Artículo de método

Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli

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DOI:

10.3791/57061

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9 de diciembre de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

En este artículo

Resumen

Expansión del código genético sirve como una poderosa herramienta para el estudio de una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo acetilación de proteínas. Aquí demostramos un protocolo fácil aprovechar esta técnica para generar homogéneo acetilado proteínas en sitios específicos en células de Escherichia coli .

Resumen

Modificaciones post-traduccionales que ocurren en las posiciones específicas de proteínas han demostrado desempeñar un papel importante en una variedad de procesos celulares. Entre ellos, la acetilación reversible de la lisina es uno de los más ampliamente distribuidos en todos los ámbitos de la vida. Aunque se han realizado numerosos estudios de acetylome basada en espectrometría de masa, más caracterización de estos objetivos de acetilación putativo ha sido limitada. Una razón posible es que es difícil generar proteínas puramente acetiladas en posiciones deseadas por mayoría enfoques bioquímicos clásicos. Para superar este reto, se ha aplicado la técnica de expansión del código genético para utilizar el par de una variante de ingeniería pyrrolysyl-tRNA sintetasa y su cognado tRNA de las especies de Methanosarcinaceae , para dirigir la incorporación cotranslacional de acetyllysine en el sitio específico en la proteína de interés. Después de la primera aplicación en el estudio de la acetilación de histonas, este enfoque ha facilitado estudios de acetilación sobre una variedad de proteínas. En este trabajo, hemos demostrado un protocolo fácil para producir proteínas site-specifically acetiladas utilizando la bacteria Escherichia coli de la modelo como anfitrión. Malato deshidrogenasa fue utilizada como un ejemplo de demostración en este trabajo.

Introducción

(PTMs) las modificaciones post-traduccionales de las proteínas ocurren después del proceso de traducción y surgen de adición covalente de grupos funcionales a los residuos del aminoácido, jugando papeles importantes en casi todos los procesos biológicos, incluyendo gene transcripción, respuesta al estrés, diferenciación celular y metabolismo1,2,3. Hasta la fecha, cerca de 400 distintivo PTMs han sido identificados4. La complejidad del genoma y el proteoma se amplifica en gran medida por la proteína MPa, regular localización y actividad de la proteína, y afectan la interacción con otras moléculas como proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y cofactores5.

Acetilación de proteínas ha estado a la vanguardia de los estudios de MPa en las última dos décadas6,7,8,9,10,11,12. Acetilación de la lisina fue descubierta en las histonas hace más de 50 años13,14, ha sido bien analizado y se sabe para existir en más de 80 factores de transcripción, reguladores y varias proteínas15, 16,17. Estudios sobre la acetilación de proteínas no sólo nos proporciona una comprensión más profunda de sus mecanismos reguladores, sino también guiada por tratamientos para un número de enfermedades causadas por acetilación disfuncional18,19, 20 , 21 , 22 , 23. se creía que la acetilación de la lisina ocurre solo en eucariotas, pero estudios recientes han demostrado que la acetilación de proteínas también juega un papel clave en la fisiología bacteriana, incluyendo chemotaxis, resistencia ácida, la activación y estabilización de Islas de patogenicidad y virulencia otra relacionadas con las proteínas24,25,26,27,28,29.

Un método comúnmente utilizado para caracterizar bioquímicamente la acetilación de la lisina está utilizando mutagénesis sitio-dirigida. Glutamina es utilizada como un imitador de acetyllysine debido a su tamaño y polaridad similar. Arginina es utilizada como un imitador de lisina no acetilado, ya que conserva su carga positiva en condiciones fisiológicas pero no puede ser acetilado. Sin embargo, ambos imitadores no son isosteres reales y no siempre producen los resultados esperados30. El enfoque más riguroso es generar homogéneo acetiladas proteínas en residuos de lisina específico, que es difícil o imposible por métodos más clásicos debido a la baja estequiometría de acetilación de la lisina en naturaleza7,11. Este desafío ha sido desentrañando la estrategia de expansión del código genético, que emplea una ingeniería pyrrolysyl-tRNA sintetasa variante de especies Methanosarcinaceae para cargar tRNAPyl con acetyllysine, utiliza el host traslacional maquinaria para suprimir la UAG stop codon en el mRNA y dirige la incorporación de acetyllysine en la posición diseñada de la proteína blanco del31. Recientemente, hemos optimizado este sistema con una mejor EF-Tu-Unión tRNA32 y un actualizado acetyllysyl-tRNA sintetasa33. Además, hemos aplicado este sistema mayor incorporación en estudios de acetilación de la malato deshidrogenasa34 y Tirosil tRNA sintetasa35. Aquí, demostramos el protocolo para la generación de proteínas puramente acetiladas de la clonación molecular para identificación bioquímica mediante el uso de malato deshidrogenasa (MDH), que hemos estudiado como ejemplo demostrativo.

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Protocolo

1. dirigida mutagénesis Gene de la blanco

Nota: MDH se expresa bajo el promotor de T7 en el vector de pCDF-1 con el origen de CloDF13 y un número de copia de 20 a 4034.

  1. Introducir el codón ámbar en la posición 140 en el gene de cartillas (adelante cartilla: GGTGTTTATGACetiquetaAACAAACTGTTCGGCG y revertir la cartilla: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), siguiendo las instrucciones del kit de mutagénesis sitio-dirigida.
  2. Amplificar el plásmido de plantilla que contiene el gen de la dehidratasa del malato de tipo salvaje e inserte la mutación del codón de parada por la reacción de polimerasa (PCR) reacción en cadena. En la mezcla de reacción, son 12,5 μl de mezcla de enzima de polimerasa de ADN X 2, 1.25 μl de primer avance de 10 μm, 1,25 μl de cebador inverso de 10 μm, 1 μl de ADN de plantilla (20 ng/μL) (pCDF-1 plásmido que contiene el gen de tipo salvaje MDH) y 9 μl de agua libre de nucleasa.
    1. Utilizar parámetros de reacción de polimerización en cadena del siguiente modo: inicial de desnaturalización a 98 ° C por 30 s; 25 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C y a 3 min a 72 ° C; extensión final a 72 ° C durante 3 minutos. Después de la polimerización en cadena, agregue el material amplificado directamente a la mezcla de enzima quinasa-ligasa-DpnI del kit por 1 h a temperatura ambiente para la eliminación de la circularización y plantilla.
      Nota: La mezcla de reacción contiene 1 μl del producto PCR, 5 μl de 2 X Buffer de reacción, 1 μl de mezcla de enzima quinasa-ligasa-DpnI de X 10 y 3 μl de agua libre de nucleasa.
  3. Añadir 5 μl de la mezcla de reacción con el tubo 25 μl descongelado competentes de e. coli DH5α células del kit. Cuidadosamente el tubo para mezclar la película y coloque la mezcla en hielo durante 30 min choque del calor la mezcla a 42 ° C por 30 s y el lugar en hielo durante 5 minutos adicionales.
    1. Pipetear 600 μl de caldo Super óptima con los medios de represión (SOC) de catabolito del kit de temperatura en la mezcla, incubar a 37 ° C durante 60 min, con agitación a 250 rpm, 100 μL en una placa de agar de lisogenia caldo (LB) con el correspondiente antibiótico de propagación e incubar toda la noche a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
  4. Seleccionar colonias solo 4-6 en 6 mL fresco LB medios con el antibiótico correspondiente e incubar durante una noche a 37 ° C con agitación a 250 rpm. Extraer plásmidos de cada cultura durante la noche por el kit de purificación del plásmido, siguiendo el manual del fabricante, luego enviar plásmidos para la secuenciación del ADN según el protocolo de la empresa para confirmar la mutación del codón de parada en posición correcta.
  5. Almacenar la tensión con la secuencia correcta a-80 ° C mediante la mezcla de cultura durante la noche de 1 mL y 300 μL 100% DMSO.

2. expresión de la proteína acetilada

  1. Introducir los genes de optimizado acetyllysyl-tRNA sintetasa33 y optimizado tRNAPyl 32 en el plásmido de pTech . Lugar gen tRNA sintetasa bajo el promotor constitutivo lpp . Lugar el gen tRNA bajo el promotor constitutivo proK del34.
    1. Transformar conjuntamente la expresión vector34 que contiene el gene transformado que contiene la etiqueta de la malato deshidrogenasa, y el plásmido que el sistema de incorporación de acetyllysine optimizado, en 25 μl descongeladas competente e. coli BL21(DE3) células por choque térmico a 42 ° C por 10 s y el lugar en el hielo durante 5 minutos adicionales.
    2. Pipetear 600 μl de medio SOC de temperatura en la mezcla, incubar a 37 ° C durante 60 min con agitación en rpm 275, extensión 100 μL en una placa con estreptomicina μg/mL 100 y 50 μg/mL cloranfenicol e incubar durante una noche a 37 ° C con agitación a 275 rpm.
  2. Recoger una sola Colonia de la placa e inocular en medios LB frescos 15 mL con 100 estreptomicina μg/mL y el cloramfenicol 50 μg/mL en un tubo de 50 mL durante la noche a 37 ° C con agitación a la velocidad de 250 rpm. Transferencia de la cultura durante la noche de 15 mL a 300 mL fresco LB medios con antibióticos en un matraz de 1 L e incubar a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
  3. Disolver acetyllysine con agua para hacer la solución stock de 100 mM, almacenar a 4 ° C. Añadir acetyllysine de 5 mM y 20 mM nicotinamida (inhibidor de desacetilasas) a los medios de crecimiento cuando la absorbancia alcanza 0.5 a 600 nm.
    1. Cultivar células por un adicional 1 h a 37 ° C, agitación a 250 rpm, añada 0,5 mM IPTG para expresión de la proteína y crecen las células a 25 ° C durante la noche, con agitación a 180 rpm.
      Nota: Las condiciones de expresión necesario optimización para diferentes proteínas.
  4. Recogen las células por centrifugación a 3.000 x g a 4 ° C durante 15 minutos, descartar el sobrenadante y lavar el pellet celular con el tampón fosfato salino (PBS) buffer (10 mM de Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Recoger las células lavadas a 10.000 x g a 4 ° C por 5 min, descartar el sobrenadante y almacenar pellets de células a-80 ° C.

3. purificación de la proteína acetilada

  1. Descongelar los pellets de células congeladas en el hielo y vuelva a suspender con 15 mL de tampón de lisis (50 mM tris (hidroximetil) aminometano (Tris), pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol de 20 mM y 20 mM nicotinamida), 5 μl de β-mercaptoetanol y nucleasa de Benzonase μL 1 (250 unidades).
  2. Rompen las células por sonicación de 40 kHz a 70% potencia de salida con 10 ciclos de ráfagas cortas de 10 s, seguidos por intervalos de 30 s para la refrigeración de extracto crudo de la forma. Extracto de centrífuga crudo a 20.000 x g durante 25 minutos a 4 ° C. Filtrar el sobrenadante con el filtro de membrana de 0,45 μm y cargar en una columna que contiene 1 mL de resina (Ni-NTA) ácido nitrilotriacético níquel, equilibrada con 20 mL de agua y 20 mL de tampón de lisis.
    Nota: Las células también podrían romper por detergentes suaves, si no hay baño de ultrasonidos.
  3. Lavar la columna con 20 mL de tampón de lavado (50 mM Tris, pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol de 50 mM y 20 mM nicotinamida) y luego eluir con 2 mL de tampón de elución (50 mM Tris, pH 7.8, 300 mM de NaCl, imidazol de 150 mM y 20 mM nicotinamida).
  4. Desalar la fracción de elución con buffer 25 mM Tris pH 7,8 y 10 mM (NaCl) la desalación la columna PD-10, siguiendo el manual del fabricante. Medir la concentración de la proteína eluída siguiendo la instrucción del reactivo de análisis de la proteína de Bradford. La proteína desalada está lista para más experimentos.
    Nota: Hacer stock de glicerol 50% de la proteína y guardar en-80 ° C para el almacenamiento.

4. bioquímico caracterización de la proteína acetilada

  1. Análisis de SDS-PAGE y masa espectrometría.
    1. Desnaturalizar las proteínas con el sodio dodecil sulfato (SDS) tampón de muestra (5 μl proteína muestra con 2 μl 4 X tampón SDS) en un tubo de 2 mL a 105 ° C por 5 min, centrifugar la mezcla a 2000 x g durante 10 s, carga sobre el 4-20% sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel este gel oresis (SDS-PAGE) y ejecutar a 200 V durante 30 minutos.
    2. Lavar el gel con agua destilada y agitar suavemente durante 5 min, repetir el proceso 3 veces. Deseche el agua y teñir el gel con colorante azul de Coomassie para 1 h con agitación suave. -Teñir el gel con agua destilada, agitar suavemente durante 30 minutos y repita esto de manchas 3 veces.
    3. Corte la banda de 33 kDa en el gel SDS-PAGE teñido de azul de Coomassie y envían a instalaciones de espectrometría de masas o las empresas para confirmar que la acetyllysine fue incorporada en la posición diseñada.
      Nota: El protocolo de análisis de espectrometría de masas siguió el experimento anterior34.
  2. El borrar occidental
    1. Correr el gel SDS-PAGE con el mismo protocolo en el paso 4.1. Después el gel ejecutar, poner en remojo el gel con el tampón de transferencia (25 mM Tris, glicina 192 mM, pH 8.3 y 20% metanol) durante 15 minutos.
    2. Activar un 0.2 μm, membrana de difluoruro (PVDF) del polivinilideno de 7 cm x 8,5 cm con metanol durante 1 min y lavar con tampón de transferencia antes de preparar el sándwich de transferencia.
      Nota: El metanol es peligroso en caso de contacto con la piel, contacto con los ojos, ingestión o inhalación. La sobreexposición severa puede causar la muerte.
    3. Hacer el sandwich de la transferencia del cátodo al ánodo (esponja, papel de filtro, SDS-PAGE gel, PVDF membrana, papel de filtro y esponja). Poner la pila en el tanque de la transferencia, a una corriente constante de 350 mA para 45 minutos.
      Nota: Tiempo de transferencia puede necesitar optimización.
    4. Lavar la membrana PVDF con 25 mL con tampón Tris salino, 0,1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween 20, pH 7,6) buffer por 5 min con agitación suave. Bloquear la membrana con 5% albúmina sérica bovina (BSA) en el buffer TBST por 1 h a temperatura ambiente.
    5. Incubar la membrana con acetyllysine-anticuerpo conjugado con HRP con una concentración final de 1 μg/mL diluido con 5% de BSA en TBST a 4 ° C durante la noche con agitación suave.
      Nota: Para resultados más rápidos, este paso podría realizarse a temperatura ambiente durante 1 hora. La dilución del anticuerpo puede necesitar optimización.
    6. Lavar la membrana con 20 mL de tampón de TBST por 5 min con agitación suave, repetir el paso 4 veces. El sustrato de la quimioluminescencia se aplica a la membrana siguiendo las instrucciones del fabricante. Capturar la señal con un sensor de cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD).

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Resultados

El rendimiento de proteína MDH acetilado fue 15 mg por cultura de 1 L, mientras que la de tipo salvaje MDH fue 31 mg por cultura de 1 L. Proteínas purificadas fueron analizadas por SDS-PAGE, como se muestra en la figura 1. El MDH de tipo salvaje fue utilizado como un control positivo de34. La proteína purificada de células que el sistema de incorporación de acetyllysine (AcK) y el gen mutante mdh , pero sin confirmación en med...

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Discusión

La incorporación genética de noncanonical aminoácidos (ncAAs) se basa en la supresión de un codón asignado, sobre todo el ámbar stop codón UAG36,37,38,39, por el tRNA cargado de ncAA que contiene el anticodon correspondiente. Como es sabido, el codón UAG es reconocido por el factor de liberación-1 (RF1) en bacterias y puede también ser suprimido por cerca de tRNAs cognado de anfitriones por ami...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los NIH (AI119813), la puesta en marcha de la Universidad de Arkansas y el premio del Instituto de biociencias de Arkansas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ensayo de proteínas BradfordBio-Rad5000006Concentración de proteínas
4x Tampón de muestra LaemmliTampón de muestraBio-Rad1610747
Coomassie G-250 TinciónBio-Rad1610786SDS-PAGE tinción en gel
4-20% Gel listo para SDS-PAGEBio-Rad4561093Determinación
de proteínas Ac-K-100 (HRP Conjugate)Cell Señalización6952Anticuerpo
IPTGCHEM-IMPEX194Inductor de expresión
Nε -acetil-L-lisinaCHEM-IMPEX5364Columna
de desalinización de aminoácidos no canónicos PD-10Healthcare17085101 Desalinización
Q5 Kit de mutagénesis dirigida al sitioNEBE0554Presentamos las células de codón de parada
BL21 (DE3)NEBC2527Expresando cepa
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN27106Extracción de plásmidos Resina
Ni-NTAQIAGEN30210Resina de purificación por afinidad
nicotinamidaSigma-AldrichN3376Inhibidor de la desacetilasa
β-MercaptoetanolSigma-AldrichM6250Agente reductor
BugBuster Reactivo de extracción de proteínasSigma-Aldrich70584Rompiendo células
Benzonasa nucleasaSigma-AldrichE1014DNasa
ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106Quimioluminiscencia
Caldo LB premezcladoVWR97064Medio de crecimiento celular
Albúmina sérica bovinaVWR97061-416Western blots Bloqueo
SDS GE

Referencias

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