El manuscrito describe un ensayo PCR digital basado en el chip para detectar una variante rara de transcripción CDH1 (CDH1a) en congelado normal y los tejidos del tumor obtenidos de pacientes con cáncer gástrico.
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Artículo de método
Detección de una variante rara transcripción de CDH1 en tejidos de cáncer gástrico congelado por PCR Digital basado en el Chip
En este artículo
Resumen
Resumen
CDH1a, una no-canónico transcripción del gen CDH1 , se ha encontrado para ser expresado en algunas líneas celulares de cáncer gástrico (CG), mientras que está ausente en la mucosa gástrica normal. Recientemente, se detectó CDH1a variante de transcripción en los tejidos del tumor congelado obtenidos de pacientes con GC. La expresión de esta variante en muestras de tejido fueron investigada por el chip digital PCR (dPCR) enfoque presentado aquí. dPCR ofrece el potencial para una medición precisa, robusta y altamente sensible de los ácidos nucleicos y cada vez más se utiliza para muchas aplicaciones en diferentes campos. dPCR es capaz de detectar blancos raros; Además, dPCR ofrece la posibilidad de cuantificación absoluta y precisa de los ácidos nucleicos sin necesidad de calibradores y curvas estándar. De hecho, el repartir de reacción enriquece el objetivo del fondo, que mejora la eficiencia de amplificación y tolerancia a los inhibidores. Tales características hacen dPCR una herramienta óptima para la detección de la transcripción rara CDH1a .
Introducción
El gen CDH1 codifica para E-cadherina, un factor clave en el mantenimiento del epitelio gástrico normal a través de la regulación de la adherencia, la supervivencia, proliferación y migración de células1. Pérdida de la proteína cadherina-como resultado del germline deletéreo o alteraciones somáticas de CDH1 se han asociado con el desarrollo del GC2,3. Otras transcripciones resultantes del intrón 2 del gen también han presumido para desempeñar un papel en la carcinogénesis gástrica4,5. En particular, un tal tran....
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Protocolo
El protocolo sigue las pautas del Comité de ética de investigación humana de primera.
Nota: Este procedimiento está diseñado específicamente para la detección de un bajo número de moléculas de cDNA en tejidos humanos, congelado. Las secciones de tejido se han reducido en hielo seco, mientras que siguen congeladas, de tumor gástrico paciente derivado previamente validado o muestras de tejido normal.
1. purificación y aislamiento de ARN
-
Extracción de RNA
Nota: El aislamiento de RNA se lleva a cabo bajo la campana con un producto específico (véase Tabla de materiales).....
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Resultados
Utilizando el procedimiento presentado aquí, se revisaron para la expresión de la variante rara transcripción CDH1a en tejidos gástricos congelado. El análisis de dPCR fue realizado en muestras de tejido de normal y cáncer 21-emparejados y en 11 muestras de tumor adicionales. CDH1a era perceptible en los tumores de 15 clientes de los 32 (47%), mientras que no hay muestras de tejido normal demostraron la presencia de esta rara transcripción5. En nu.......
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Discusión
dPCR fue desarrollado originalmente para el ADN molecular medidas10,11,12,13 y en el tiempo que esta tecnología fue adaptada para la cuantificación de microRNAs y RNA transcripciones5, 14,15. En este protocolo hemos ampliado la lista de aplicaciones que incluyen la detección de las transcripciones rar.......
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Divulgaciones
Los autores no divulgan conflictos de interés para este trabajo.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Gráinne Tierney por asistencia editorial.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo TRIazol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Glucógeno 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute Kit de limpieza | QIAGEN | 74204 | |
| iScript Kit de síntesis de ADNc | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| Ensayo de diseño personalizado CDH1a IDT | Tecnologías integradas de ADN (IDT) | NA F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [concentraciones de ensayo optimizadas para dPCR: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] | |
| QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Termociclador Scientific | 75002402 | |
| (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
| Sistema de PCR GeneAmp 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| Módulo de muestra de bloque plano doble | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| QuantStudio Base inclinable para bloque plano doble Sistema de PCR GeneAmp 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| Kit adaptador de chip de PCR digital QuantStudio 3D para termociclador de bloque plano | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| Cargador de chips de PCR digital QuantStudio 3D | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Instrument con cable de alimentación | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
Referencias
- van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule E-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
- Carneiro, P., et al. E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions. FEBS Le....
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Reimpresiones y permisos
