ANational Instruments779556-01Se utiliza para conectar el amplificador a la tarjeta DAQ.
Lámina de acero McMaster Carr3254K7Lámina de acero para cámara de grabación personalizada
Imanes K& J MagneticsD42Para asegurar la cámara de grabación al soporte del anillo 1
/16" Cell Cast Acrylic Clear PololuSe utiliza para hacer una cámara de grabación personalizada. El acrílico se puede cortar con láser a pololu.com del archivo PDF proporcionado
de enceradora Número 5 Controlador de velocidad TTXJuego de

Referencias

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