Artículo de método

Nuevo pasivo claro los métodos para la producción rápida de transparencia óptica en todo el tejido del SNC

DOI:

10.3791/57123

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8 de mayo de 2018

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1Department of Neurosurgery, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3The Spine and Spinal Cord Institute, Biomedical Center, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 4Columbia University College of Physicians and Surgeons

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos dos metodologías novedosas, psPACT y mPACT, para lograr la máxima transparencia óptica y posterior análisis microscópico de vascularización del tejido en el roedor intacto todo CNS.

Resumen

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Desde el desarrollo de la claridad, un bioelectroquímicos limpieza técnica permite mapeo tridimensional fenotipo dentro de tejidos transparentes, una multitud de metodologías de novela claro incluyendo cúbicos (proyección de imagen de cerebro claro y sin obstrucciones cócteles y análisis computacional), interruptor (todo el sistema de control de tiempo de interacción) y la cinética de los productos químicos, mapa (ampliada análisis del proteoma), Pacto (técnica de claridad pasivo), se han establecido para ampliar las herramientas existentes para el análisis microscópico de tejidos biológicos. El presente estudio pretende mejorar y optimizar el procedimiento de Pacto original para una gran variedad de tejidos de roedores intactos, incluyendo el todo sistema nervioso central (CNS), riñones, bazo y embriones de ratón todo. Denominado psPACT (Pacto de proceso separado) y mPACT (Pacto modificado), estas nuevas técnicas proporcionan medios altamente eficaces de asignación de circuitos de células y visualizar estructuras subcelulares en los tejidos normales y patológicos intactos. En el siguiente protocolo, proporciona un contorno detallado, paso a paso cómo lograr separación máxima del tejido con mínima invasión de su integridad estructural a través de psPACT y mPACT.

Introducción

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Un objetivo fundamental de la investigación científica y clínica consiste en lograr una comprensión completa de la estructura de órgano y función; sin embargo, la naturaleza extremadamente compleja de órganos mamíferos a menudo sirve como una barrera para alcanzar plenamente este objetivo1. CLARIDAD (intercambian lípidos claro cruzado por hibridación acrilamida rígido compatible con la proyección de imagen Tisssue-hidrogel)2,3,4, que implica la construcción de un híbrido basados en acrilamida hidrogel de tejidos intactos, logra separación óptica de una variedad de órganos, incluyendo el cerebro, el hígado y el bazo, mientras que preserva su integridad estructural5. CLARIDAD así ha permitido no sólo la visualización, sino también la oportunidad de disecar finamente complejas redes celulares y morfologías de tejido sin necesidad de seccionar.

Para lograr la separación de tejido, claridad emplea métodos electroforéticos para eliminar el contenido de lípidos de la muestra de mano. Mientras que la claridad se ha observado para producir híbridos de tejido-hidrogel físicamente estable, los estudios han demostrado que el uso de métodos de electroforesis tejido claro (ETC) produce resultados variables en cuanto a la calidad del tejido, incluyendo dorado, daño del epítopo, y pérdida de proteína de5,6. Para tratar estos temas, protocolos modificados como Pacto (pasivo claridad técnica), que sustituye el tratamiento etc. con una técnica pasiva, detergente iónico delipidation basado, han sido desarrollados7,8,9. A pesar de lograr una mayor consistencia en los resultados, sin embargo, pacto requiere más tiempo para obtener la máxima separación. Además, ninguna de estas técnicas todavía se aplicaron a la forma entera de la CNS, o en modelos más grandes roedores como las ratas y conejillos de Indias.

El presente estudio pretende abordar estas limitaciones proponiendo metodologías novela, psPACT (Pacto de proceso separado) y mPACT (Pacto modificado), para facilitar la rápida liquidación de CNS todo los órganos internos en modelos de ratón y rata10. Específicamente, psPACT procesos de tejidos en acrilamida 4% y 0.25% VA-044 en dos pasos separados durante la formación del hidrogel; mPACT esencialmente implica los mismos pasos, pero complementa la solución claro basado en SDS 0,5% α-thioglycerol como un reactivo clave. Ambas técnicas aprovechan la endógena sistémica y cerebroespinal circulatorio para reducir significativamente el tiempo necesario para producir la separación óptica. Como una prueba de principio, nos demuestran el uso de la microscopia confocal para analizar patrones de vasos sanguíneos en los tejidos despejado10.

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Protocolo

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Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité de ética de la investigación adecuada en el Colegio de medicina de la Universidad de Yonsei. Todos los animales experimentales son sacrificados con arreglo a las directrices del Comité de cuidado de los animales de laboratorio en la Universidad de medicina de la Universidad de Yonsei.

1. preparación de reactivos

PRECAUCIÓN: Paraformaldehido (PFA), acrilamida y sodio dodecil sulfato (SDS) son tóxicos irritantes y por lo tanto debe manejarse en una campana de humos con equipo de protección personal (PPE, bata, guantes, gafas protectoras).

  1. solución de acrilamida (A.A) 4% (A4P0): Añadir 20 mL de solución de acrilamida del 40% a 180 mL de 0.1 M tampón fosfato salino (PBS).
  2. Solución al 0.25% VA-044: agregar 0.5 g de 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] diclorhidrato (VA-044) polvo en 200 mL de 0.1 M tampón fosfato salino (PBS). Mientras que el polvo VA-044 puede almacenarse a temperatura ambiente, deben almacenarse a 4 ° C sobre la solubilización en PBS. Para mejores resultados, prepare sólo la cantidad de solución necesaria para el experimento.
  3. Solución cóctel Pacto: Añadir 10 g de acrilamida a 225 mL de solución al 4% paraformaldehido (PFA) y ajustar el volumen a 200 mL con 4% PFA. Antes de usar Añadir 100 mg de polvo de VA-044 a 40 mL de la mezcla en un tubo cónico de 50 mL.
  4. Pacto de compensación buffer solución: Añadir 40 g de sulfato de sodio dodecyl (SDS) a 350 mL de PBS de 0,1 M y ajuste el volumen a 500 mL con PBS de 0,1 M. Para mPACT claro solución, Añadir 0,5% α-thioglycerol al Pacto de compensación buffer de solución.
  5. Los ratones utilizados en este estudio fueron ratones machos de BALB de 2 semanas de edad; las ratas utilizadas en este estudio fueron 2 semanas de edad SD-ratas macho.

2. anestesia y la cirugía de la perfusión

PRECAUCIÓN: PFA acrilamida son tóxicos irritantes y por lo tanto debe manejarse en una campana de humos con PPE apropiado.

  1. Anestesiar al animal en un ambiente libre de patógenos con 30 mg/kg zoletil utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja de calibre 26. Vigilar al animal para 5-10 min.
  2. Una vez que el animal ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia, utilice el método de respuesta del pellizco del dedo del pie para determinar la profundidad de la anestesia. Confirman falta de respuesta.
    Nota: Los siguientes pasos involucrando cirugía de ratón y rata siguen un protocolo similar usado en un anterior estudio11.
  3. Haga una incisión de 5-6 cm por debajo de la caja torácica, a través del tegumento y de la pared abdominal.
  4. Utilice tijeras curvadas, romos para hacer una incisión en el diafragma, palpando la zona torácica para localizar el sitio de la incisión previamente.
  5. Extender la incisión a través de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural.
  6. Desplazar con cuidado los pulmones. Hacer un corte a través de la caja torácica a la altura de la clavícula. Usando las tijeras de iris, haga una pequeña incisión en la parte posterior del ventrículo izquierdo. Inserte una aguja calibre 18 u oliva-punta de la perfusión en la aorta ascendente, pasando por el ventrículo corte.
  7. Asegure la aguja y evitar fugas por el corazón con una pinza de sujeción. Alternativamente, utilizar una pinza modificada para apretar la aorta alrededor de la punta de la aguja.
  8. Hacer una gran incisión en la aurícula derecha, teniendo cuidado de asegurar un mínimo daño a la aorta descendente. La rata está ahora lista para perfusión.

3. toda perfusión y disección de la rata

PRECAUCIÓN: PFA acrilamida son tóxicos irritantes y por lo tanto debe manejarse en una campana de humos con PPE apropiado.

Nota: Los siguientes pasos de perfusión todo son un similar a un protocolo que se utiliza en un estudio previo por Woo et al. (2016) 10 , 11.

  1. Fije la aurícula derecha del corazón a una aguja de calibre 18, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.
  2. Rápida y uniformemente bomba utilizando una jeringa de 50 mL, de 50 mL de solución de PBS de 0,1 M fría que contiene heparina (10 unidades/mL).
  3. Conecte la aguja de calibre 18 para el tubo de la bomba peristáltica.
  4. Lave con 200 mL de solución de PBS de 0,1 M fría que contiene heparina (10 unidades/mL) a una velocidad de circulación de 10 mL/min.
  5. Fijar con 250 mL de solución fría de PFA 4% a una velocidad de circulación de 10 mL/min. La rata debe ser rígida en este momento.
  6. Recoger y almacenar la solución restante de PFA para su eliminación.
  7. Pacto, perfusión de los tejidos con una solución cóctel frío de Pacto de 4% PFA 4% acrilamida y 0.25% VA-044 polvo con una aguja de calibre 18 y retire la cabeza y columna vertebral. Exponer el cráneo haciendo una incisión de línea media del cuello a la nariz. Este paso adicional de la perfusión es necesaria para los métodos psPACT y mPACT; después de la fijación, inmediatamente aislar la cabeza y la columna vertebral y exponer el cráneo.
  8. Exponer la base del cráneo mediante la eliminación de cualquier cuello residual y muscular de la columna vertebral.
  9. Utilizar gubias y tijeras para pelar lejos del cráneo. Quitar el cerebro y la médula espinal.
  10. Guarde el tejido en 4% PFA a 4 ° C; los tejidos pueden conservarse hasta 1 semana.

4. hidrogel monómero infusión y polimerización del SNC de rata y ratón

PRECAUCIÓN: Acrilamida, SDS, α-thioglycerol y PFA son irritantes y por lo tanto deben manejarse en una campana de humos y con PEE apropiado.

  1. Pacto (compensación técnica pasiva)
    1. Aislar y cultura todo SNC (cerebro y médula espinal) de las ratas y ratones fijadas a un tubo de 50 mL que contiene una solución cóctel fría de Pacto de 4% PFA, 4% de acrilamida y 0.25% VA-044 polvo y almacenar a 4 ° C por 24 h. Asegúrese de que el tejido está completamente inmerso en la s olution.
    2. Embeber la muestra en gas nitrógeno para 10 minutos utilizando un gel sistema de hibridación conectado a un tanque de nitrógeno: sistema a 37 ° C. Transferencia de tejidos en un tubo de 50 mL que contenga dulce frío (4 ° C) Pacto solución cóctel y conectar con la tapa del tubo, girar en el vacío.
    3. Para polimerizar el hidrogel, coloque el tubo que contiene la muestra en un incubador de agitación (150 rpm, 37 ° C) durante 3 horas o hasta que la polimerización sea completa.
    4. Usando papel secante (véase Tabla de materiales), quitar el restante hidrogel polimerizado alrededor de los tejidos.
    5. Transferir el tejido a un tubo de 50 mL conteniendo solución clearing (8% de SDS en PBS de 0,1 M, pH 8.0).
    6. Coloque la muestra en un incubador de agitación poner a 37 ° C y 150 rpm hasta que el tejido se ha borrado. En promedio, tarda unos 20 días para el ratón del CNS para lograr claridad completa.
  2. psPACT (proceso separado técnica pasiva claro)
    1. Aislar todo SNC (cerebro y médula espinal) con hueso cortador y tijeras de PFA-fijo de ratones y ratas en una mesa de trabajo limpia.
    2. Transferencia de tejidos para un tubo de 50 mL que contiene 4% PFA y almacenar a 4 ° C por 24 h. aseguran que el tejido está totalmente inmerso en el fijador.
    3. Lavar el tejido fijo para 1 h en PBS de 0,1 M y luego se transfieren a la solución de A4P0 (4% acrilamida en PBS de 0,1 M). Tienda a 37 ° C durante 24 h.
    4. Lavar el tejido durante 5 minutos en PBS de 0,1 M.
    5. Sumergir el tejido en 0.25% VA-044 en PBS de 0,1 M. Mantenga a 37 ° C durante 6-24 h y luego se transfieren a la solución de PBS-044/VA de 0.25% fresca.
    6. Embeber la muestra en gas nitrógeno para 10 minutos utilizando un gel hibridación sistema (véase Tabla de materiales) conectado a un tanque de nitrógeno: transferencia de tejidos en un tubo de 50 mL que contenga dulce frío (4 ° C) solución de PBS-044/VA de 0.25% y conectar con la tapa del tubo. Encienda la aspiradora.
    7. Transferir el tejido a limpiar solución (8% de SDS en PBS de 0,1 M, pH 8.0).
    8. Incubar la muestra en un incubador de agitación poner a 37 ° C y 150 rpm hasta que el tejido se ha borrado. En promedio, tarda aproximadamente 17 días para mouse CNS para lograr claridad completa.
  3. mPACT (técnica de compensación pasiva modificado)
    1. Aislar todo SNC (cerebro y médula espinal) con hueso cortador y tijeras de PFA-fijo de ratones y ratas en una mesa de trabajo limpia.
    2. Siga los pasos 4.2.2 - 4.2.8 del protocolo psPACT.
    3. Transferir el tejido a limpiar solución. Observe que a diferencia de los protocolos de Pacto y psPACT, mPACT requiere una solución claro de 0.5% α-thioglycerol además de SDS de 8% en PBS de 0,1 M, pH 8.0. Α-thioglycerol es un agente sin dorador que ayuda a eliminar tejido más rápidamente y con eficacia. Asegúrese de que el tejido se sumerge totalmente en la solución.
    4. Coloque la muestra en un incubador de agitación poner a 37 ° C y 150 rpm hasta que el tejido se ha borrado. En promedio, tarda aproximadamente 2 semanas para mouse CNS para lograr claridad completa.

5. Índice de refracción que empareja y el Immunostaining del CNS despejado

Nota: nllantas (Nycodenz solución basada en Índice de refracción que empareja) consiste en 0,8 g/mL Nycodenz polvo disuelto en 30 mL de tampón base (0,01% de azida sódica y Tween-20 en PBS de 0,1 M, pH 8.0). Se recomienda que la solución esté en a 37 ° C agitando incubadora para permitir la adecuada solvatación del polvo.

  1. Incubar los tejidos en 0,1% Tritón X-100 en PBS de 0,1 M durante 2 h, luego bloquear con 2% albúmina sérica bovina (BSA) en PBS de 0,1 M durante 6 h.
  2. Lávese las secciones tres veces en SAFT (0,1% Tween-20 en PBS de 0,1 M) de 2 h. Mancha secciones con anticuerpos primarios (en este caso, un anticuerpo de anti-conejo PECAM-CD31, que tiñe los vasos sanguíneos) para 2 días.
  3. Mancha de secciones con anticuerpos secundarios (en este caso, un cabra anti-conejo IgG Cy3 fluorescente conjugado) en 2% de BSA durante 2 días.
  4. Lavado había etiquetado tejidos tres veces en SAFT durante 2 h y tienda en 15 mL llantas n2-10 días.
  5. Antes de la proyección de imagen, hacia tejidos etiquetados una pequeña cantidad de nllantas en platos de cultivo de tejidos de 35 o 60 milímetros. Fijar con silicona alrededor del borde inferior del plato.
  6. Añadir 1.5-2 mL de fresco nllantas.

6. tratamiento de la imagen

  1. Adquisición de imágenes de tejidos despejados con azulejo análisis mediante un aumento de 10 x-sistema de escaneo láser confocal microscopewith (véase Tabla de materiales). De tejido marcado con Cy3, utilizar longitudes de onda de 550-600 nm.

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Resultados

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Generación de un modelo transparente del CNS todo claro pasivo optimizado técnicas

Espacio óptico de los tejidos CNS todo ratón y rata se logró rápidamente utilizando diversas técnicas de compensación pasiva (figura 1). Un esquema de tejido claro con el tiempo se muestra en la figura 2A. A diferencia del método original del Pacto, psPACT (Pacto de proce...

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Discusión

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Mientras que los métodos de extracción pasiva, no electroforéticas emplean en pacto mejoró significativamente la consistencia alcanzada con tejido anterior claro métodos tales como la claridad2,3,4,7 , 8, la técnica aún tiene varios defectos, el más acuciante de que es la longitud de tiempo requerido para lograr el máximo tejido claridad12

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el proyecto cerebro Corea 21 PLUS para ciencias médicas, Universidad de Yonsei. Además, este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de investigación de Corea (NRF-2017R1D1A1B03030315).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)Affymetrix, Inc.75819Solución de limpieza
NycodenzAxia-Shield1002424solución nRIMS
Solución de acrilamida al 40% BioRad Laboratories, Inc.161-0140Polimerización (A4P0)
2,2&agudo;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano] DihidrocloruroWako Pure Chemical Industries, Ltd.017-19362Polimerización (VA-044)
1-TioglicerolSigma-AldrichM1753-100MLSolución de limpieza (mPACT)
Tween-20Georgiachem9005-64-5Solución nRIMS
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50MLInmunotinción
Albúmina sérica bovina (BSA)BovogenBSA100Heparina inmunoteñida
Merck Millipore375095Perfusión (PBS)
Azida de sodioSigma-AldrichS2002-25Gsolución nRIMS
Anticuerpo PECAM-CD31Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-28188Tinción inmunológica
de cabra anti-IgG Cy3 conjugado fluorescenteJackson ImmunoResearch Inc.111-165-003Tinción inmunológica
al 4% de paraformaldehídoTech & InnovaciónBPP-9004Perfusión, Polimerización
20X Solución salina tamponada con fosfato (pH 7.4)Tech & InnovaciónBPB-9121Perfusión, Tampón
10 mL stripetteCoatar4488Transferencia de solución
Tubo de 50 mLFalcon352070Tubo de limpieza
35 mm Placa de cultivo celularSPL20035
Imagen Placa confocalSPL211350
Imagen Jeringa de 1 mL Koreavaccine Co., Ltd26G 1/2Anestesiar 
Jeringa de 50 mLVacuna coreana Co., Ltd21G1 1/4
AcrilamidaSigma-AldrichA3553Polimerización (A4P0)
Papel Whatman 3MMSigma-AldrichZ270849Papel secante para la eliminación de gel
Microscopio confocalZeissLSM780Imaging
ZEN lite SoftwareZeissZEN 2012Imaging
Bomba peristálticaLongerpumpBT100-1FPerfusión
EasyGelLifecanvas TechnologiesEasyGelSistema de hibridación de gel tisular
de perfusión

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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