Flojedad de cromatina parece estar involucrada en el desarrollo potencial de blastómeros. Sin embargo, no se sabe si flojedad de la cromatina puede utilizarse como un índice confiable para el potencial desarrollo de embriones. Aquí, se ha descrito un sistema experimental en el que pueden desarrollar cigotos evaluados flojedad de cromatina a término.
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Artículo de método
Recuperación de fluorescencia cigóticos después del blanqueamiento foto análisis de cromatina holgura que permite el desarrollo del Full-term
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Resumen
Resumen
En proyección de imagen es una poderosa herramienta que permite el análisis de los eventos moleculares durante la ontogénesis. Recientemente, flojedad de la cromatina o apertura ha demostrado para estar implicado en el potencial de diferenciación celular de células madre embrionarias pluripotenciales. Previamente se informó de que, en comparación con las células madre embrionarias, cigotos albergan una estructura de cromatina muy flojos, lo que sugiere su asociación con su totipotencia. Sin embargo, hasta ahora, no ha sido abordada si esta estructura de la cromatina abierta muy aflojado es importante para el potencial de desarrollo embrionario. En el presente estudio, para examinar esta hipótesis, se desarrolló un sistema experimental en que cigotos que fueron analizadas por fluorescencia recuperación después del blanqueamiento foto puede convertirse a término sin ningún daño significativo. Lo importante, este sistema experimental necesita solamente un calentador termo placa además de un láser confocal de barrido microscopio. Los resultados de este estudio sugieren que la recuperación de la fluorescencia después de blanqueo foto (FRAP) análisis puede utilizarse para investigar si los eventos moleculares en cromatina cigóticas son importantes para el desarrollo del término.
Introducción
Después de la fertilización, la estructura de la cromatina se altera la dinámica y estructura de la cromatina cigóticos es entonces finalmente establecido1,2. Durante este período, en pronúcleos paternos, la proteína dominante de la cromatina cambia de protamina en histonas. La cromatina resultante es muy diferente de la de espermatozoides y ovocitos femeninos en varios puntos (por ejemplo, composición variante de histonas, modificación de histonas). Por lo tanto, cromatina cigóticas formada cree que es importante para el posterior desarrollo embrionario. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos para rev....
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Protocolo
Este estudio se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad de Yamanashi. El protocolo fue aprobado por el Comité de ética de los experimentos del Animal de la Universidad de Yamanashi (número de permiso: A24-50). Todas las cirugías fueron realizadas bajo anestesia tribromoethanol, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Un resumen ilustrado de los procedimientos y horarios se muestran en la figura 1 y tabla 1, respectivamente.
1. preparación de ARN mensajero (transcripciónIn Vit....
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Resultados
Análisis de zFRAP con eGFP-H2B
Correctamente producen mRNA codificación eGFP-H2B, que es visto como una banda cambiada de puesto había causada por poly un tizón (figura 2A), fue inyectado en el citoplasma de cigotos con un 2 º cuerpo polar en 1-3 h después de la inseminación (figura 2B). Ocho a 12 h después de la inseminación, cigotos con 2 pronúcleos mostrando la expresió.......
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Discusión
Según lo revelado en este estudio, el análisis de zFRAP no hace daño crítico al termino desarrollo, lo que sugiere que este método es una herramienta muy útil para mostrar la asociación entre eventos moleculares y el potencial del desarrollo embrionario. Durante la reprogramación, en la célula dos como estado de células madre embrionarias, por que el potencial diferencial de esas células llega a ser tan alto como la de embriones en estadío de dos células, flojedad de la cromatina cambia en eso comparable con la etapa de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura y Kana Kishida para proporcionar comentarios críticos y soporte técnico. Este trabajo fue parcialmente financiado por el programa Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología para promover la reforma de las universidades nacionales a M.O.; la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (16H 02593), Asada Science Foundation y la Fundación de ciencia de Takeda a T.W. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio de escaneo láser confocal | Olympus | FV1200 | FV1000 también se puede utilizar para el análisis FRAP (referencia #7) |
| Placa térmica | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Microscopio invertido | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilador | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulador | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| Plato de cultivo de 35 mm | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm; para FIV |
| Plato de cultivo de 60 mm | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm; para cultivo de embriones |
| plato de cultivo de 50 mm | Falcom | 351006 | estilo de 50 x 9 mm; para la manipulación en el escenario |
| Plato con fondo de vidrio de 50 mm | Matsunami | D910400 | plato de 50 mm, 27 mm y tamaño del orificio; para análisis FRAP |
| Aceite mineral | Espeialidad orgánica Productos químicos | 625071 | Para el análisis FRAP en los platos con fondo de vidrio |
| Aceite mineral | Sigma | M8410-1L | Para FIV y cultivo de embriones |
| capilar de vidrio | Drummond | 1-000-1000 | Para el manejo de cigotos de ratón |
| Vidrio de borosilicato | Prime tech | B100-75-10-PT | Para microinyección de ARNm Extractor de |
| micropipetas | Instrumento Sutter | P-97/FIV | Para la preparación de la inyección o la retención de la red (diámetro exterior: 80 y micro; m, diámetro interior: 10 y micro; m) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Kit | de transcripción Thermo Fisher scientific | AM1340 | |
| Kit de relaves Poly (A) | Thermo Fisher scientific | AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES tamponado HTF que contiene 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Plásmido de plantilla para eGFP-H2B mRNA (referencia #6) | ||
| NorthernMax Gly Colorante de carga de muestras | Thermo Fisher scientific | AM8551 | Para la electroforesis de ARNm transcrito in vitro |
| Fenol cloroformo isamil alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Cloroformo | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Medidor de potencia Otical | Hioki | 3664 | Medidor de potencia para la potencia del láser |
| Microscopio Estereoscópico | Olympus | SZX16 |
Referencias
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K.
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Reimpresiones y permisos
