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Artículo de método

Aislamiento de las células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano estudios fenotípica y funcional

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DOI:

10.3791/57100

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13 de marzo de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un método para aislar y purificar las células dendríticas de diferentes compartimentos anatómicos en el tracto reproductor femenino humano para la evaluación de sus características fenotípicas y funcionales. Este método puede adaptarse para aislar a otras células inmunes o las células dendríticas de otros tejidos de la mucosa.

Resumen

La caracterización de las humanos las células dendríticas (DCs) residentes en los tejidos de la mucosa es un reto debido a la dificultad en la obtención de muestras, y el bajo número de DCs presenta por tejido. Sin embargo, el fenotipo y la función de DCs es modificada por el ambiente del tejido, es necesario analizar poblaciones residentes de DC de tejidos, como sangre había derivada DCs incompleto reflejar las complejidades de la DCs en los tejidos. Aquí presentamos un protocolo para aislar DCs del humano aparato reproductor femenino (FRT) utilizando a especímenes de la histerectomia que permite el análisis fenotípicas y funcionales. El protocolo consiste en la digestión del tejido para generar una célula mixta de suspensión celular, seguido por la selección de grano magnético positivo. Nuestro protocolo de digestión de tejido no hienden marcadores de superficie, que permite el análisis fenotípico y funcional de DCs en el estado estacionario, sin activación de incubación o de la célula durante la noche. Este protocolo puede ser adaptado para el aislamiento de otros tipos de células inmunes o aislamiento de DCs de otros tejidos.

Introducción

El FRT tiene la doble función de proteger contra patógenos permitiendo la implantación y el embarazo1. Para lograr esto, el FRT está compartimentado, con cada región anatómica mostrando características histológicas, inmunológicas y funcionales1.

DCs presentes en superficies de la mucosa que en contacto con microbios en el pulmón, el intestino y el tracto genital y vigilancia inmune por patógenos potenciales2. DCs tienen la capacidad única de primer ingenuo t-células y desencadenar respuestas inmunitarias adaptativa3. DCs en la FRT se especializan también tolerar antígenos extraños, como los que se encuentran en los espermatozoides y el desarrollo del feto, para permitir el embarazo acertado4. Por lo tanto, dependiendo de la ubicación, el fenotipo de la DC y la función va ser distintos. Es conocido que los DCs están fuertemente influenciadas por el ambiente del tejido, tal que su número, fenotipo y funciones son modificadas por el ambiente de tejidos en que residen3. Por lo tanto, para entender el papel que en las enfermedades infecciosas, embarazo y cáncer en la FRT FRT DCs, residente DCs necesitan ser estudiados, desde sangre derivada DC modelos son insuficientes para abordar las complejidades reglamentarias encontradas los tejidos de la FRT.

La caracterización de tejido humano DCs residente es difícil debido al bajo número de células presentes en los tejidos de la mucosa y la dificultad de obtener muestras de tejido humano. DCs se han estudiado en la FRT usando immunohistochemistry5,6, que informa sobre la ubicación del celular dentro del tejido, pero excluye los estudios funcionales y está limitada en el número de identificación de marcadores celulares que pueden analizarse a la vez. Por otra parte, los protocolos de aislamiento de célula para análisis cytometric del flujo han sido desarrollados7,8,9. Algunos de estos protocolos, aprovechando la capacidad migratoria de DCs para aislar las células que migran. Estos métodos generalmente requieren incubaciones durante la noche y la selección de DCs activados, pero no permiten el estudio de DCs en el estado estacionario.

Aquí, usando especímenes de la histerectomia, optimizado un protocolo para aislar DCs de diferentes sitios anatómicos en la FRT, el endometrio (EM), el endocervix (CX) y el ectocérvix (ECX), que permite el análisis fenotípicas y funcionales. Utiliza un protocolo no proteolytic digestión enzimática, podemos proceder inmediatamente después de la digestión de tejido a células aislamiento y flujo cytometric caracterización sin activación de la célula. Mediante citometría de flujo multicolor y adaptación de estudios funcionales de bajo número de células, podemos identificar y caracterizar los subconjuntos raros de DCs en los diferentes sitios de la FRT.

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Protocolo

Se realizaron estudios en seres humanos según los principios expresados en la declaración de Helsinki. Los estudios fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de Dartmouth College y el Comité para la protección de sujetos humanos (CPHS). Consentimiento informado escrito fue obtenido antes de la cirugía de HIV-negative mujeres sometidas a histerectomía en el Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Líbano, NH). Patólogos entrenados seleccionan muestras de tejido de la EM, CX y ECX, libre de lesiones patológicas y distante de los sitios de la patología. Se obtuvieron muestras de sangre de donantes sanos voluntarios reclutados en Dartmouth Hitchcock Medical Center. Los donantes de sangre eran anónimos. Tejidos EM, CX y ECX recientemente aislados de la sala de operaciones fueron trasladados a patología para aislamiento y clasificación previa transferir a nuestro laboratorio en tubos de polipropileno estériles, separados.

1. enzimática digestión de los tejidos

Nota: Utilizar material estéril y trabajar en un gabinete de seguridad biológica.

  1. Preparación equilibrio sal solución (HBSS de un Hank modificado) 1 x HBSS con rojo de fenol, 100 U/mL penicilina-estreptomicina, 0,35 g/L de NaHCO3y 20 mM HEPES.
  2. Preparar el cóctel enzimático (modificado desoxirribonucleasa de 0.01% [wt/vol] HBSS, 450 U/mL colagenasa IV, I y D-glucosa de 2 mg/mL). Pasar la solución a través de un filtro estéril de 0,22 μm. Lo ideal es preparar la enzima de digestión en el día de uso, pero puede ser congelado a-20 ° C para el almacenamiento. Evitar congelaciones y descongelaciones ciclos repetidas.
  3. Enjuague el tejido con modificado HBSS y colóquelos en una placa de Petri 100 x 15 mm2 . Ajustar el tamaño del plato de Petri basada en la cantidad de tejido disponible y el volumen de enzima cóctel utilizado (ver paso siguiente 1.4.2).
    Nota: Los tejidos varían en tamaño dependiendo de la muestra quirúrgica de la patología, que van desde 1-10 g.
  4. Tratamiento con bisturí desechable y pinzas:
    1. Añadir unos 3 mL de enzima de digestión cóctel al tejido para evitar que se sequen durante el corte.
    2. Utilice pinzas para estabilizar el tejido y pique con un bisturí para aumentar la superficie de los tejidos expuestos a la enzima de digestión cóctel. Cortar el tejido en trozos pequeños (< 2 mm en un lado). Añadir el cóctel de enzima de digestión suficiente para cubrir todas las piezas del tejido (5 mL/g de tejido). Coloque la tapa en la caja Petri.
    3. Incubar a 37 ° C con 5% CO2 en un rotador a aproximadamente 80 rpm durante 45 min., asegúrese de que la velocidad del rotor completamente mezcla el cóctel de la enzima de digestión sin derramarse o producir burbujas.
    4. Visualizar la preparación de tejido con un microscopio de luz invertido con el 4 X y 10 X objetivos.
      Nota: Después de la digestión, pequeños fragmentos de tejido y una suspensión mixta incluyendo las glándulas epiteliales visibles deben estar presentes (ver figura 1A).

2. separación de las células

  1. En un ambiente estéril, coloque una malla de 250 μm tenso con soporte en un plato de Petri de 150 x 15 mm2 . Asegúrese que la malla es aproximadamente 0,5 cm por encima de la superficie de la placa de Petri.
  2. Mojar la malla con 2 mL de HBSS modificado y transferir el tejido digerido a la malla.
  3. Con la superficie plana de un émbolo de la jeringa de 10 mL, suavemente pero con firmeza, moler el tejido digerido picadito a través de la malla.
    PRECAUCIÓN: Molienda demasiado agresivamente dañará el acoplamiento y aumentar la mortalidad celular. Este paso será separar las células epiteliales y células del estroma (incluyendo las células inmunes) el tejido conectivo y el moco.
  4. Una vez que los fragmentos de tejido han sido completamente dispersados, elevar la malla y el soporte de 2-3 cm por encima del plato de Petri y enjuague con 3 mL de modificado HBSS recuperar células adicionales.
  5. Recoger la suspensión de células. Coloque la malla de 20 μm con soporte en una placa de Petri y húmedas con 2 mL de HBSS modificado. Verter la suspensión de células a través de la malla que sostiene la malla 2-3 cm por encima del plato de Petri y enjuague con 6 mL de HBSS modificado.
    Nota: Este paso separa las hojas epiteliales, que se conservan en la parte superior, de las células que pasan a través de la malla. El flujo a través es una suspensión mixta, que incluye las células inmunes y los fibroblastos estromales.
  6. Recoger el mezclado de la célula suspensión y centrifugar a 500 x g durante 10 minutos, aspirar el líquido y resuspender el precipitado en 4 mL de HBSS modificado para la centrifugación de gradiente de densidad.
  7. Capa de la suspensión de células mixtas sobre 3 mL de solución de polysucrose y centrifugar a temperatura ambiente a 500 x g por 30 min con ningún freno. Recoger la banda blanca de la parte superior de la solución de polysucrose y lavar con PBS.
    Nota: Esta fracción es la suspensión enriquecido mezclado de la célula, que es rico en células inmunitarias y contiene algunos fibroblastos estromales.

3. retiro de Cell muerto

Nota: Si un gran porcentaje de las células muertas (> 20%) está presente en la suspensión celular mixto enriquecido después de la centrifugación de gradiente de densidad, se recomienda la eliminación de células muertas con bolas magnéticas. Las células muertas deben eliminarse ya que puede interferir con el proceso de selección de grano magnético positivo.

  1. Contar las células usando un hemocitómetro en un microscopio óptico con objetivo 10 X. Desactivación de todas las células en la suspensión celular mixto enriquecido (500 x g, 10 min, 4 ° C). Totalmente aspirar y descartar el sobrenadante. Añada 100 μl de perlas de eliminación de células muertas por 1 x 107 células totales (vivas y muertas), según las instrucciones del fabricante. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
  2. Coloque un filtro de 30 μm en la columna magnética, aplique la suspensión de células y las células grano marcado a caer por la columna magnética.
  3. Enjuagar la columna con tampón de eliminación de células muertas como recomendada (3 mL). Recoger el paso que contiene las células vivas. El rango de recuperación de la célula después de la eliminación de células muertas se presenta en la figura 1B.
    Nota: Estas células se pueden utilizar para realizar citometría de flujo para estudios fenotípicas (sección 5) o continuar con el aislamiento de DC (sección 4).

4. C.C. purificación por selección positiva grano magnético

  1. Después del retiro de células muertas (paso 3.2), las células de la vuelta abajo, quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 80 μl de tampón de selección magnética por 1 x 107 células (PBS, 0,5% inactivado con calor AB suero humano (HS), 2 mM EDTA).
  2. Selección positiva de las poblaciones de DC, añadir granos magnéticos CD1a o CD14 según las instrucciones del fabricante (20 μl granos magnéticos por 1 x 107 células). Incubar 15 min a 4° C.
  3. Lavar las células con el búfer de selección magnética, desactivación y elimine completamente el tampón. Resuspender las células en un mínimo de 500 μl de tampón de selección magnética.
  4. Atar la columna al imán y añadir un filtro μm 30 en la parte superior de la columna para retener cualquier grupos de célula restante. Enjuague el filtro y la columna con tampón de selección magnética como se recomienda.
  5. Aplicar la suspensión de células a la columna. Enjuagar 3 veces con tampón de selección magnética.
  6. Transfiera la columna a un tubo de 15 mL, agregar 5 mL de búfer de selección magnética y aplicar el émbolo para liberar las celdas seleccionadas de la columna.
  7. Para aumentar la pureza, repita pasos 4.4-4.6 con las células recuperadas mediante una nueva columna. El rango de recuperación de la célula después de selección de grano magnético se presenta en la figura 1.

5. evaluación de la pureza de la célula: microscopia y citometría de flujo

  1. Anticuerpo para citometría de flujo:
    1. Resuspenda cuidadosamente hasta 1 x 106 células en 100 μl de PBS con un 20% inactivado con calor HS para bloquear los receptores de Fc e incubar por 10 min en hielo.
    2. Añadir la etiqueta fluorescente anticuerpos y reactivos para la identificación de células muertas (por ejemplo, ver sección 6.5). Set fluorescencia menos uno controla (FMO) a establecer las puertas y usar cuentas de compensación para preparar manchas solo controles de compensación. En la tabla 1se dan ejemplos de anticuerpos utilizados. Incubar por 20 min a 4 ° C, protegido de la luz.
    3. Lavar las células con 2 mL de búfer de selección magnética.
      Nota: La presencia de EDTA es importante para evitar la formación de aglutinación para análisis cytometric del flujo de la célula. Desactivación y descarte el sobrenadante.
    4. Fijar las células mediante la adición de 100 μl de solución de paraformaldehído al 2% por el tubo.
    5. Analizar las muestras en un citómetro de flujo10,11.
  2. Uso de Giemsa tinción para analizar la morfología y girar la columna (por ejemplo, cytospin):
    1. Resuspender las células en 200 μL de tampón de selección magnética.
    2. La carga en una columna de vuelta y vuelta durante 5 minutos. Deje que la diapositiva se seque completamente.
    3. Fijar la corredera por inmersión en metanol 100% durante 2 minutos enjuagar el portaobjetos con agua desionizada y déjela al aire seco.
    4. Realizar una tinción de Giemsa de Wrights estándar. Cubrir las células con eosina incubar por 10 min, enjuagar con agua desionizada y dejar secar. Cubrir las células con tinción de Geimsa Wrights, incubar durante 1 min, enjuagar con agua desionizada y secar al aire.
    5. Examine las preparaciones con un microscopio invertido (figura 2A, objetivo 40 X).

6. trasplante allogeneic estimulación ensayo para evaluar la función de células DC

  1. Descongelar las células mononucleares de sangre periférica congelados (PBMCs)
    1. Caliente de los medios de cultivo celular con 10% HS a 37 ° C.
    2. Descongele las PBMCs colocando el criotubo en un baño de agua de 37 ° C, hasta que quede una pequeña cantidad de medios de comunicación de la célula congelada en el criotubo. En un ambiente estéril, transferir el contenido del criotubo a 10 mL con célula de medios de cultivo con 10% HS en un tubo de 15mL.
    3. Centrifugue a ~ 500 x g durante 7 minutos Retire los medios de comunicación, dispersar el pellet, Resuspender el PBMCs en 10 mL de medio de cultivo celular con 10% HS y centrifugar las células.
    4. Repita el paso de lavado por tercera vez. Contar las células.
  2. Selección de la célula de T de Naïve:
    1. Use un kit de selección selección negativa anticuerpo magnético celular para aislar ingenuo t-células según protocolo del fabricante.
    2. Después de aislamiento, comprobar la pureza utilizando anticuerpos CD45RA y CCR7.
      Nota: La pureza típica es > 99% ingenuo t-células.
  3. Naïve T-célula proliferación manchas de tinte:
    1. Preparar 600 μl de solución de x 2 de tinte de proliferación celular, protegiendo el tinte de la exposición a la luz.
    2. Lavar el ingenuo t-células 2 x con PBS. Resuspender las células en 500 μl PBS.
    3. Mientras suavemente Vortex las células en el gabinete, bioseguridad agregar 500 μl de colorante de proliferación para el ingenuo t-células.
    4. Incube las células 10 min a 37° C.
    5. Detener la célula etiquetado añadiendo 5 mL de medio de cultivo celular con 10% HS a las células. Incubar en hielo durante 5 minutos protegido de la luz.
    6. Centrifugar las células a ~ 500 x g por 7 min, aspirar los medios de comunicación y resuspender las células en 4 ° C celda medios de cultivo con 10% HS. Repita dos veces más para un total de 3 lavados. Tomar una alícuota de células a contar antes de la última centrifugación.
      Nota: Típicamente, ingenuo final números de células T que van entre 5% y 15% de la cuenta inicial de células PBMC.
    7. Resuspender las células con los medios de cultivo celular con 10% HS a la concentración de células deseada.
  4. Co-cultivo de ingenuo DC alogénico células T:
    1. Placa de la aislada DCs y células de T ingenuas en una placa de 96 pocillos, fondo redondo, en una 1:15 relación de DCs para las células T. Asegúrese de que el número óptimo para DCs oscila entre 3.000 y 5.000 células/pocillo.
    2. Centrifugar la placa a ~ 500 x g durante 3 minutos asegurar que las células se encuentran en el centro del pozo. Contacto de célula a célula es importante para la señalización adecuada ocurrir.
    3. Incubar a 37 ° C durante 6 días. Supervisar el grupo de células, que aparecen en los pozos como ocurre proliferación, con el microscopio (Figura 3A).
  5. Flow cytometry tinción para evaluar la proliferación:
    1. Después de 6 días, las células pueden ser examinadas por citometría de flujo. Mancha el cocultivo para citometría de flujo.
    2. Preparar una solución de 2 x de tinte amarillo viabilidad (emisión máxima 572 nm) en PBS.
      Nota: Es importante el uso de PBS sin suero, como suero de proteínas interfieren con el tinte).
    3. Centrifugar la placa con las células en ~ 500 x g durante 5 minutos.
    4. Saque 100 μl del sobrenadante.
      Nota: en este punto recoger y almacenar el sobrenadante para el análisis independiente de factores solubles.
    5. Lavan las células dos veces con PBS: Añadir 150 μL/pocillo de PBS, centrifugar a ~ 500 x g durante 5 min, retirar 150 μL del sobrenadante con una pipeta. Asegúrese de que hay 50 μl de sobrenadante restante en cada pozo.
    6. Añadir 50 μl de 2 x viabilidad colorante a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min, protegido de la luz.
    7. Durante la incubación, preparar una mezcla maestra de marcadores del anticuerpo deseado. Por ejemplo: APC/Cy7 de CD3, CD4 PE, CD8 FITC, etc.
    8. Añadir la mezcla de anticuerpos a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min, protegido de la luz.
    9. Lavar las células 2 x con PBS + 2% HS: Añadir 150 μL/pocillo de PBS + 2% HS. Centrifugue a ~ 500 x g durante 5 minutos sacar 150 μL del sobrenadante con una pipeta.
    10. Fijar las células mediante la adición de 100 μL/pocillo de para-formaldehído al 2%. Si es necesario: transferencia de las células y los medios de comunicación a los tubos de polipropileno flujo cytometry. Tubos pueden mantenerse a 4 ° C y protegidos de la luz, hasta el análisis cytometric del flujo.
    11. Leer los tubos en un citómetro de flujo.

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Resultados

Siguientes digestión del tejido, la liberación de hojas epiteliales y las glándulas puede ser observada, como se muestra en la figura 1A; se trata de un control positivo que indica que la digestión enzimática fue exitosa. El número de células viables totales y DCs recuperados por gramo de tejido también se muestra en la figura 1B y figura 1, respectivamente. Las células inmunitarias representan entre...

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Discusión

Mucosa DCs son una población celular raro fuertemente influenciada por el ambiente del tejido, que cambia su fenotipo y la función una vez que entran en los tejidos3. Mientras que deriva la sangre DCs son un modelo muy útil, no representan completamente la diversidad de poblaciones de DC en los tejidos. Por lo tanto, para entender las características únicas de mucosa DCs, aislamiento de células primarias de los tejidos es necesario. Aislamiento de DCs de diferentes sitios anatómicos en la FRT ofre...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Becas de estudio apoyado por los NIH AI102838 y AI117739 (CRW). Agradecemos a Richard Rossoll para asistencia técnica. Análisis cytometric del flujo se llevó a cabo en DartLab, el recurso compartido Dartmouthsupported por (P30CA023108-37) y (P30GM103415-15).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)HycloneSH30015.03
Penicilina-estreptomicinaHycloneSV30010
HEPES (1M)Hyclone15630-080
Colagenasa IVSigmaC5138
Desoxirribonucleasa IWorthington BioquímicaLS002140
D-glucosaSigma Aldritch50-99-7
0.22 mmm Stericup 500 mL filtro MilliporeSCGPU05RE
100mm x 15mm placa de Petri de poliestirenoFisherbrand FB0875712
Petri de poliestireno de 150mm x 15mmFisherbrandFB0875714
Placa de poliestireno de 150mm x 25mmCorning430599Placa
Incubadora IsotempFisher ScientificFICO3500TABB5.0% CO2
>American Rotator VAmerican DADER4140
250 mmm malla de nylonSefar03-250/50
20 mmm malla de nylonSefar03-20/14
Beckman GS-6R CentrífugaBeckman358702
X-VIVO 15 con Gentamicina L-GLN, Rojo de fenol, 1 LLonza04-418Q
Suero AB humanoValley BiomedicalHP1022
Histopaque-1077Sigma Aldritch10771
Solución tampón de fosfato (PBS)National DiagnosticsCL-253pH 7.4
Kit de eliminación de células muertasMiltenyi Biotec130-090-101
Filtro de preseparación (30um)Miltenyi Biotec130-041-407
Columna LSMiltenyi Biotec130-042-410
Separador Quadro MACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS multi-soporteMiltenyi Biotec130-042-303
EDTAUSB15694
CD1a Microperlas humanasMiltenyi Biotec130-051-001
CD14 Microperlas, humanoMiltenyi Biotec130-050-201
eFluor 670 colorante de proliferación celulareBiosciences65-0840-85
placa inferior redonda de 96 pocillosFalcon9/8/2866
Zombie tinte de viabilidad amarilloBiolegend423104
CD3 APC/Cy7, antihumanoTonbo Biosciences25-0038-T100
CD4 PE, anti-humanoeBiosciences12-0048-42
CD8a FITC, anti-humanoTonbo Biosciences35-0086-T100
Gallios Citómetro de flujoBeckman Coulter Life SciencesB4361810 color, VBR
MACSquant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-3438 colores, VBR
placa de de cultivo celular tratada

Referencias

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