Microdilución en Vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos

Resumen

Un método microdilución en caldo fácil y adaptable para la detección de compuestos antifúngicos y extractos.

Resumen

Infecciones por hongos se han convertido en una condición médica importante en las últimas décadas, pero el número de fármacos antifúngicos disponibles es limitado. En este escenario, la búsqueda de nuevos fármacos antifúngicos es necesaria. El protocolo reportado aquí detalla un método para péptidos de pantalla por sus propiedades antifúngicas. Se basa en la prueba de sensibilidad de microdilución de caldo de las guías clínicas y el Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3 con modificaciones para adaptarse a la investigación de péptidos antimicrobianos como potenciales nuevos antifúngicos. Este protocolo describe un análisis funcional para evaluar la actividad de compuestos antimicóticos y puede modificarse fácilmente para adaptarse a cualquier clase particular de moléculas bajo investigación. Puesto que los ensayos se realizan en placas de 96 pozos utilizando pequeños volúmenes, una proyección a gran escala puede completarse en un corto período de tiempo, especialmente si lleva a cabo en un entorno de automatización. Este procedimiento muestra cómo un protocolo clínico estandarizado y ajustable puede ayudar a la búsqueda Banco de trabajo de nuevas moléculas para mejorar la terapia de enfermedades causadas por hongos.

Introducción

Infecciones por hongos se han convertido en una preocupación médica importante en las últimas décadas, habiendo aumentado considerablemente debido principalmente a un aumento en el número de individuos inmunocomprometidos como los sometidos a tratamiento contra el cáncer y las personas que viven con VIH/SIDA o trasplantados de órganos^1,2. Sin embargo, una gama muy limitada de los fármacos antimicóticos disponibles y el número creciente de informes sobre resistencia a los hongos les contribuyen a los grandes problemas con respecto a la terapéutica de micosis sistémicas³.

Una fuente potencial de nuevos compuestos antimicóticos son péptidos antimicrobianos (AMPs), pequeños péptidos catiónicos producidos por muchos organismos como parte de la respuesta inmune innata a infecciones⁴. Sin embargo, no está estandarizado el método de cribado para probar estos compuestos contra hongos patógenos. Se han utilizado diversos procedimientos para evaluar la actividad antifúngica de amperios, a veces para el mismo modelo microorganismo^5,6,7. Estas diferencias y la falta de detalle en algunos de los protocolos complican las comparaciones entre reproducibilidad compuestos y cestas.

Una manera de estandarizar las pruebas de nuevos fármacos candidatos debe seguir directrices utilizadas para definir susceptibilidad antifúngica en contextos clínicos, como la clínica e Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3. Sin embargo, estas pruebas de sensibilidad a los antifúngicos son demasiado restrictivas y no tienen en variaciones de consideración en el metabolismo entre especies, ya que sólo se establecieron algunos agentes selectos. Por ejemplo, no toman en cuenta las necesidades metabólicas de las levaduras no fermentadores.

Este protocolo permite la evaluación de la actividad de potenciales compuestos antihongos y se implementa aquí para la búsqueda de péptidos antifúngicos. Se basa en la prueba de sensibilidad de microdilución de caldo de las directrices del CLSI M27-A3 con modificaciones que optimizan la proyección de nuevos compuestos de^8,9. Estos cambios permiten el uso de pequeñas cantidades de compuesto, las variaciones de temperatura o inóculo inicial y distintos medios para un crecimiento óptimo previo a la prueba, mientras que la estandarización de los resultados con el uso de antifúngicos de referencia como controles. Este método, con la utilización de placas de varios pocillos cultura, permite la rápida y confiable de la pantalla un gran número de compuestos.

Debido a su flexibilidad inherente, este protocolo puede utilizarse con diferentes clases químicas de los compuestos y contra otros microorganismos, con pocas adaptaciones.

Protocolo

1. las soluciones y los medios de comunicación

1. Preparar 2 medio de 1640 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI), tamponada fosfato salino (PBS), caldo de dextrosa de Sabouraud y agar dextrosa de Sabouraud según tabla 1.

2. condiciones de crecimiento del inóculo hongos

1. Guarde todas las cepas de hongos como acción congelada en 35% de glicerol a-80 ° C, hasta que se necesite.
2. Realice los pasos siguientes antes de cada experimento.
   1. Para las cepas de Candida albicans :
      1. Descongelar un vial común y transfiera 200 μl a 10 mL de caldo de dextrosa de Sabouraud en tubo estéril 50 mL polipropileno con tapa y cultura durante la noche a 30 ° C con agitación (200 rpm). Recuerde incline el tubo y deje la tapa ligeramente abierta para mejor aireación de la cultura.
   2. Para las cepas de Cryptococcus neoformans :
      1. Raspar la superficie congelada de un frasco de stock. Las células en placas de Sabouraud dextrosa agar de la placa e incubar durante 48 h a 30 ° C. Tras el visible crecimiento de colonias aisladas, mantener las placas en el refrigerador (4 ° C) sellado con la película de parafina hasta 15 días.
      2. Recoger una colonia aislada de tamaño mediano de la placa con un palillo estéril o asa de inoculación estéril e inocular 10 mL de caldo de dextrosa de Sabouraud en un tubo cónico estéril 50 mL. Incuban durante aproximadamente 24 h a 30 ° C en agitación (200 rpm).
      3. No exceda la 24 h de incubación. Recuerde incline el tubo y deje la tapa ligeramente abierta para mejor aireación. Siempre es bueno estandarizar la fase de crecimiento de las células antes de cada prueba, ya que este es un factor importante que afecta la resistencia a los antimicrobianos.
         Nota: Ambos hongos fueron cultivadas a 30 ° C para la rápida propagación en nuestros experimentos, pero la temperatura puede cambiarse para reflejar los objetivos del estudio, por ejemplo tratamiento (37 ° C). Lo más importante, este tiempo de incubación inicial debe ser establecido previamente para cada hongo aislado y mantenido a lo largo de todas las pruebas para asegurar la reproducibilidad.
3. Después de crecimiento fúngico, recogen las células por centrifugación los tubos cónicos a 1.200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y añadir 10 mL de PBS.
4. Resuspender las células y centrifugar nuevamente a 1.200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Repita el lavado PBS y centrifugación dos veces más. Después del tercer lavado, resuspender las células en 5 mL (según el tamaño de la pelotilla) de Medio RPMI-1640 X 2.
6. Preparar 1 mL de una dilución 1: 100 o 1:1,000 en un tubo de microcentrífuga (dependiendo de la turbidez de la suspensión de células).
7. Alícuota de 10 μl de esta dilución, colocar en una cámara del hemocitómetro y contar el número total de células en los cuadrantes de cuatro esquinas en el microscopio. Calcular la concentración de la fórmula: (número de celular/4 en total) x dilución factor x 10⁴ (constante de disolución de la cámara).
   1. Considerar una viabilidad del 100% si las condiciones de crecimiento y cuentas de viabilidad se han correlacionado sistemáticamente para la cepa en estudio.
      Nota: La normalización y control de calidad de viabilidad cuenta pueden hacerse por la parte posterior-galjanoplastia de acuerdo a la Comisión Europea de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (EUCAST) antimicóticos concentración inhibitoria mínima (MIC) método para levaduras¹⁰ .
   2. Si no ha sido establecida la correlación de crecimiento/viabilidad de la cepa en estudio, medir la viabilidad de hongos por recuento de células vivas en un hemocitómetro con ayuda de tintes que color selectivamente las células muertas, como la Floxina B¹¹, trypan azul ¹², o Janus verde¹³. Utilice las células micóticas de este protocolo sólo si la viabilidad de la población en este momento es 90% o superior.
      Nota: Muerto/vivo tintes no funcionen bien con el hongo de la opción. Por favor prueba antes del uso. Por ejemplo, el colorante azul de trypan no funciona bien con C. neoformans.
8. Después de eso, preparar las suspensiones celulares en Medio RPMI-1640 X 2 (2 X ajustar inóculo en Medio RPMI-1640). Para placas de 96 pocillos considerar un volumen de 5 mL para cada placa.
   1. Para todas las cepas de C. albicans , preparar una suspensión stock de 4 x 10³ células/mL. Esta concentración es de 2 X de la concentración final de células en cada pozo (2 x 10³ células/mL).
   2. Para las cepas de C. neoformans , preparar un cultivo de células 2 x 10⁴ células/mL. Esta concentración es dos veces la concentración final de células en cada pozo (1 x 10⁴ células/mL).
   3. Para otros hongos, prueba con un antimicótico conocido que la concentración será ideal para el estudio particular en relación con el tiempo de incubación. Considerar con tiempo de duplicación y el metabolismo del hongo.

3. péptidos (agente desconocido)

1. Almacenar los péptidos liofilizados a-20 ° C y disolver en agua desionizada antes de cada experimento. El tiempo máximo de almacenamiento una vez disuelto en el agua dependerá de la naturaleza de cada péptido.
2. Preparar alícuotas de dos veces la máxima concentración final en el ensayo (2 X). Lo ideal es preparar un pequeño número de alícuotas con suficiente péptido para un uso evitar la congelación y descongelación.
   Nota: La opción de concentración debe basarse en la literatura y las propiedades del péptido. Se recomienda iniciar las diluciones seriadas con aproximadamente 100 μm del péptido y disminuir o aumentar este rango de concentración dependiendo de los resultados obtenidos.

4. referencia antifúngicos (controles positivos)

1. Para los diluidos en agua: preparar una solución de X 2 de la concentración más alta del análisis (ver sección 5: ensayo de antimicóticos para los pasos de dilución).
   1. Para las cepas de C. albicans , preparar una solución de 128 μg/mL de fluconazol o 128 μg/mL de la caspofungina. La concentración de placa para ambos será de 64 μg/mL.
   2. Para las cepas de C. neoformans , preparar una solución de 32 μg/mL de anfotericina B (solución soluble en agua). La concentración de placa será de 16 μg/mL.
      Nota: Normalmente la anfotericina B se diluye en dimetil sulfóxido (DMSO), ya que este fungicida es mal soluble en agua. Sin embargo, existen preparaciones de anfotericina B soluble en agua disponible en el mercado.
2. Para antifúngicos diluidos en un solvente orgánico: preparar 100 X solución de DMSO, luego diluir hasta 10 X en agua para su uso.
   Nota: Por lo tanto, en el pozo, la concentración final de DMSO no superará el 1%. Un pozo donde el hongo crece en medios que contienen 1% DMSO como control es necesario ya que algunos hongos lo toleran bien esta concentración del disolvente. Recuerde que el DMSO es fotosensible, así que cubra la placa con papel de aluminio o colocarlo en una cámara oscura para la duración de la incubación.

5. ensayo antimicótico

Nota: In vitro antifúngicos ensayos se realizan en base a la prueba de sensibilidad de microdilución caldo de guías clínicas y el Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3 con algunas modificaciones.

1. Preparar una dilución seriada de la dobles de cada péptido y antihongos en microplacas de poliestireno de 96 pocillos a un volumen final de 50 μl de control.
   1. Añadir con una pipeta 100 μl del péptido y antimicótico en la concentración de X 2 de la más alta deseada concentración final en las columnas 1-3, en fila A.
   2. Usando una pipeta multicanal, añada 50 μl de agua estéril en los pozos, en filas B a H.
   3. Quitar 50 μl de los pozos con la concentración más alta (columna A), transferencia a la siguiente también de la concentración próxima (fila B) y homogeneizar.
   4. Repita los pasos anteriores hasta el pozo con la concentración más baja y descartar 50 μl de este pozo (columna H). Dejar columnas 11 y 12 (filas A, B, C) con sólo agua para control de crecimiento negativo o control en blanco.
   5. Añadir 50 μl de la 2 X inóculo ajustado en Medio RPMI-1640 a cada pozo (columnas 1-3 más columna 11 (control de crecimiento negativo)); la concentración final para C. albicans será 2 x 10³ células/mL y la concentración final para las cepas de C. neoformans 10⁴ células/mL.
   6. Preparar controles en blanco (50 μl de agua + 50 μl de 2 X RPMI-1640 medio sin células) y control de crecimiento negativo (50 μl de agua + 50 μl ajustar inóculo 2 X RPMI-1640 medio sin antifúngico) y carga en la placa bien y como se describe arriba.
2. Repita el procedimiento para cada compuesto ser probados y el control elegido antihongos (columnas 4-10).
   Nota: Las diluciones seriadas pueden hacerse verticalmente como el experimento de abajo, u horizontal en la placa (es decir, si el número de diluciones de determinado compuesto/extracto que debe probarse es ocho o más).
   1. Si los compuestos de referencia medicamentos, o cualquiera de sus componentes son fotosensibles, realizar el análisis de luz reducida, cubrir las placas con papel de aluminio o colocar en una cámara oscura durante las incubaciones.
3. Considere las siguientes recomendaciones opcionales.
   1. Selle la placa con una plancha de cubierta transparente que permite el intercambio de gases, como esta ayuda a reduce la evaporación.
   2. Colocar la placa en una cámara húmeda; también ayudará a reducir la evaporación.
4. Incubar las placas a 37 ° C durante 24 h o 48 h para todas las cepas de C. albicans y durante 48 h con 200 rpm por C. neoformans. El menor volumen final (100 μL) asegura que no hay derrame ocurre.
   Nota: Ninguna diferencia significativa se observó entre MIC lecturas a las 24 h y 48 h para las cepas de C. albicans . Sin embargo, las lecturas a las 48 h son más fáciles de visualizar.
5. Observar todos los pozos, con la ayuda de un microscopio óptico invertido, antes de la incubación y después de verificar cambios en la morfología, así como para verificar si hay signos de contaminación.
   Nota: Lecturas pueden hacerse visualmente y fotografiadas en el final del experimento. Antes de cada lectura, homogeneizar un poco la placa. Las lecturas también se pueden realizar mediante la medición de su OD a 600 nm, si la célula produce o filamentación no se observan.
6. Realizar los experimentos al menos tres veces en diferentes fechas.

Resultados

La CMI se define como la menor concentración compuesta antimicrobiana que inhibe totalmente visible crecimiento del hongo al final de la incubación. Puesto que el objetivo de este protocolo es tener un método rápido de antifúngicos potencial pantalla, cualquier pozo con claros medios similares a los pocillos del blanco se considera un resultado positivo, considerando que cualquier pozo con turbiedad análogo a los pocillos de control de crecimiento negativo es considera negativo. Sin embar...

Discusión

Pruebas de microdilución pueden analizar la potencial actividad antifúngica de un objetivo compuesto usando pequeñas cantidades del compuesto y al mismo tiempo la prueba en una gama de concentraciones. Por consiguiente, este protocolo se recomienda como primer paso en la detección de posibles nuevos compuestos antifúngicos. El protocolo presentado aquí se basa en el protocolo M27-A3, inicialmente diseñado para ayudar en la selección de la terapia antifúngica en clínicas y puede ser adaptado a una variedad de nuevos compu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
medios y reactivos
RPMI 1640 medio con l-glutamina, sin bicarbonato de sodio	Thermo Fisher	31800-022
3-(N-morpholino) propano ácido sulfónico (MOPS) (o que a gente usa tem mmm só dio, completa o nome dele please)	Sigma-Aldrich		Úselo para amortiguar el medio 2X RPMI
Cloruro de sodio (NaCl)	Dinâ mica	1528-1	137 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)
Cloruro de potasio (KCl)	J.T.Baker	3040-01	2,7 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)
Fosfato sódico dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	V000129	10 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)
Dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	60230	2 mM para solución salina tamponada con fosfato (PBS)
BD Difco Sabouraud caldo de dextrosa	BD	238230
BD Difco Sabouraud Agar Dextrosa	BD	210950
Glycerol	Sigma-Aldrich	V000123	35% para (soluç ã o de estoque? Criopreservaç ã o?)
Agua			Para diluiç ã o das drogas na diluiç ã o seriada
Medicamentos antifúngicos
Anfotericina B	Sigma-Aldrich	A2942
Fluconazol	Sigma-Aldrich	F8929
Caspofungina	Sigma-Aldrich	PHR1160
Plásticos
50 mL tubo	cónicoSarstedt	62.547.254
Placa de Petri	J.Prolab	0304-5
Placa de 96 pocillos	Corning	3595
Depósito de solución estéril	KASVI	K30-208	Úselo para pipetear las soluciones utilizando el pippet multicanal
Equipment y otros materiales
Microscopio óptico	Nikon	E200MV
Centrífuga	Thermo Fisher	MegaFuge 16R
Incubadora	Ethik Technology	403-3D	Ajustado a 37° C
Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E25	Ajustado a 37° C, 200 RPM
Cámara de recuento de células, Neubauer	BOECO Alemania	BOE 13
Pipeta multicanal	HTL	5123