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Artículo de método

Recuperación de fluorescencia cigóticos después del blanqueamiento foto análisis de cromatina holgura que permite el desarrollo del Full-term

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DOI:

10.3791/57068

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12 de junio de 2018

 ,  ,  , 
1Faculty of Life and Environmental Sciences, Department of Biotechnology, University of Yamanashi, 2Department of Integrated Bioscience, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, 3Advanced Biotechnology Center, University of Yamanashi

En este artículo

Resumen

Flojedad de cromatina parece estar involucrada en el desarrollo potencial de blastómeros. Sin embargo, no se sabe si flojedad de la cromatina puede utilizarse como un índice confiable para el potencial desarrollo de embriones. Aquí, se ha descrito un sistema experimental en el que pueden desarrollar cigotos evaluados flojedad de cromatina a término.

Resumen

En proyección de imagen es una poderosa herramienta que permite el análisis de los eventos moleculares durante la ontogénesis. Recientemente, flojedad de la cromatina o apertura ha demostrado para estar implicado en el potencial de diferenciación celular de células madre embrionarias pluripotenciales. Previamente se informó de que, en comparación con las células madre embrionarias, cigotos albergan una estructura de cromatina muy flojos, lo que sugiere su asociación con su totipotencia. Sin embargo, hasta ahora, no ha sido abordada si esta estructura de la cromatina abierta muy aflojado es importante para el potencial de desarrollo embrionario. En el presente estudio, para examinar esta hipótesis, se desarrolló un sistema experimental en que cigotos que fueron analizadas por fluorescencia recuperación después del blanqueamiento foto puede convertirse a término sin ningún daño significativo. Lo importante, este sistema experimental necesita solamente un calentador termo placa además de un láser confocal de barrido microscopio. Los resultados de este estudio sugieren que la recuperación de la fluorescencia después de blanqueo foto (FRAP) análisis puede utilizarse para investigar si los eventos moleculares en cromatina cigóticas son importantes para el desarrollo del término.

Introducción

Después de la fertilización, la estructura de la cromatina se altera la dinámica y estructura de la cromatina cigóticos es entonces finalmente establecido1,2. Durante este período, en pronúcleos paternos, la proteína dominante de la cromatina cambia de protamina en histonas. La cromatina resultante es muy diferente de la de espermatozoides y ovocitos femeninos en varios puntos (por ejemplo, composición variante de histonas, modificación de histonas). Por lo tanto, cromatina cigóticas formada cree que es importante para el posterior desarrollo embrionario. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos para revelar los detalles de la estructura de la cromatina cigóticos durante largos períodos, nunca han sido los métodos para evaluar la calidad de cigotos o predecir su desarrollo de término de la etapa de una célula mediante el análisis de su estructura de la cromatina establecido.

En el estudio anterior, se descubre que los cigotos tienen una estructura de cromatina muy flojos3. Actualmente, se cree que un factor importante para la diferenciación celular potencial de células madre embrionarias (ES)4flojedad de cromatina o apertura. Células madre embrionarias no presentan homogeneidad en la naturaleza, pero son bastante heterogéneos; en las colonias de células ES, algunas transitoriamente adquieren un mayor potencial de diferenciación comparable a blastómeros de embriones en estadío de dos células. Durante esta transición en la célula dos como estado, flojedad de la cromatina en ES células cambios en lo que es comparable con la etapa de dos células de embriones5. Así, flojedad de cromatina parece ser importante para el potencial de diferenciación celular y es posible que abra ampliamente la cromatina en cigotos es útil para la evaluación del potencial de desarrollo cigóticos.

En proyección de imagen es una poderosa herramienta que permite para el análisis de eventos moleculares durante la ontogénesis, ya que este método permite el posterior desarrollo y desarrollo incluso termino6. Como uno de los métodos de proyección de imagen vivo, análisis FRAP se ha utilizado para examinar la holgura de la cromatina en embriones preimplantación y ES células3,4,5. Si flojedad de cromatina cigóticos puede analizarse sin un efecto perjudicial sobre el desarrollo del término por el FRAP análisis, puede ser una valiosa herramienta para la evaluación de la calidad de los embriones en la etapa de una célula. Sin embargo, no se han examinado los efectos sobre el desarrollo del término por este método experimental. Recientemente, se desarrolló un sistema experimental con FRAP para evaluar la flojedad de cromatina cigóticos. Porque esto era un nuevo sistema de observación de cigotos, se dice que como FRAP cigóticos (zFRAP). zFRAP no afectó críticamente el término desarrollo y ha sido divulgado a otra parte7. En este informe se describe el protocolo de este método experimental.

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Protocolo

Este estudio se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad de Yamanashi. El protocolo fue aprobado por el Comité de ética de los experimentos del Animal de la Universidad de Yamanashi (número de permiso: A24-50). Todas las cirugías fueron realizadas bajo anestesia tribromoethanol, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Un resumen ilustrado de los procedimientos y horarios se muestran en la figura 1 y tabla 1, respectivamente.

1. preparación de ARN mensajero (transcripciónIn Vitro del mRNA de eGFP-H2B)

  1. Alinear 5 μg de plantilla ADN pTOPO-eGFP-H2B3,7 con 30 U de no me en 50 μl a 37 ° C durante la noche.
  2. Recoger 1,5 μl de ADN digerido para confirmar ya sea completamente digerido por electroforesis.
    1. Aplicar 1,5 μl y 3-5 μl de ADN digerido con una carga de tinte al pozo del gel de agarosa al 2%, respectivamente y sometidos a electroforesis.
      Nota: Si completamente digerida, se observa una sola banda (aprox. 5 kb). Sin digerir DNA se utiliza como un control, que aparece en una posición diferente.
  3. Añadir 151,5 μl de ddH2O y 200 μL de fenol/cloroformo/isoamyl alcohol (25:24:1) para el restante digiere ADN.
    1. Mezclar vigorosamente en el vórtex.
    2. Centrifugar a velocidad máxima durante 15 minutos.
  4. Recuperar el sobrenadante y añadir 200 μL de cloroformo.
    1. Mezclar vigorosamente en el vórtex.
    2. Centrifugar a velocidad máxima durante 15 minutos.
  5. Recuperar el sobrenadante y añadir 20 μl de acetato de sodio de 3 M y 1,5 μl de ethachinmate.
    1. Mezclar vigorosamente en el vórtex.
    2. Añadir 550 μl de etanol al 100% y luego se mezclan vigorosamente en el vórtex.
    3. Centrifugar a velocidad máxima durante 15 minutos.
    4. Desechar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70%.
    5. Secar el pellet por evaporación de 5-10 minutos.
  6. Disolver el precipitado plásmido ADN en 8 μl de agua libre de nucleasa.
  7. Evaluar la concentración de plásmido (concentración esperada es de 300-500 ng/μL) con nanodrop, siguiendo instrucciones del fabricante.
  8. Cabo en vitro de la transcripción de mRNA codificación eGFP-H2B con 1 μg de DNA purificado como plantilla en 20 μl de volumen de reacción total siguiendo las instrucciones del fabricante.
    1. Después de la transcripción en vitro , añadir 36 μL de agua y recuperarse 1,5 μl μl 56 de ARNm sintetizada para el análisis por electroforesis (sin poli A).
  9. Realizar colas de poli A de ARNm sintetizada en un volumen de reacción de 100 μl, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  10. Añadir 60 μL de solución de precipitación de cloruro de litio para la poli un mRNA cola de eGFP-H2B y luego Mezcle vigorosamente.
    1. Cool a-30 ° C durante 30 minutos.
    2. Centrifugar a velocidad máxima durante 15 minutos.
    3. Desechar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70%.
    4. Secar el pellet por evaporación de 5-10 minutos.
  11. Disolver el precipitado con 20 μl de agua libre de nucleasa por calentamiento a 55 ° C durante 30 minutos.
  12. Evaluar la concentración del mRNA precipitado con nanodrop. Diluir a 500 ng/μl con agua libre de nucleasas y conservar a-80 ° C hasta su uso.
  13. Confirmar recomendado: producción de mRNA; tema 1 μl de mRNA con/sin (obtenido en la 1.8.1 y 1,12 medidas, respectivamente) poly una cola mezclada con 1.5 μl de bromuro de etidio 0,1 mg/mL y 3 μl de colorante de carga de la muestra para el análisis de electroforesis. Volumen aplicado fue de 5.5 μl.
    Nota: Si la cola de poli A tuvo éxito, la banda cambió de puesto comparada con el mRNA sin poli un tizón debe observarse (figura 2A).

2. preparación de ratones machos vasectomizados

  1. Pesan los ratones macho ICR en 8-12 meses utilizando una escala de peso.
  2. Inyectar por vía intraperitoneal ratones machos con 0.7 - 0.9 mL 1.2% tribromoethanol la anestesia.
    Nota: La cantidad de anestesia depende del tamaño del ratón. Por ejemplo, un ratón pesa 40 g se inyecta con 0,8 mL de anestesia tribromoethanol.
  3. Moje la baya con etanol al 70%.
  4. Hacer un pequeño corte (3-5 mm) en la baya y luego realizar una incisión en la pared muscular con la ayuda de tijeras.
    Nota: Tijeras y pinzas deben limpiarse con etanol al 70% antes de iniciar la cirugía.
  5. Agarre un cojín gordo con pinzas y tire suavemente hacia fuera. Entonces, los testículos y conductos deferentes aparecen.
    Nota: El conducto deferente es un tubo en forma de U y con un vaso rojo de la sangre.
  6. Amarrar los conductos deferentes en los dos puntos con suturas quirúrgicas y luego corte la parte media entre los puntos de atado.
  7. Suavemente empuje hacia atrás el cojín gordo y del testículo en la baya.
    1. Repetir la cirugía con el testículo restante.
  8. Coser la pared muscular con dos puntos con sutura quirúrgica.

3. FECUNDACIÓN IN VITRO

  1. Inyectar de 8 - 10 - vieja de semana femeninos B6D2F1 (BDF1) ratones por vía intraperitoneal con IU 7,5 gonadotropina coriónica equina (eCG) y gonadotropina coriónica (hCG) en el intervalo h 46-50.
  2. Preparar gotas de 300 μL humano tubárico (HTF)8 medios flúidos para capacitación e inseminación 1 día antes de FIV en un plato de 30 mm, cubre estas gotas con el aceite mineral sobre la mesa de laboratorio y luego preincubate en una incubadora durante la noche.
  3. Madurados ratones ICR machos de sacrificio mediante dislocación cervical. Diseccionar cauda epidídimo con aguja 27 G y recoger el espermatozoide. Cultura para la capacitación en 300 μL de medio HTF para 1-2 h a 38 ° C.
  4. 16 h después de la inyección de hCG, sacrificar ratones hembra super ovuladas por dislocación cervical. Transferencia de la ampolla del oviducto en aceite mineral al lado de medio HTF y luego extraer células del cúmulo y complejos ovocitos de esta ampolla del oviducto por una aguja de 30 G en el medio HTF de inseminación incuba.
    Nota: Algunos ratones hembras no demuestran a menudo la ovulación a pesar del tratamiento la super ovulación. Ampolla del oviducto ampliada es una señal de la ovulación.
  5. Después de la capacitación, transferencia de 2-3 μl del espermatozoide capacitado en medios HTF de inseminación en la que se recogieron los ovocitos ovulados.
  6. 1 h después de la inseminación, recoger los cigotos fecundados y tratarlos con la hialuronidasa en 100 μg/mL durante 10 minutos en medios de comunicación CZB9 .
    Nota: Cuando la inseminación se realiza correctamente, 1 h después de la inseminación, los cigotos fecundados con el cuerpo de polar de 2nd se observan. Si se utiliza esperma menos o baja calidad, se observan sólo poco cigotos con el cuerpo de polar de 2nd . Además, si se utilizan muchos espermatozoides para inseminación, polyspermy ocurre. Inseminación correcta conduce a cigotos con pronúcleos masculinos y femeninos. Utilizando estos criterios, es posible encontrar si la inseminación se realiza bien o no.
    1. Después del lavado en los medios de comunicación CZB, exponga los cigotos con un segundo cuerpo polar a microinyección con eGFP-H2B mRNA.

4. preparación de la cámara y pipetas de microinyección

  1. Diluir el RNA codificación eGFP-H2B con agua libre de nucleasa para obtener una concentración de 250 ng/μl.
  2. Preparar 2-3 gotas de PVP-HTF eGFP-H2B gotas mRNA y 5-6 gotas de Hepes tampón CZB (H-CZB) gotas en el plato de 60 milímetros. Cubrir estas gotas con aceite mineral.
    Nota: Estas preparaciones pueden realizarse en el Banco de laboratorio. No hay ningún requisito para el uso de cabina de flujo laminar.
  3. Tire de vidrio borosilicato con un extractor de micropipeta (por ejemplo, P = 500, calor = 825, tire = 30, vel = 120 y tiempo = 200)
  4. Después de romper la punta de la pipeta, doblar la pipeta de microinyección de vidrio tirado cerca de la punta (−300 μm detrás) en alrededor de 30 ° con una microforge.

5. microinyección

  1. Apague el calentador de la placa en la etapa de instrumental quirúrgico para evitar la matanza de los cigotos con un piezo durante la inyección de mRNA.
  2. Lavar y cubrir el interior de agujas de inyección en HTF tamponado con HEPES que contiene 10% PVP (JcJ-HTF).
  3. Recoger los cigotos fecundados con un cuerpo de polar de 2nd (figura 2B) y transferencia de cigotos de 20-25 en la cámara de la platina del microscopio conectada un micromanipulador.
  4. Llene el mRNA de eGFP-H2B diluida en tubos capilares de vidrio borosilicato de las puntas.
  5. Sostenga el zigoto con una pipeta de sujeción y luego romper la zona pelúcida y la membrana citosólica con un accionamiento piezoeléctrico.
  6. Inyectar 10 pL del mRNA en el citoplasma de los cigotos. Final de inyección de mRNA dentro de 10 minutos para evitar daños causados por los cigotos fuera de la incubadora de cultivo más largo.
    Nota: El volumen de inyección debe ser tan grande como el cuerpo polar de 2nd . Si la cantidad de mRNA inyectado es demasiado grande, es posible causar la fracción libre de eGFP-H2B, que pueda afectar a la fracción móvil.
  7. 10 min después de la microinyección, lavar en al menos 3 gotas y luego la cultura los cigotos inyectados en CZB a 38 ° C hasta su análisis zFRAP.

6. zFRAP análisis

  1. 1 h antes de la zFRAP análisis, encienda el láser y la placa conectada a la etapa del microscopio confocal. Ajustar la temperatura a 38 ° C.
  2. Puesto 6-10 μl de medio tamponado con HEPES CZB cubierto con aceite mineral en el plato de fondo de vidrio de 60 mm y caliente en el calentador hasta colección de cigoto.
  3. 8 - 12 h después de la inseminación, recoger cigotos expresaban eGFP-H2B y transferencia 6-10 μl de 5-10 previamente calentado gota mediana CZB tamponado con HEPES.
    Nota: Para evitar el cultivo más largo fuera de la incubadora, 5-10 expresaban eGFP-H2B cigotos fueron utilizados en cada análisis. 5 a 10 cigotos pueden ser analizadas dentro de 1 h.
  4. Establecer las condiciones de blanqueaba y proyección de imagen según las instrucciones del fabricante. El caso de un láser confocal de barrido microscopio (Tabla de materiales) se muestra a continuación:
    1. Uso 60 X lente de aceite (60 X 60 X / 1.35 aceite).
      Nota: Los lentes con mayor sensibilidad mayor aumento (mayor apertura numérica) Mostrar.
    2. Establecer velocidad de escaneado como 4.0 μs/Pixel y tamaño como "512" en"adquisición" (suplementario Figura 1).
    3. Aumentar zoom Digital "5" (adicional Figura 1).
      Nota: Un zoom mayor es necesaria para reconocer si deriva de foco se produce o no.
    4. Abrir lista de tinte (suplementario Figura 1) y luego elegir "EGFP". Establecer tiempo de observación como 1.6 s (intervalo se define como "free-run") (figura 1 complementaria)
      Nota: Más puntos de observación pueden causar datos más detallados, pero también puede causar fototoxicidad. En el análisis de zFRAP, un tiempo de observación s 1.6 parece ser suficiente para detectar la asimetría parental de la flojedad de la cromatina.
    5. Configurar el número de cuadros como 12 en total (suplementario Figura 1).
    6. Iniciar panel de "Configuración del estímulo" y haga clic en "Main" en UseScanner. Sistema de escaneo velocidad 10.0 μs/Pixel. Haga clic en "Activación en serie" y luego poner el preencendido como "Marcos de 3" y el tiempo de activación como "5 segundos" (suplementario Figura 1).
    7. Haga clic en "Enfoque x 2" y ajustar el enfoque y luego "Stop".
    8. Set blanqueamiento y energía del laser de la proyección de imagen (477 nm) en 110 y 15 MW, respectivamente, por ajuste de "gage energía del laser" (suplementario Figura 1).
      Nota: Blanqueo muy fuerte puede causar un área más grande de blanqueado, que causa dificultades para el análisis cuantitativo. Para la medición de la potencia del láser, utilice un medidor de potencia. Es importante confirmar la potencia del láser para evitar el efecto del deterioro relacionado con el tiempo de la potencia del láser.
    9. Haga clic en "Clip Rect" (suplementario Figura 1) en el panel de configuración de estímulos. La región de interés (ROI; rojo; ROI #1B) como 40 x 40 píxeles (7,6 μm2). Preparar una región de referencia (REF; verde; ROI #2) y un fondo (BG; azul; ROI #3) usando "copiar ROI" y "pegar ROI" (botón de clic del ratón).
      Nota: Tamaño de píxel se puede establecer a través del "Administrador de ROI", que se puede llamar haciendo clic en el botón derecho del ratón cuando el cursor está en el retorno de la inversión. ROIs más grandes se cree que son mejor ya que puede estandarizar la dispersión de la puntuación de zFRAP. Sin embargo, demasiado grande de un ROI no puede utilizarse para este análisis porque es difícil evitar el cuerpo del precursor del nucleolo (NPB). eGFP-H2B en este compartimiento fue pensado para ser libres de cromatina y demostró notable mayor movilidad3. Áreas de ROI y REF deben ser separadas lo más posible. Si estas dos regiones están cercanas, blanqueo puede afectar también la región de REF.
    10. Haga clic en "Live" en la barra de herramientas y comience a "Vivir parcela" (suplementario Figura 1).
      Nota: Vivo indica la intensidad de la señal de fluorescencia en cada retorno de la inversión y se utiliza para ajustar la energía del laser con alto voltaje. Tenga en cuenta que si ROI no se selecciona, ninguna intensidad se detectaría en panel en parcela.
    11. Determinar la posición de retorno de la inversión
      Nota: Retorno de la inversión se puede mover arrastrándolos a la posición deseada en pronúcleos. (1) ser seguro evitar el nucleolo y (2) ajuste el ROI todo en el nucleoplasia. No contienen la región fuera del área de la membrana nuclear (citoplasma) de retorno de la inversión. La localización de eGFP-H2B es altamente restringida en el nucleoplasia así que es fácil de encontrar si ROI contiene citoplasma o no por la fluorescencia de eGFP-H2B. Pronúcleos masculinos tienden a ser más grandes que las hembras, que se localizan a menudo cerca del cuerpo de polar de 2nd . Durante el uso de estos criterios, el juez los pronúcleos masculinos o femeninos.
    12. Haga clic en "Enfoque x 2" (suplementario Figura 1) y ajuste el medidor de energía HV del canal para EGFP en intensidad de fluorescencia a alrededor de 2000 (la intensidad de la fluorescencia puede verse en la ventana de "en terreno").
  5. Haga clic en "Tiempo" y luego "XY" (suplementario Figura 1) para iniciar el análisis de zFRAP.
    Nota: Si convenientemente se selecciona el botón "Time", "t" aparece en el botón de "XY".
    1. Haga clic en "hecho" (suplementario Figura 1), que aparece después de la proyección de imagen de FRAP cerca de la tecla"XY" y luego obtener datos analizados por el FRAP.
    2. Guarde el archivo "ver imagen 2D XXXXX" como un archivo de nombre recomendado: (formato de archivo de oib.) por "guarda como" (Ctrl + Mayús + S puede ser también utilizado).
    3. Seleccione ROI, REF y BG (Ctrl + A puede también usarse) "Análisis de Series" en ventana "imagen 2D de la vista".
    4. Obtener datos FRAP de fila y haga clic en "guardar" botón en la ventana de parcela vivo.
      Nota: La fila datos cuantitativos FRAP se guardan como un archivo csv.
  6. Para ningún control del zFRAP, poner un poco de los cigotos inyectados con el mRNA de la gota, que está cerca del borde de los platos de fondo de cristal para evitar el efecto de la observación de la fluorescencia.

7. datos cálculo

  1. Durante el uso de los datos cuantitativos obtenidos, hacer la gráfica de la "curva de recuperación" y "fracción móvil" por Excel como se muestra en las referencias3,7 con algunas modificaciones (ver más abajo y suplementario excel archivo).
  2. Calcule la intensidad relativa restando el valor de BG de las de retorno de la inversión y REF en 12 cuadros para cada punto del tiempo.
  3. Dividir el valor de retorno de la inversión por el de la REF. Como resultado, se pueden obtener 12 puntuaciones estandarizadas intensidad relativa en cada momento.
  4. Calcular el promedio de la puntuación relativa para el retorno de la inversión en 3 imágenes tomadas antes foto de blanqueo.
  5. Calcular la tasa de recuperación. Brecha que 12 obtuvieron puntajes relativos para el retorno de la inversión en las imágenes tomadas en cada momento (obtenida en 7.1.2.) por el promedio de la puntuación relativa antes fotos (obtenidas en 7.1.3.). Dibujar la curva de recuperación con el uso de estos resultados (Figura 2E).
  6. Calcular la tasa de decoloración.
    Nota: Blanqueo tasa (%) = 100 - tasa de recuperación de imagen deth 4.
  7. Calcular la fracción móvil (MF) mediante la fórmula siguiente10,11,12
    MF (%) = tasa de recuperación de 12th (en el punto final) - tasa de recuperación de 4th / blanqueo tasa × 100.

8. transferencia de embriones de

  1. Se aparean a hembras ICR maduradas en 8-12 meses con vasectomía ratones ICR machos la noche antes de transferir el embrión por permitirles estar en la misma jaula durante la noche.
  2. Recoger los embriones que fueron analizados zFRAP y decidieron a desarrollar la etapa de dos células.
  3. Inyectar por vía intraperitoneal ratones hembra con 0.7 - 0.9 mL tribromoethanol 1.2% la anestesia o con 0,35 - 0,45 mL de 0.75/4/5mg/kg midazolam/medetomidina/butorfanol mezclado agentes antes de la transferencia de embriones.
    Nota: El volumen de anestesia es determinado por el peso corporal de ratones. Tribromoethanol: 0,2 mL/10 g de peso corporal; midazolam/medetomidina/butorfanol mezclado agentes: 0,1 mL/10 g de peso corporal.
    1. Transferencia de estos embriones en fase de dos células en el oviducto de seudopreñadas ratones ICR femeninos con un tapón vaginal 0.5 días post coitum (dpc).
    2. Después de la transferencia de embriones, pusieron los ratones hembra en el calentador situado en 37 ° C hasta que se despiertan.
  4. A 18.5 dpc, sacrificar a la madre de alquiler por dislocación cervical y recuperar los cachorros derivados de cigotos zFRAP analizado por la sección cesariana. Algunos de los cachorros recuperados fueron entregados a la madre adoptiva y sus pesos corporales fueron evaluados cada semana.

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Resultados

Análisis de zFRAP con eGFP-H2B

Correctamente producen mRNA codificación eGFP-H2B, que es visto como una banda cambiada de puesto había causada por poly un tizón (figura 2A), fue inyectado en el citoplasma de cigotos con un 2 º cuerpo polar en 1-3 h después de la inseminación (figura 2B). Ocho a 12 h después de la inseminación, cigotos con 2 pronúcleos mostrando la expresió...

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Discusión

Según lo revelado en este estudio, el análisis de zFRAP no hace daño crítico al termino desarrollo, lo que sugiere que este método es una herramienta muy útil para mostrar la asociación entre eventos moleculares y el potencial del desarrollo embrionario. Durante la reprogramación, en la célula dos como estado de células madre embrionarias, por que el potencial diferencial de esas células llega a ser tan alto como la de embriones en estadío de dos células, flojedad de la cromatina cambia en eso comparable con la etapa de ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura y Kana Kishida para proporcionar comentarios críticos y soporte técnico. Este trabajo fue parcialmente financiado por el programa Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología para promover la reforma de las universidades nacionales a M.O.; la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (16H 02593), Asada Science Foundation y la Fundación de ciencia de Takeda a T.W. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio de escaneo láser confocalOlympusFV1200FV1000 también se puede utilizar para el análisis FRAP (referencia #7)
Placa térmicaTokai HitTP-110RH26
Microscopio invertidoOlympusIX71
Micro manupiladorNarishigeMMO-202ND
Pieze Micro MicromanipuladorPrime techPMAS-CT150
Plato de cultivo de 35 mmFalcom35100835 x 100 mm; para FIV
Plato de cultivo de 60 mmFalcom35100760 x 15 mm; para cultivo de embriones
plato de cultivo de 50 mmFalcom351006estilo de 50 x 9 mm; para la manipulación en el escenario
Plato con fondo de vidrio de 50 mmMatsunamiD910400plato de 50 mm, 27 mm y tamaño del orificio; para análisis FRAP
Aceite mineralEspeialidad orgánica Productos químicos625071Para el análisis FRAP en los platos con fondo de vidrio
Aceite mineralSigmaM8410-1LPara FIV y cultivo de embriones
capilar de vidrioDrummond1-000-1000Para el manejo de cigotos de ratón
Vidrio de borosilicatoPrime techB100-75-10-PTPara microinyección de ARNm Extractor de
micropipetasInstrumento SutterP-97/FIVPara la preparación de la inyección o la retención de la red (diámetro exterior: 80 y micro; m, diámetro interior: 10 y micro; m) 
Microforge  NarishigeMF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Kitde transcripción Thermo
Fisher scientific		AM1340
Kit de relaves Poly (A)Thermo
Fisher scientific		AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)IrvineSceientific99311HEPES tamponado HTF que contiene 10% PVP
Sodium HEPESSigmaH3784
pTOPO eGFP-H2BPlásmido de plantilla para eGFP-H2B mRNA (referencia #6)
NorthernMax Gly Colorante de carga de muestras Thermo
Fisher scientific		AM8551Para la electroforesis de ARNm transcrito in vitro
Fenol cloroformo isamil alcoholnacalai tesque25970-14
Cloroformonacalai tesque  08401-65
Not ITOYOBONOT-111X
EthachinmateWAKO318-01793
3664 Medidor de potencia OticalHioki3664  Medidor de potencia para la potencia del láser
Microscopio EstereoscópicoOlympusSZX16

Referencias

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  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
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  4. Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
  5. Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
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