Este manuscrito describe el protocolo para la purificación de afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP). Este novedoso método facilita el aislamiento específico y la caracterización proteómica aguas abajo de cualquier dos proteínas obran recíprocamente, mientras que excluyendo un complejado proteínas individuales como complejos formados con competidores socios de enlace.
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Artículo de método
Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)
En este artículo
Resumen
Resumen
El ensamblaje de complejos de proteínas es un mecanismo central subyacente a la regulación de muchas vías de señalización de la célula. Un enfoque principal de la investigación biomédica es descifrar cómo estos complejos proteína dinámica actúan para integrar señales de varias fuentes para dirigir una respuesta biológica específica, y cómo esto se convierte en liberalizado en muchos contextos de la enfermedad. A pesar de la importancia de este mecanismo bioquímico clave, hay una falta de técnicas experimentales que pueden facilitar la deconvolución específico y sensible de estos complejos multi moleculares de señalización.
Esta carencia se dirige aquí a través de la combinación de un ensayo de complementación de proteínas con un nanobody específicos de conformación, que hemos llamado purificación de afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP). Esta nueva técnica facilita el aislamiento específico y la caracterización proteómica aguas abajo de cualquier par de interacción de proteínas, a la exclusión de un complejo proteínas individuales y complejos formados con competidores socios de enlace.
La técnica del BiCAP es adaptable a una amplia gama de ensayos experimentales aguas abajo, y el alto grado de especificidad de esta técnica permite más matizada las investigaciones sobre la mecánica del conjunto complejo de proteínas que es actualmente posible utilizar técnicas de purificación de afinidad estándar.
Introducción
Conjunto complejo de proteínas es un proceso clave en el mantenimiento de la especificidad espaciotemporal de muchos señalización vías1,2. Mientras que la naturaleza crítica de esta función reguladora es ampliamente reconocida, hay una falta de técnicas experimentales para estudiar estos complejos. La mayoría interactómica estudios se centran en las interacciones con las proteínas individuales, o el enriquecimiento secuencial de componentes complejos. Presentamos aquí una técnica para el aislamiento de un dímero de la proteína específica mientras que excluyendo las moléculas individuales de la componente de pr....
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Protocolo
1. plásmido clonación
Nota: Para generar vectores plásmidos con los tags V1 o V2 fusionados a la N-terminal o c-terminal del gen de interés, centro vectores de destino han sido depositadas con Addgene [etiqueta del N-terminal: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). Etiqueta C-terminal: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Los gene/s de interés tendrá que ser en recombinación específica vectores de entrada compatibles (es decir, pDONR223 o pENTR221), la clonación sin codones de parada, para proceder con la clonación. Muchos clones compatibles están disponibles en varias colecciones de plásmido, incluyendo la colección....
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Resultados
Tras el uso de la clonación de recombinación para generar de V1 y V2 con la etiqueta de genes de interés con el centro pDEST plásmidos, la transfección de dos plásmidos que contienen un par de interacción de proteínas resultará en la generación de una señal fluorescente de Venus después de aproximadamente de 8 a 24 horas. En la ausencia de una señal positiva es posible que la interacción de la proteína no puede ocurrir debido a la opción de línea celular, una eficacia de transfección baja.......
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Discusión
BiCAP es un método eficaz para aislar dímeros de la proteína específica mientras que excluyendo los componentes individuales y su competencia vinculante socios3. BiCAP se basa en la adaptación de un ensayo de complementación de proteínas de fluorescencia llamado Centro6. Los métodos existentes, incluyendo análisis de ligadura centro y proximidad, se han utilizado extensivamente para visualizar y cuantificar las interacciones de proteínas en células vivas7<.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
D.R.C es un cáncer Instituto de NSW y D.N.S era previamente un cáncer Instituto de Nueva Gales del sur. Los resultados de la investigación presentados en este manuscrito fueron financiados por el cáncer Instituto de Nueva Gales del Sur (13/FRL/1-02 y 09/FCD/2-39), NHMRC (proyecto Grant GNT1052963), Fundación de Ciencias de España (11/GRIC/B2157), oficina de ciencia de Nueva Gales del sur e investigación médica de la familia de los Beca y Fundación de la familia Mostyn. J.F.H. y R.S. recibieron una concesión australiana del postgrado.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Enzima LR Clonasa II Plus | Thermo Fisher Scientific | 12538120 | Enzima recombinasa necesaria para la clonación de puerta de enlace (Paso 1) en vectores de destino pDEST BiFC |
| Proteinasa K, recombinante, grado PCR | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | |
| Tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 mL | Corning | 352059 | |
| Ampicilina | Roche Diagnostics Australia | 10835242001 | Solución madre preparada a 100 μ g/mL en agua destilada. |
| Kit de minipreparación | Promega Corporation | A1330 | |
| Kit de Maxiprep | Life Technologies Australia | K2100-07 | |
| DMEM | Gibco | 11995-073 | |
| FBS | Life Technologies Australia | 10099-141 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Life Technologies Australia | 15070-063 | |
| tampón de transfección jetPRIME | Reactivo | 114-15 | |
| jetPRIME | Polyplus | 114-15 | |
| PhosSTOP (Inhibidor de la fosfatasa) | Sigma-Aldrich | 4906837001 | |
| cOmplete, Mini, sin EDTA Cóctel de inhibidores de la proteasa | Roche | 11873580001 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.1832 | |
| GFP-Trap_A | Chromotek | Gmbh gta-100 | GFP nanocuerpo acoplado a perlas de agarosa |
| N-terminal GFP monoclonal anticuerpo | Covance | MMS-118P | Detectará la etiqueta V1 dentro de los vectores BiFC |
| C-terminal GFP monocuerpo | Roche | 11814460001 Detectará la etiqueta V2 dentro de los vectores BiFC | |
| Tampón de muestra | Invitrogen | NP0008 | Suplementado con 1 mL β-mercaptoetanol. |
| Tripsina modificada de grado secuencial | Promega Corporation | V5117h | |
| Tubos de microcentrífuga LoBind Point | of Care Diagnostics | 0030 108 116 | |
| Yodoacetamida | Sigma-Aldrich | I1149-5G | Preparado a 5 mg/mL en agua ultrapura |
| Ácido trifluoroacético - Grado secuencial | Thermo Fisher | 10628494 | |
| Discos de extracción en fase sólida 3M Empore C18 (octadecilo) - 4,7 cm | Thermo Fisher | 14-386-2 | Para preparar las puntas de las etapas, corte discos de 1 mm con una perforadora del tamaño adecuado. Alternativamente, también se pueden comprar consejos de etapa preparados previamente, ver más abajo. |
| Puntas de etapa C18, 10 y micro; Cama L | Thermo Fisher | 87782 | |
| Ácido fórmico OPTIMA para LC/MS grado 50mL | Thermo Fisher | FSBA117-50 | |
| 1.9 μ m C18 Partículas de reprosil | Dr. Maisch GmbH | r119.aq. | Partículas en fase estacionaria |
| Acetonitrilo grado OPTIMA LC/MS&NBSP; | Thermo Fisher | FSBA955-4 | |
| Easy-nLC HPLC | Celdas Thermo Fisher | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergente no iónico (100%) |
| DH5α | Celdas Thermo Fisher | Competencias para choques térmicos |
Referencias
- Kolch, W., Pitt, A. Functional proteomics to dissect tyrosine kinase signalling pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (9), 618-629 (2010).
- Pawson, T., Kofler, M. Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and....
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Reimpresiones y permisos
