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Artículo de método

Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos

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DOI:

10.3791/57140

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1 de junio de 2018

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1Department of Genetics, Texas Biomedical Research Institute, 2Department of Internal Medicine-Molecular Medicine, Wake Forest University School of Medicine, 3Department of Chemistry, University of Wisconsin

En este artículo

Resumen

Se trata de un método para identificar nuevas proteínas DNA-que obran recíprocamente en lugares geométricos específicos, basándose en la captura de la secuencia específica de cromatina reticular para análisis proteómicos posteriormente. No se requiere ningún conocimiento previo sobre posibles proteínas, ni modificaciones de la célula. Inicialmente desarrollado para la levadura, la tecnología ahora se ha adaptado para células de mamífero.

Resumen

La captura de la hibridación de las proteínas asociadas a cromatina para tecnología de la proteómica (HyCCAPP) fue inicialmente desarrollada para descubrir nuevas interacciones ADN-proteína en levaduras. Permite el análisis de una región de objetivo de interés sin necesidad de conocimientos previos sobre las proteínas probablemente vinculado a la región de destino. Esto, en teoría, permite HyCCAPP a utilizarse para analizar cualquier región genómica de interés, y proporciona suficiente flexibilidad para trabajar en sistemas de células diferentes. Este método no es para el estudio de sitios de Unión conocido de factores de transcripción, una tarea más adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y viruta-como métodos. La fuerza de HyCCAPP reside en su capacidad de explorar regiones de ADN que es limitado o ningún conocimiento sobre las proteínas limitado a él. También puede ser un método conveniente para evitar sesgos (presente en la viruta-como métodos) introducidos por el enriquecimiento de la base de proteínas de la cromatina mediante anticuerpos. Potencialmente, HyCCAPP puede ser una poderosa herramienta para descubrir interacciones DNA proteína verdaderamente novedosas. Hasta la fecha, la tecnología ha sido aplicada principalmente a las células de levadura o a secuencias de la repetición copia alta en células de mamíferos. Para convertirse en la herramienta que tenemos la visión, enfoques HyCCAPP deban ser optimizada para capturar eficientemente loci de la solo-copia en células de mamíferos. Presentamos la adaptación de la levadura inicial HyCCAPP captura de protocolo a líneas celulares humanas y muestran que las regiones de la cromatina de la solo-copia pueden ser eficientemente aisladas con este protocolo modificado.

Introducción

Durante la última década, ha visto una mejora dramática en tecnologías de secuenciación, permitiendo el estudio de una amplia gama de los genomas en gran número de muestras y con una resolución asombrosa. El consorcio de la enciclopedia de elementos de ADN (ENCODE), un esfuerzo multi-institucional a gran escala dirigido por el nacional Instituto de investigación de genoma humano de los institutos nacionales de salud, ha proporcionado ideas sobre cómo los factores de transcripción y se unen a otras proteínas reguladoras e interactúan con el genoma. El esfuerzo inicial caracteriza interacciones DNA proteína, según lo determinado por la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para más de 100 conocidos de proteínas DNA-que atan1. Métodos alternativos como el DNase footprinting2 formaldehído asistida aislamiento de elementos reguladores (FAIRE)3 también han sido utilizados para localizar regiones específicas del genoma interactuando con proteínas, pero con la limitación obvia de que Estas aproximaciones experimentales no identifican las proteínas obran recíprocamente. A pesar de los grandes esfuerzos en los últimos años, no ha emergido ninguna tecnología que permite eficazmente la caracterización completa de las interacciones proteína-ADN en cromatina y la identificación y cuantificación de proteínas asociadas a cromatina.

Para abordar esta necesidad, hemos desarrollado un nuevo enfoque que hemos denominadas como Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteínas de Proteómica (HyCCAPP). Desarrollado inicialmente en levadura4,5,6, lo aísla reticulado cromatina las regiones de interés (con proteínas dependientes) mediante captura hibridación específica de secuencia. Después de aislamiento de los complejos de proteína ADN, métodos como la espectrometría de masas pueden utilizarse para caracterizar el conjunto de proteínas a la secuencia de interés. Así, HyCCAPP puede considerarse como un enfoque imparcial para descubrir la novela interacciones DNA proteína, en el sentido de que no se basa en anticuerpos y es totalmente agnóstico sobre las proteínas que se pueden encontrar. Hay otros enfoques capaces de descubrir la novela interacción con DNA proteínas7, pero dependen más de viruta-como métodos8,9,10, plásmido inserciones11,12, 13,14, o regiones con alta copia número15. En cambio, HyCCAPP puede ser aplicado a las regiones múltiples y solo copia y no requiere ninguna información previa acerca de las proteínas en la región. Además, mientras que algunos de los métodos mencionados arriba han características valiosas, en particular evitando la necesidad para reacciones de entrecruzamiento de ADN-proteína, la característica única de HyCCAPP es que puede aplicarse a regiones solo copia sin modificar las células y sin ninguna conocimiento previo acerca de supuestas proteínas o anticuerpos disponibles.

En este punto, predominante se ha aplicado al análisis de varias regiones genómicas en levadura4,5,6HyCCAPP y recientemente se utilizó para analizar las interacciones proteína-ADN en ADN satélite alfa, una región de repetición en el genoma humano16. Como parte de nuestra labor, hemos adaptado el enfoque de captura hibridación inicialmente desarrollado para que la cromatina de la levadura ser aplicable al análisis de las células humanas y aquí presentamos un protocolo modificado que permite la captura selectiva de destino de la solo-copia regiones en el genoma humano con eficiencias similares a nuestros estudios iniciales en la levadura. Este nuevo protocolo optimizado permite la adaptación y utilización de la tecnología para interrogar las interacciones proteína-DNA en el genoma humano, mediante espectrometría de masas u otros enfoques analíticos.

Es importante destacar que el método HyCCAPP está diseñado para el análisis de regiones de objetivo específico y no es conveniente para el análisis del genoma. La tecnología es especialmente útil cuando se trata de regiones para las cuales hay escasa información sobre las proteínas obran recíprocamente, o cuando se desea un análisis profundo más amplio de proteínas obran recíprocamente en un locus específico del genoma. HyCCAPP pretende descubrir proteínas DNA-que atan pero no caracterizar con precisión los sitios de unión de proteínas específicas en la DNA genomic. En su implementación actual, la metodología no proporciona información sobre las secuencias de DNA que atan o motivos para proteínas individuales. Por lo tanto, muy bien complementa las tecnologías existentes como la feria y puede permitir la identificación de nuevas proteínas en regiones genómicas identificado por un análisis inicial de la feria.

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Protocolo

1. captura de diseño de oligonucleótidos

  1. Diseño de un panel de oligonucleótidos que se utilizará durante la captura de la hibridación de la región de destino/s.
    1. Objetivo es diseñar oligonucleótidos de 4 – 8 por región de destino, pero como mínimo, diseño de oligonucleótidos por lo menos uno a cada extremo de la región de destino.
    2. Si la secuencia de destino es larga (> 500 pares de bases), diseño de los oligonucleótidos como propagación hacia fuera como sea posible para asegurar el enriquecimiento efectivo de la cromatina en toda la región de destino todo.
      Nota: Hemos observado una captura óptima con oligonucleótidos de 4 – 8. Aunque este proceso puede trabajar bien con oligonucleótidos más, no es infrecuente observar una disminución en los rendimientos de enriquecimiento cuando se utilizan muchos oligonucleótidos.
  2. Diseño de oligonucleótidos con temperatura de fusión similar y asegúrese de que no formar horquillas fuertes ni tienen fuertes interacciones (tomando en cuenta que las hibridaciones se llevará a cabo en 42 ᵒC).
    Nota: Si la elución de un punto de apoyo es elegida (4.12.3), una secuencia base 8 externo adicional debe agregarse a los oligonucleótidos y requerirá oligonucleótidos complementarios 'release' a la hora de la elución17. Varias herramientas de software comercial se pueden utilizar para seleccionar y analizar los oligonucleótidos. 25 mers han demostrado buenos resultados, pero dependiendo del tamaño del genoma y la secuencia, captura de oligonucleótidos pueden contener en algún lugar entre 20 – 80 bases. Por lo general, captura de oligonucleótidos tienen una temperatura de fusión cerca de 62 ᵒC, pero que puede cambiar dependiendo de su longitud. Temperatura de fusión constante o longitud del oligonucleótido a lo largo de la mezcla de captura puede ayudar a evitar sesgos no deseados en enriquecimiento.
  3. Diseño de los oligonucleótidos de captura con una molécula de biotina (preferentemente separado por un separador de la secuencia de captura) en el extremo 3'.

2. cultivo celular

  1. Crecen las células linfoblastoides humanas (por ejemplo GM12878 se muestra aquí) u otras líneas celulares en Medio RPMI 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina, penicilina-estreptomicina de 1% y 5% de suero bovino fetal (FBS), ᵒC 37 y 5% CO2.
    1. Inicial de semillas congeladas en alícuotas (2 – 5 x 105 células) en un matraz T-25 con 6 mL de Medio RPMI 1640 en 2.1.
    2. Controle la densidad celular y viabilidad.
      1. Tomar a un representante alícuotas de células y tinción con un colorante apropiado como trypan blue.
      2. Medir la densidad de células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
    3. Antes de que la célula llega a densidad de 1 x 106 células/mL, las células de la vuelta abajo a 100 x g por 5 min y transferir las células a un matraz T-75 con 25 mL de Medio RPMI 1640 en 2.1. Crecen las células hasta que la densidad celular acerca a 1 x 106 células/mL.
    4. Transferir las células a un matraz T-150 en 38 mL de Medio RPMI 1640 (2.1) y aumentan las células de dos días adicionales.
      Nota: Las células linfoblastoides crecen en suspensión. Lineamientos generales para el cultivo de células linfoblastoides recomiendan densidades de células a mantenerse entre 0.2 – 1 x 106 células/mL. Debido a la gran cantidad de material requerido en esta tecnología, el presente Protocolo es escrito deliberadamente para crecer las células a una densidad de células más allá de lo que comúnmente se utiliza. Protocolos de crecimiento de la célula pueden ser revisados y adaptados por el lector según los tipos de células para ser utilizado.
    5. Las células de la vuelta abajo a 100 x g por 5 min, resuspender las células en 10 mL de Medio RPMI 1640 (2.1) y vierta la suspensión en una botella de rodillo de2 850 cm que contenga 500 mL de medios de comunicación. Incubar las células en las mismas condiciones que antes pero en este momento empiezas a usar rotación constante (~0.5 rpm).
    6. Controlar el crecimiento celular y cambiar los medios de comunicación cuando sea necesario (normalmente cada 3-4 días). Que las células crecen hasta una densidad tan cerca como sea posible a 2 x 106 células/mL (1 x 109 células en total).
    7. Al llega a la cuenta de célula deseada, cosechar las células haciendo girar las células abajo a 100 x g durante 5 min y resuspender las células en 36 mL de Medio RPMI 1640 (2.1). Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 50 mL. Tomar pequeñas partes alícuotas para el conteo de células y la extracción de ADN.
  2. Reticulación mediante la adición de 1 mL de formaldehído al 37% para llegar a una concentración final de 1%.
    PRECAUCIÓN: El formaldehído es un carcinógeno y debe manejarse en una campana de humos.
    1. Incubar las células con rotación (~ 30-60 rpm) durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
    2. Calmar la reacción de reticulación por añadir 2 mL de una solución de glicina de 2,5 M, para una concentración final de 125 mM.
    3. Incubar las células con rotación (~ 30-60 rpm) por 5 min a TA. sedimenten las células por centrifugación a 100 x g durante 5 min y se lavan las células dos veces con PBS 1 x frío de hielo.
  3. Continuar siguiente paso o Resuspender el precipitado en 5 mL de tampón de lisis celular (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, inhibidores de la proteasa (PI)) y rápido-congele la suspensión gota a gota en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras a-80 ᵒC.
    Nota: Preparar > 25 mL de tampón de lisis celular sin Igepal y PI y agregar los reactivos recién cuando esté listo para usar. Evite el almacenamiento a largo plazo de tampón de lisis de la célula una vez que se han añadido Igepal y PI. Tienda celular tampón de lisis a 4 ᵒC hasta 3 meses. Igepal es un detergente no iónico, no desnaturalizantes. NP-40 puede utilizarse potencialmente como una alternativa a Igepal pero no hemos utilizado lo en este contexto como NP-40 no se recomienda cuando las muestras se analizan finalmente por espectrometría de masas para caracterizar las proteínas de unión del ADN.

3. lisis y corte

  1. Preparar > 15 mL de tampón de lisis de núcleos (10 mM EDTA, 50 mM de Tris pH 8.0, 1% SDS, PI).
    Nota: Agregar PI fresco, sólo a las cantidades a utilizar. Evite el almacenamiento a largo plazo de tampón de lisis de núcleos una vez que se ha añadido la PI. Tampón de lisis de núcleos puede almacenarse a temperatura ambiente hasta por 1 mes.
  2. Resuspender el precipitado en 20 mL de tampón de lisis celular (contiene Igepal y PI). Permita que los pellets descongelar el hielo y mezclar bien descongelado. Deje las muestras por un adicional 10 min en hielo. Centrifugar las células a 400 x g a 4 ᵒC durante 5 minutos.
  3. Deseche el sobrenadante y resuspender las células en 6 mL de tampón de lisis de núcleos con PI (volumen puede incrementarse si las células no forman una suspensión).
  4. En preparación para la sonicación, dividir la muestra uniformemente en el ~ 6-8 tubos de microcentrífuga (600 a 1.000 μl para cada tubo).
    1. Coloque las muestras en hielo o en un rack frío y someter a ultrasonidos la muestra utilizando un sonicador con una micropunta. Uso de amplitud de 65% con explosiones constante de 5 x 20 s, permitiendo que la suspensión se enfríe durante por lo menos 40 s entre pulsos.
      Nota: Si aumenta de volumen > 10 mL por muestra, un cristal de la célula de enfriamiento puede utilizarse en su lugar. Más y más ráfagas serían necesarios entonces. Sonicators son muy diferentes. Las condiciones que tenga que ser optimizado por el lector. Otras alternativas de la sonicación se pueden utilizar también.
  5. Centrifugar las células a 12.000 x g durante 10 min a 4 ᵒC, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche los pellets.
  6. Estiman recuperación total utilizando el método fluorométrico.
  7. Continuar al siguiente paso o complemento-congelar y almacenar la muestra a-80 ᵒC.
  8. Opcional: Tomar una alícuota, retroceso reticulaciones por incubación durante la noche en el 67 ᵒC en 0,3 M de NaCl. Limpiar ADN y ejecutarlo en el equipo Bioanalyzer para determinar longitudes de fragmento. La mayor parte de los fragmentos debe ser entre 500 y 1.000 PB.
    Nota: Está bien parada en este punto y almacenar las muestras a-80 ᵒC.

4. hibridación captura

  1. Preparar 500 mL de tampón de hibridación (Hyb) 2 (200 mM MES, 2 M de NaCl, 40 mM EDTA 0,02% Tween-20) y 500 mL de tampón de lavado (200 mM NaCl, 0.2% SDS, 50 mM Tris pH 8). Almacene el Hyb y tampones de lavado 4 ᵒC y temperatura ambiente, respectivamente, por hasta 3 meses. Utilizar la mitad de los 2 buffer de x Hyb para preparar un 1 x de tampón de hibridación. También guarde a 4 ᵒC hasta 3 meses.
    Nota: El volumen total de la captura de hibridación será dos veces el volumen de la muestra resultante en el paso anterior (como se ha descrito hasta ahora, el volumen de muestra sería alrededor de 6 mL y por lo tanto el volumen total de la hibridación sería 12 mL).
  2. Dejar de lado los granos igual al 5% del volumen de captura total de la hibridación (600 μL en este caso). Un imán apropiado y adecuado es necesario para trabajar con las cuentas en los siguientes pasos.
  3. Lavar los granos tres veces con 1 x Hyb Buffer usando dos veces el volumen de los granos (1200 μL). Resuspender los granos en 1.200 μL de 2 x Hyb Buffer. Colocar los tubos en el imán, hasta que la solución se aclare y retirar el tampón.
  4. Realizar pre-claro reacciones en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con un máximo de 700 μl de muestra por tubo. Añadir suficientes granos (5%) y 2 x Hyb Buffer para diluir el Hyb buffer 1 x (10 tubos con 600 μl de muestra y 120 μl de granos lavados resuspendió en 2 x Hyb Buffer 480 μl de 2 x Hyb Buffer). Incubar 10 min a 31 ᵒC con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm).
  5. Colocar los tubos en un imán, hasta que los granos son inmovilizados y transferir las muestras a tubos nuevos. Deseche los granos.
    Nota: Desde este punto hacia adelante, se recomiendan tubos de enlace de baja.
  6. Suspender las captura de oligonucleótidos a una solución de trabajo de 10 pmol/μl y añada 4 μL de esta solución en cada tubo.
    Nota: Diferentes regiones pueden actuar como control uno para el otro, pero se recomienda incluir un oligonucleótido de captura con su secuencia codificada para servir como un control negativo verdadero.
  7. Incubar los tubos durante 40 min a 42 ᵒC con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm).
  8. Durante la incubación, apartar los granos necesitados (0,3 μl/pmol de oligonucleótidos de captura). Lavar los granos tres veces como se describe en el paso 4.3, pero resuspender las células en 1 x Hyb Buffer.
  9. Agregue los granos lavados a la muestra e incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente con el extremo sobre rotación final (~ 30-60 rpm). Colocar los tubos en el imán y eliminar el sobrenadante una vez que los granos han sido inmovilizados.
  10. Lavar los granos
    1. Añadir 1,2 mL de tampón de lavado e incubar la muestra durante 5 minutos con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en tubos RT. lugar en el imán y espere un par de minutos hasta que la solución se despeja. Extraiga el tampón y repita este paso.
    2. Añadir 1,2 mL de tampón de lavado e incubar durante 1 h con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en RT. colocar los tubos en el imán y esperar un par de min de solución limpia. Extraiga el tampón y repita este paso reduciendo el tiempo de incubación a 30 min del segundo tiempo.
    3. Añadir 200 μL de tampón de lavado e incubar durante 15 minutos con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en 31 ᵒC. Colocar los tubos en el imán y esperar un par de min de solución limpia. Retirar el tampón.
    4. Añadir 200 μL de PBS e incubar por 5 min con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en RT. colocar los tubos en el imán y esperar un par de min de solución limpia. Extraiga el tampón y repita este paso.
  11. Elución simple
    1. Agregar 40 μl de agua grado molecular a los granos e incubar a 94 ᵒC durante 5 minutos.
    2. Colocar los tubos en el imán y esperar un par de minutos hasta que se aclare la solución.
    3. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Deseche los granos.
    4. Proceder al análisis proteómico o almacenar la muestra a-80 ᵒC.
      Nota: Este tipo de elución funciona bien para el posterior análisis de qPCR y algunas mediciones de proteómica, pero en otros casos dos enfoques alternativos que se describen a continuación eluatos de rendimiento "limpiador".
  12. Elución de DNasa.
    1. Agregar 40 μl de 1 x Buffer de DNasa y 2 U de la ADNsa a cada tubo.
    2. Incubar los tubos durante 15 min a 37 ᵒC.
    3. Colocar los tubos en un imán y esperar un par de minutos hasta que se aclare la solución.
    4. Retire las muestras eluídas de los granos y colocar las muestras en un tubo nuevo de enlace de baja.
    5. Incubar el tubo a 94 ᵒC por 7 min inactivar la enzima y proceder a los análisis proteómicos.
      Nota: Concentraciones más bajas de la ADNsa pueden utilizarse si se observa interferencia con los análisis proteómicos. No será posible calcular los captura de los enriquecimientos por qPCR si este método de elución se usa ya que el tratamiento de DNasa destruye totalmente el material de ADN en la muestra.
    6. Proceder al análisis proteómico o almacenar la muestra a-80 ᵒC.
  13. Elución de punto de apoyo17.
    Nota: Este método no se recomienda para oligonucleótidos más largo (> 40 bases). Este método requiere las captura de oligonucleótidos contener un 8 bases adicionales que no se superponen con la secuencia genómica y oligonucleótidos complementarios liberación con el fin de desplazar el objetivo de las captura de oligonucleótidos.
    1. Diluir 2 nanomoles de oligonucleótidos de liberación en 40 μl de tampón SSC.
    2. Incubar por 20 min a TA.
    3. Colocar los tubos en un imán y esperar un par de minutos hasta que se aclare la solución.
    4. Retire la solución de los abalorios.
    5. Proceder al análisis proteómico o almacenar la muestra a-80 ᵒC.

5. evaluación de captura de rendimiento por qPCR con las cartillas para el objetivo captura de región de interés

  1. Utilizar un software apropiado o herramienta en línea para el diseño de primers y sondas para la región de destino.
    Nota: En este experimento, la región del promotor del DUSP3 y DUSP5 fueron atacados. Los cebadores y sondas son las siguientes. DUSP3: cartilla 1 - GTG TTT AGG TTC GAT CCT CC, cartilla 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, punta de prueba etiquetada FAM - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: cartilla 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, cartilla 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, sonda marca FAM TGC ATT etiqueta AGC AGC CAG ATG AGG TT.
  2. Tomar una alícuota de eluido (no más de 10 μl) y diluir 1:10 con grado molecular H2O.
  3. Extraer el ADN de una de las alícuotas tomadas en el paso 2.1.7 y utilizar esa muestra de ADN para realizar una curva estándar haciendo cinco serie 1:10 diluciones en molecular grado H2O.
  4. Preparar una mezcla maestra de qPCR (gran variedad de alternativas comerciales), añadir cebadores y sondas y dispense la cantidad adecuada (15 μl si ejecuta una reacción de 20 μl) en cada pocillo.
  5. Añadir 5 μl de cualquiera: a) diluye la muestra, b) la curva estándar o grado c) molecular H2O (para servir como ningún control de la plantilla) a cada pocillo.
  6. La placa de sello y centrifugar a 100 x g durante 1 minuto.
  7. En un sistema qPCR con los siguientes parámetros: 5 min a 95 ᵒC seguido por 40 ciclos de 95 ᵒC de 20 s, ᵒC 59 20 s y 72 ᵒC de 25 s.
  8. Utilice la curva estándar para evaluar rendimientos y captura revuelto para evaluar la especificidad de la captura.

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Resultados

Debido a la necesidad de grandes cantidades de entrada de la cromatina para HyCCAPP tener éxito, las células crecen a niveles relativamente altos de confluencia. Tripán coloración azul se utiliza para confirmar que las tasas de muerte celular son moderadas (< 10%). En experimentos de única copia, contenido de cromatina antes de la hibridación captura tiene que ser en la gama femtomolar, que generalmente requiere al menos 109 células como material de partida. Antes experiment...

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Discusión

El método de HyCCAPP descrito aquí tiene muchas características únicas que lo convierten en un enfoque de gran alcance para descubrir el ADN-las interacciones que de lo contrario seguiría siendo difícil de alcanzar. La naturaleza del proceso da HyCCAPP la flexibilidad para trabajar en diferentes organismos y regiones del genoma. Es un método, sin embargo, que tiene varias limitaciones a tener en cuenta.

HyCCAPP es un método que evita las modificaciones celulares que potencialmente puede ser ap...

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Divulgaciones

Hay no hay conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH P50HG004952 y R01GM109099 a MO.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Herramienta PrimerQuestIDT
OligoAnalyzer 3.1IDTAnalyze captura oligonucleótidos
PairFoldUBCAnalyze interactions
RPMI 1640 mediosThermo Fisher11875093
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher15140122
L-Glutamina Thermo Fisher25030081
Suero fetal bovinoThermo Fisher26140079
Countess contador de células automatizadoThermo Fisher
850 cm2 botella con rodillo Greiner Bio-one680058
Sistema de rodillosWheaton22-288-525
37 % formaldehído Sigma-AldrichF8775
GlicinaSigma-Aldrich
Igepal CA-630Sigma-AldrichI3021
Cóctel de inhibidores de la proteasaSigma-AldrichP4380
HEPESThermo Fisher15630080
Branson sonificador digital SFX 150Emerson
Qubit 3.0 fluorímetroThermo Fisher
Qubit dsDNA BR kit de ensayoThermo FisherQ32850
Bioanalyzer 2100Agilent
Agilent DNA 1000kit Agilent5067-1504
MES sal sódicaSigma-AldrichM3885
NaCl 5MThermo FisherAM9760G
EDTASigma-Aldrich
Imán DynaMag-2Thermo Fisher12321D
Imán DynaMag-15Thermo Fisher12301D
Dynabeads M-280 atreptavidinaThermo Fisher60210
Tubos de ligamiento bajoEppendorf22431081
Horno de hibridaciónSciGene
Agitador de tubo y rotadorThermo Fisher415110Q
DNasa I (sin RNasa)New England BioLabsM0303
SSC buffer 20× concentradoSigma-AldrichS6639

Referencias

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