Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli

Resumen

Expansión del código genético sirve como una poderosa herramienta para el estudio de una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo acetilación de proteínas. Aquí demostramos un protocolo fácil aprovechar esta técnica para generar homogéneo acetilado proteínas en sitios específicos en células de Escherichia coli .

Resumen

Modificaciones post-traduccionales que ocurren en las posiciones específicas de proteínas han demostrado desempeñar un papel importante en una variedad de procesos celulares. Entre ellos, la acetilación reversible de la lisina es uno de los más ampliamente distribuidos en todos los ámbitos de la vida. Aunque se han realizado numerosos estudios de acetylome basada en espectrometría de masa, más caracterización de estos objetivos de acetilación putativo ha sido limitada. Una razón posible es que es difícil generar proteínas puramente acetiladas en posiciones deseadas por mayoría enfoques bioquímicos clásicos. Para superar este reto, se ha aplicado la técnica de expansión del código genético para utilizar el par de una variante de ingeniería pyrrolysyl-tRNA sintetasa y su cognado tRNA de las especies de Methanosarcinaceae , para dirigir la incorporación cotranslacional de acetyllysine en el sitio específico en la proteína de interés. Después de la primera aplicación en el estudio de la acetilación de histonas, este enfoque ha facilitado estudios de acetilación sobre una variedad de proteínas. En este trabajo, hemos demostrado un protocolo fácil para producir proteínas site-specifically acetiladas utilizando la bacteria Escherichia coli de la modelo como anfitrión. Malato deshidrogenasa fue utilizada como un ejemplo de demostración en este trabajo.

Introducción

(PTMs) las modificaciones post-traduccionales de las proteínas ocurren después del proceso de traducción y surgen de adición covalente de grupos funcionales a los residuos del aminoácido, jugando papeles importantes en casi todos los procesos biológicos, incluyendo gene transcripción, respuesta al estrés, diferenciación celular y metabolismo^1,2,3. Hasta la fecha, cerca de 400 distintivo PTMs han sido identificados⁴. La complejidad del genoma y el proteoma se amplifica en gran medida por la proteína MPa, regular localización y actividad de la proteína, ....

Protocolo

1. dirigida mutagénesis Gene de la blanco

Nota: MDH se expresa bajo el promotor de T7 en el vector de pCDF-1 con el origen de CloDF13 y un número de copia de 20 a 40³⁴.

1. Introducir el codón ámbar en la posición 140 en el gene de cartillas (adelante cartilla: GGTGTTTATGACetiquetaAACAAACTGTTCGGCG y revertir la cartilla: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), siguiendo las instrucciones del kit de mutagénesis sitio-dirigida.
2. Amplificar el plásmido de plantilla que contiene el gen de la dehidratasa del malato de tipo salvaje e inserte la mutación del codón de parada por la ....

Resultados

El rendimiento de proteína MDH acetilado fue 15 mg por cultura de 1 L, mientras que la de tipo salvaje MDH fue 31 mg por cultura de 1 L. Proteínas purificadas fueron analizadas por SDS-PAGE, como se muestra en la figura 1. El MDH de tipo salvaje fue utilizado como un control positivo de³⁴. La proteína purificada de células que el sistema de incorporación de acetyllysine (AcK) y el gen mutante mdh , pero sin confirmación en med.......

Discusión

La incorporación genética de noncanonical aminoácidos (ncAAs) se basa en la supresión de un codón asignado, sobre todo el ámbar stop codón UAG^36,37,38,39, por el tRNA cargado de ncAA que contiene el anticodon correspondiente. Como es sabido, el codón UAG es reconocido por el factor de liberación-1 (RF1) en bacterias y puede también ser suprimido por cerca de tRNAs cognado de anfitriones por ami.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ensayo de proteínas Bradford	Bio-Rad	5000006	Concentración de proteínas
4x Tampón de muestra Laemmli	Tampón de muestra	Bio-Rad	1610747
Coomassie G-250 Tinción	Bio-Rad	1610786	SDS-PAGE tinción en gel
4-20% Gel listo para SDS-PAGE	Bio-Rad	4561093	Determinación
de proteínas Ac-K-100 (HRP Conjugate)	Cell Señalización	6952	Anticuerpo
IPTG	CHEM-IMPEX	194	Inductor de expresión
Nε -acetil-L-lisina	CHEM-IMPEX	5364	Columna
de desalinización de aminoácidos no canónicos PD-10	Healthcare		17085101 Desalinización
Q5 Kit de mutagénesis dirigida al sitio	NEB	E0554	Presentamos las células de codón de parada
BL21 (DE3)	NEB	C2527	Expresando cepa
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN		27106	Extracción de plásmidos Resina
Ni-NTA	QIAGEN	30210	Resina de purificación por afinidad
nicotinamida	Sigma-Aldrich	N3376	Inhibidor de la desacetilasa
β-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250	Agente reductor
BugBuster Reactivo de extracción de proteínas	Sigma-Aldrich	70584	Rompiendo células
Benzonasa nucleasa	Sigma-Aldrich	E1014	DNasa
ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	Quimioluminiscencia
Caldo LB premezclado	VWR	97064	Medio de crecimiento celular
Albúmina sérica bovina	VWR	97061-416	Western blots Bloqueo

SDS GE