Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Summary

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Abstract

Microglia, las células inmunes residentes en el cerebro, son los primeros respondientes a los inflamación o lesiones en el sistema nervioso central. La investigación reciente ha revelado microglia a ser dinámico, capaz de asumir fenotipos pro inflamatorias y antiinflamatorios. Tanto M1 (pro inflamatorio) y M2 fenotipos (pro-reparadora) juego un papel importante en capensis condiciones tales como lesión cerebral perinatal y exposición de diferentes funciones en respuesta a ciertos estímulos ambientales. La modulación de la activación microglial se ha observado para conferir neuroprotección así sugiriendo la microglía puede tener potencial terapéutico en el daño cerebral. Sin embargo, se requiere más investigación para comprender mejor el papel de la microglia en la enfermedad, y este protocolo facilita. El protocolo describe a continuación combina un proceso de centrifugación del gradiente de densidad para reducir desechos celulares, con separación magnética, produciendo una muestra muy pura de las células microgliales primaria que pueden utilizarse para la experimentación in vitro , sin la necesidad de 2 a 3 semanas de cultivo. Además, los pasos de caracterización rendimiento robustos datos funcionales sobre la microglia, ayudando a los estudios para mejorar nuestra comprensión de la polarización y cebado de estas células, que tiene fuertes implicaciones en el campo de la medicina regenerativa.

Introduction

Daño adquirido durante el período de inflamación, hipoxia isquemia y hemorragia perinatal puede tener una serie de secuelas a largo plazo. La teoría de la compleja Fisiopatología de la lesión cerebral perinatal es involucrar a la inflamación y la isquemia con posterior muerte neuronal y axonal¹. La respuesta inmunitaria innata desempeña un papel importante en la cascada de eventos que llevan a lesión².

Microglia, las células inmunes residentes en sistema nervioso central (SNC), son los primeros respondientes a lesiones³. Microglia son tipos de células de plástico con ca....

Protocol

Los siguientes procedimientos han sido aprobados por el Comité de ética Animal en la Universidad de Monash. Se utilizaron ratones C57Bl6/J P3-6 de recién nacido sano para generar resultados representativos.

1. enzimática digestión

Nota: Es importante considerar la esterilidad al aislamiento y cultivo de células primarias. Y asegurando que el ambiente es tan estéril como sea posible, la disección inicial y la cosecha de cerebros murinos pueden completarse fuera una campana de flujo laminal, con pasos posteriores realizados dentro de una campana de flujo laminar.

1. Utilizar instrumentos estériles, eutanasia....

Results

Utilizando los métodos descritos aquí, poblaciones puras de microglia pueden ser aisladas y pueden estar listas para la caracterización mediante el análisis FACS y en vitro . Con 18 animales se pueden utilizar hasta por cull, con un rendimiento esperado de aproximadamente 450.000-600.000 las células microgliales. Es crucial confirmar primero la pureza de las células aisladas, y para ello análisis FACS fue realizada por la coloración de los dos marcadores CD45 y CD11b. identificac.......

Discussion

Microglia tienen la capacidad de ser pro - y antiinflamatoria, alterada por los estímulos del medio ambiente. Estudios anteriores han demostrado que la modulación de la activación de la microglía puede conferir neuroprotección. Su capacidad para proporcionar protección a las neuronas y reparar lesiones requiere más investigación para la comprensión actual de estas células complejas. Así, aislamiento de alta pureza primaria microglia es una técnica importante y útil. Este es un método relativamente rápido para la obtenció.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, glucosa baja, piruvato	Gibco	11885084
Antibiótico-Antimicótico (100X)	Gibco	15240062
DNaseI grado II de páncreas bovino	Sigma-Aldrich	10104159001
Papaína de látex de papaya, solución acuosa tamponada	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Suero fetal bovino, calificado, inactivado por calor	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Solución salina equilibrada de Hank (1X)	Gibco	14175-103
Solución salina equilibrada de Hank (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b Kit de selección positiva	StemCell Technologies	18770	Variante
de imán EasySepImán EasySep	StemCell Technologies	18000
Tampón EasySep	StemCell Technologies	20144
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Gibco	14040182
Tripsina (2,5%) (10X)	Gibco	15090-046
Rata purificada Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block™)	BD Biosciences	553141
Falcon 5mL Tubo de ensayo PP de alta claridad con fondo redondo, con tapón a presión,	Corning	352063
175cm² Matraz de cultivo celular de cuello angulado con tapón	ventilación Corning	431080
Lipopolisacáridos de Escherichia coli O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 Pocillos Microplacas tratadas con TC tamaño 96 Pocillos, transparente, poliestireno, fondo redondo	Corning	CLS3799
Paraformaldehído (polvo, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Conejo Anti-Iba1	Wako 01919741
Cabra Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077<
fuerte>FACS Anticuerpos	Compañía	Número de catálogo
V450,Rata,Anti-Ratón,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo E. coli roja BioParticles Conjugate	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Solución de yoduro de propodio	Miltenyi Biotech	130-093-233