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Investigación de la síntesis de RNA utilizando 5-Bromouridine etiquetado e inmunoprecipitación

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DOI:

10.3791/57056

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3 de mayo de 2018

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1DANDRITE - Danish Research Institute of Translational Neuroscience, Dept. of Biomedicine, Aarhus University, 2Dept. of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

En este artículo

Resumen

Este método puede utilizarse para medir la síntesis de ARN. 5-Bromouridine se añade a las células e incorporado en el RNA sintetizado. Síntesis de ARN se miden por la extracción de RNA inmediatamente después del etiquetado, seguido de la inmunoprecipitación de 5 Bromouridine-orientada con RNA y análisis por transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.

Resumen

Cuando se comparan los niveles de estado estacionario RNA entre dos condiciones, no es posible distinguir si los cambios son causados por alteraciones en la producción o degradación de RNA. Este protocolo describe un método para la medición de la producción de RNA, utilizando 5-Bromouridine etiquetado de RNA seguido por la inmunoprecipitación, que permite la investigación de ARN sintetizado en un corto plazo (p. ej., 1 h). La ventaja de 5-Bromouridine-etiquetado e inmunoprecipitación sobre el uso de tóxicos inhibidores transcripcionales, como α-amanitin y actinomicina D, es que hay no o muy poco efectos sobre la viabilidad celular durante el uso a corto plazo. Sin embargo, porque 5-Bromouridine-inmunoprecipitación solo captura RNA producido en el corto plazo etiquetado, producido lentamente como degrada rápidamente RNA puede ser difícil de medir por este método. El RNA marcado con el 5-Bromouridine capturado por la 5-Bromouridine-inmunoprecipitación puede analizarse por transcripción reversa reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y secuencia de la generación siguiente. Todos los tipos de ARN pueden ser investigados, y el método no se limita a medir mRNA como se presenta en este ejemplo.

Introducción

5-Bromouridine (BrU) inmunoprecipitación (IP) permite el estudio de la producción de RNA en células con n o efectos muy limitados sobre la fisiología de la célula durante el breve período1,2de etiquetado. El método se basa en la incorporación del derivado sintético de la uridina BrU en el RNA recién sintetizado seguido por IP de ARN marcada con anticuerpos anti-BrU (figura 1).

Se ha sabido por décadas que la síntesis de proteínas puede ser regulada transcripcionalmente, y la existencia de factores de transcripción fue presumida hace más de 50 años3. Hoy en día, se sabe que varias enfermedades son causadas por la desregulación de la estabilidad del RNA y transcripción (suplementario S1 figura en la referencia4), y la capacidad para medir los cambios en la producción de RNA es de gran importancia en la enfermedad de comprensión desarrollo.

Por otro lado, las herramientas para regular la producción de RNA proporcionan nuevas posibilidades para el tratamiento de enfermedades causadas por la expresión de proteína demasiado o muy poco, o acumulación de la proteína tales como la enfermedad de Parkinson (EP). La proteína predominante de acumulación de agregados insolubles como en la EP es la α-sinucleína, y el nivel de α-sinucleína está directamente relacionado con la enfermedad, como la multiplicación del gen del gen α-sinucleína causa familiar PD5. Por otra parte, α-sinucleína agregados de manera dependiente de la concentración. Regulación a la baja de niveles de mRNA de α-sinucleína, resulta una estrategia terapéutica interesante, que se ha logrado con éxito utilizando ARN de interferencia para disminuir la pérdida de células neuronales en modelos de roedores de PD6,7.

Es importante poder medir los cambios en la producción de RNA causado por enfermedad o intervenciones terapéuticas. Estado de la técnica métodos para medir niveles de estado estacionario del ARN, como transcripción reversa seguida de reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (RT-qPCR), no son capaces de distinguir entre los cambios causados por la regulación transcripcional o alterado Estabilidad del RNA. Un método ampliamente utilizado para la investigación de las tasas de decaimiento de RNA está bloqueando de la maquinaria transcripcional con compuestos tales como α-amanitin o actinomicina D seguido de medidas de los RNAs que se decae. Sin embargo, hay algunos problemas asociados con una obstrucción total de la transcripción en células, como la inducción de apoptosis8,9. Al lado de los efectos citotóxicos, transcripcionales inhibidores también presentan varios problemas técnicos, como la lenta absorción celular de α-amanitin y falta de especificidad de la actinomicina D (revisado en la referencia10).

Para evitar la obstrucción total de la transcripción, se han utilizado análogos de nucleótido, como 5-ethynyl uridina (UE 5), 4-thiouridine (4-TU) y BrU. Estos son fácilmente tomados por las células mamíferas e incorporados en el RNA recién sintetizado, que pulso-etiquetado de ARN dentro de un marco de tiempo específico. BrU es menos tóxico que la UE-5 y 4-TU, lo que es el análogo recomendado: opción11,12.

BrU-IP puede utilizarse para investigar tanto la tasa de síntesis de ARN y la estabilidad y así distinguir entre las causas de los cambios en el ARN total. Este artículo se centrará en la medición de la síntesis de ARN y se refiere a la referencia2 para más detalles sobre la investigación de la estabilidad del RNA. Para investigar la síntesis de ARN, las células se etiquetan brevemente con BrU por ejemplo para 1 h seguida de BrU-IP1 (figura 1). Esto permite mediciones de ARN sintetizado en el corto plazo etiquetado y cambios observados le dará una mejor estimación de las regulaciones en la síntesis de RNA que midiendo cambios en el ARN total por RT-qPCR. Sin embargo, debe mencionarse que a pesar de que el tiempo de etiquetado es, por ejemplo, sólo 1 h, degradación todavía puede tener una influencia en los niveles de RNA observados.

ARN de experimentos de BrU-IP son adecuados para análisis posterior por RT-qPCR1 o la siguiente generación de la secuencia2,13. Otros métodos de detección de RNA estándar, tales como el borrar norteño o ensayo de protección de ribonucleasa, también pueden ser aplicables para ciertos RNAs.

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Protocolo

Nota: Realizar todos los pasos a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario y mantener reservas en hielo o en el frigorífico (excepto de la elución de búfer que contienen SDS). El protocolo se divide en 5 secciones: las muestras de la preparación de RNA; preparación de granos para IP; Unión de la ARN BrU-labelled para granos; elución y purificación de RNA encuadernado BrU-etiquetados por extracción con fenol-fenol/cloroformo-cloroformo 3 pasos; Análisis de ARN (en este ejemplo utilizando RT-qPCR)

1. preparación de las muestras de RNA

  1. Las células HEK293T cuenta con una célula automatizada el contador y la semilla 3.500.000 células en un plato de petri de 10 cm en medios de cultivo de 10 mL (medio modificado Eagle de Dulbecco suplementado con 10% suero fetal y 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina) para obtener un total de > 40 μg de RNA sobre extracción 48 h más tarde. Mantener las células a 37 ° C y 5% CO2.
  2. 48 h después de la siembra, aspirar el medio de crecimiento de 8 mL y dejar 2 mL para evitar la desecación de las células. Añadir 2 mM de BrU y cualquier tratamiento a los 8 mL aspirado medio de crecimiento y quitar el residual de 2 mL de las células antes de volver a aplicar el 8 mL BrU que contienen medios de cultivo. Evitar el uso de medios frescos sobre aplicación de la BrU a las células, ya que esto puede inducir cambios en la expresión génica.
  3. Incube las células durante 1 h con BrU y tratamiento. Lavar las células en buffer de 5 mL Hank y trypsinize las células utilizando tripsina de 0,05% de 2 mL. Añadir el medio de crecimiento de 8 mL para detener la reacción, transferir las células a un tubo de 15 mL y desactivación de las células por 2 min a 1.000 x g.
  4. Quite el sobrenadante y extraer ARN total pellets celulares utilizando un aislamiento de RNA kit (véase Tabla de materiales) o cualquier otro método de preferido y eluir en libre de Rnasa H2O. tienda el ARN a-80 ° C hasta que esté listo para proceder.

2. preparación de granos para IP

  1. El número de muestras a ser investigados más uno extra a la cuenta de pérdida durante el pipeteo y remolino mezcla preparar granos en lotes. Suspender granos magnéticos de anti-ratón IgG fondo mezclando torbellino y saque 20 granos μl por muestra en un tubo de 1,5 mL libre de Rnasa. Lugar el tubo de 1,5 mL en un soporte magnético y dejar aproximadamente 20 s para las cuentas a cobrar en el lado.
  2. Eliminar el sobrenadante, sacar el tubo del soporte magnético y resuspender en 400 μL de tampón de BrU-IP x 1 mediante pipeteo. Girar el tubo muy brevemente para 2 en una centrífuga de mesa, colóquelo en el soporte magnético y eliminar el sobrenadante. Repita el paso de lavado una vez.
  3. Unión inespecífica de bloque a los granos con heparina. Resuspender los granos en 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL heparina de tampón y deja girar para lavado de 30 minutos los granos una vez, como en el paso 2.2.
    Nota: La heparina es un polímero cargado negativamente, que competirá con RNAs para el enlace. tRNA u otros RNAs irrelevantes pueden utilizarse también si la aplicación aguas abajo no está secuenciando.
  4. Suspender los granos en 1 mL 1 x buffer de BrU-IP y agregar 1.25 μg/muestra del anticuerpo anti-α-bromodeoxiuridina, que también reconoce BrU. Incubar los granos para 1 h mientras gira, o durante la noche a temperatura ambiente.
  5. Lavar los granos tres veces como en el paso 2.2. Resuspender los granos en 50 μl de la muestra 1 x BrU-IP buffer suplementado con 1 mM de BrU y dejar girando durante 30 minutos reducir la sensibilidad del anticuerpo ligado a las cuentas y por este medio el riesgo de atascamiento inespecífica durante PI.
  6. Lavar los granos tres veces como en el paso 2.2 y resuspender en tampón de muestra/μl 1xBrU-IP 50.

3. Unión de ARN marcado con BrU a granos

  1. Medir las concentraciones de RNA en los extractos de RNA en el paso 1.3 usando espectrofotometría de ultravioleta-visible y diluir 40 μg RNA de cada muestra en libre de Rnasa H2O hasta un volumen total de 200 μl.
  2. Calentar las muestras de RNA por 2 min a 80 º C para desnaturalizar ARN y vuelta brevemente en una centrífuga de mesa. Añadir 200 μL de 2 x inhibidor de BrU-IP + BSA/Rnasa.
  3. Añadir 50 μl resuspendió y prepararon granos del paso 2.6 para cada muestra y dejar girar 1 h. lavado los granos cuatro veces como en el paso 2.2.

4. elución y purificación de RNA por la extracción de fenol-fenol/cloroformo-cloroformo 3 pasos

  1. Eluir el RNA y realizar la extracción del fenol
    1. Suspender los granos en 200 μL de tampón de elución para eluir el RNA y rápidamente después de eso agregar fenol de 200 μL, pH 6.6 (PRECAUCIÓN: tóxico, ver nota abajo paso 4.1.2) para eliminar cualquier moléculas no-RNA de la muestra.
    2. Remolino mezcla la muestra y un exprimido a 3 min a 25.000 x g en una centrífuga de mesa.
      Nota: El fenol es tóxico y debe manejarse en una campana de humos con protección de la piel. El pH ligeramente ácido asegura que sólo ARN y no ADN, se extrae. El RNA permanece en la fase acuosa superior debido a la naturaleza hidrofílica de las cargas. Los corazones hidrofóbicos de las proteínas se unen fenol y mover a la fenol-fase orgánica inferior.
  2. Realizar extracción de fenol-cloroformo
    1. Aspirar tanto fase superior como sea posible (aproximadamente 190 μl de 200 μL, dependiendo de la experiencia en el manejo) y a un tubo con 200 μL fenol/cloroformo, pH 6.6 (PRECAUCIÓN: tóxicos, ver nota). Asegúrese de aspirar la misma cantidad a través de las muestras.
    2. Remolino de mezclar la muestra y el centrifugado por 3 min a 25.000 x g.
      Nota: El cloroformo es tóxico y debe manejarse en una campana de humos con protección de la piel. Cloroformo se añade para eliminar el fenol, que puede afectar el análisis descendente de RNA por inhibición de la transcripción inversa14 y polimerasa de reacciones en cadena15.
  3. Realizar extracción de cloroformo aspirando la fase superior acuosa como antes (ahora aproximadamente 180 μL) y transferir a un tubo que contiene cloroformo μl 200. Hidromasaje mezcle la muestra y centrifugar 3min a 25.000 x g.
  4. Aspirar la fase superior acuosa como antes (ahora aproximadamente 170 μL) y transferir a un tubo que contiene 17 μl (volumen 1/10) 3 M CH3COONa, pH 6.0. Para neutralizar y precipitar el RNA de la solución acuosa, añadir 2 μl del glicógeno (20 mg/mL), que precipita junto con RNA y hace más visible el pellet de RNA.
  5. Añadir 500 μl 96% de etanol para aumentar la unión entre los iones de sal y RNA y mezcla por inversión del tubo un par de veces. Dejar el tubo durante la noche a-20 ° C o 15 min en hielo seco.
  6. Girar la muestra a 25.000 x g, 4 ° C por 30 min descartar sobrenadante sin perturbar el pellet y lavar el pellet en 185 μl 75% de etanol para eliminar la sal residual. Gira a 25.000 x g, 4 º C durante 5 minutos.
  7. Deseche el sobrenadante totalmente sin perturbar el sedimento y dejar el sedimento seco 5-10 minutos con una tapa abierta. Resuspender en 10 μl libre de Rnasa H2O aplicado en el lado del tubo para evitar perturbar el sedimento.

5. Análisis de ARN

  1. Preparar cDNA usando una cDNA de transcripción reversa kit (véase Tabla de materiales) o cualquier otro preferido método 2 μl de muestra de RNA y RNA total de levadura 1 μg como portador del RNA para la reacción de síntesis de cDNA (no usada si cDNA se utiliza para la siguiente secuencia de generación). Utilice 1 μg de RNA sin levadura RNA para preparación de ADNc de entrada correspondiente.
  2. CDNA diluidos 1:25 y mix 9 μl diluir cDNA con 10 μl qPCR Master mix y 1 μl fluorógenos sonda, ambos especifican en la Tabla de materiales.
    Nota: La dilución de cDNA depende de la preparación de ADNc y método de qPCR.
  3. Ejecutar el siguiente programa de qPCR (por ejemplo, en un sistema Fast PCR en tiempo real 7500 o equivalente): 2 minutos a 50 ° C, 20 s a 95 ° C, 40 ciclos de 3 s a 95 ° C y 30 s a 60 ° C.

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Resultados

Nuestras pruebas iniciales de tiempo etiquetado BrU fueron realizados en células AsPC-1. Las células fueron tratadas con BrU, para 0, 1, 2 y 4.5 h, seguida por la extracción de RNA total y BrU-IP. Midieron a GAS5 y GAPDH en el ARN de BrU-IP, que ha demostrado que 1 h etiquetado era suficiente para alcanzar un cambio aproximadamente 9 - y 44 veces en comparación con fondo (0 h) de GAPDH y GAS5, respectivamente.

BrU-IP y el anális...

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Discusión

Este protocolo describe el uso de BrU-IP para determinación de la producción de RNA por etiquetado de nuevo produce RNA para 1 h con BrU, seguido por la inmediata extracción de RNA e inmunoprecipitación de ARN marcado con BrU. Este método ha sido descrito previamente en la referencia16, y este artículo incluye algunos pasos adicionales para aumentar la especificidad IP y pureza del RNA, por granos pre-tratamiento con concentraciones bajas de BrU, así como un paso de purificación de fenol-cloroform...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La Fundación Lundbeck, Universidad de Aarhus, Dandrite y Lundbeck A/S apoyaron este trabajo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Inhibidor de la Rnasa RibolockThermoFisherEO0381
Dynabeads M-280 Ovejas anti-ratón IgGLife Technologies11202D
α-Bromodeoxyuridina anticuerpo de ratónBD Bioscience555627
Nanodrop 1000Thermo FisherEspectrofotometría ultravioleta-visible
Fenol saturado con agua pH 6,6ThermoFisherAM9712
Fenol:Cloroformo:IAA 25:24:1 pH 6.6ThermoFisherAM9732
Kit de aislamiento de ARN de alta purezaRoche11828665001
Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidadThermoFisher4368814
Taqman Fast Advanced Master MixThermoFisher4444557qPCR Master Mix
Sondas de ARN TaqmanThermoFisherSNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1Sondas flurgénicas
7500 Sistema rápido de PCR en tiempo realApplied Biosystems
HEK293T línea celularATCC
Dulbecco's Modified Eagle's MediumLonzaBE12-604F
Suero fetal de terneroBiochromS0115
Penicilina/EstreptomicinaBiochromA2213
Tampón5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 y 136,8 mM NaCl pH 6,77, esterilizado en autoclave.
DEPC-H2O0,1% con dietilpirocarbonato tratado con H2O
Tampón 2xBrU-IP 40mM Tris-HCl pH 7,5 y 500 mM NaCl en DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibidor2xBrU-IP tampón 2xBrU-IP suplementado con 1 μ g/μ L BSA y 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL de heparina2xBrU-IP tampón diluido 1:1 DEPC-H2O y suplementado con 1mg/mL de heparina
1xBrU-IP2xBrU-IP tampón diluido 1:1 en DEPC-H2O y suplementado con 0,5 μ g/μ L BSA y 20 U/mL de
tampón0,1% SDS en H2O libre de ARNasa
de Hank de elución Ribolock

Referencias

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