Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos

Resumen

Se trata de un método para identificar nuevas proteínas DNA-que obran recíprocamente en lugares geométricos específicos, basándose en la captura de la secuencia específica de cromatina reticular para análisis proteómicos posteriormente. No se requiere ningún conocimiento previo sobre posibles proteínas, ni modificaciones de la célula. Inicialmente desarrollado para la levadura, la tecnología ahora se ha adaptado para células de mamífero.

Resumen

La captura de la hibridación de las proteínas asociadas a cromatina para tecnología de la proteómica (HyCCAPP) fue inicialmente desarrollada para descubrir nuevas interacciones ADN-proteína en levaduras. Permite el análisis de una región de objetivo de interés sin necesidad de conocimientos previos sobre las proteínas probablemente vinculado a la región de destino. Esto, en teoría, permite HyCCAPP a utilizarse para analizar cualquier región genómica de interés, y proporciona suficiente flexibilidad para trabajar en sistemas de células diferentes. Este método no es para el estudio de sitios de Unión conocido de factores de transcripción, una tarea más adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y viruta-como métodos. La fuerza de HyCCAPP reside en su capacidad de explorar regiones de ADN que es limitado o ningún conocimiento sobre las proteínas limitado a él. También puede ser un método conveniente para evitar sesgos (presente en la viruta-como métodos) introducidos por el enriquecimiento de la base de proteínas de la cromatina mediante anticuerpos. Potencialmente, HyCCAPP puede ser una poderosa herramienta para descubrir interacciones DNA proteína verdaderamente novedosas. Hasta la fecha, la tecnología ha sido aplicada principalmente a las células de levadura o a secuencias de la repetición copia alta en células de mamíferos. Para convertirse en la herramienta que tenemos la visión, enfoques HyCCAPP deban ser optimizada para capturar eficientemente loci de la solo-copia en células de mamíferos. Presentamos la adaptación de la levadura inicial HyCCAPP captura de protocolo a líneas celulares humanas y muestran que las regiones de la cromatina de la solo-copia pueden ser eficientemente aisladas con este protocolo modificado.

Introducción

Durante la última década, ha visto una mejora dramática en tecnologías de secuenciación, permitiendo el estudio de una amplia gama de los genomas en gran número de muestras y con una resolución asombrosa. El consorcio de la enciclopedia de elementos de ADN (ENCODE), un esfuerzo multi-institucional a gran escala dirigido por el nacional Instituto de investigación de genoma humano de los institutos nacionales de salud, ha proporcionado ideas sobre cómo los factores de transcripción y se unen a otras proteínas reguladoras e interactúan con el genoma. El esfuerzo inicial caracteriza interacciones DNA proteína, según lo determinado por la inmunoprecipitación de cromatina (....

Protocolo

1. captura de diseño de oligonucleótidos

1. Diseño de un panel de oligonucleótidos que se utilizará durante la captura de la hibridación de la región de destino/s.
   1. Objetivo es diseñar oligonucleótidos de 4 – 8 por región de destino, pero como mínimo, diseño de oligonucleótidos por lo menos uno a cada extremo de la región de destino.
   2. Si la secuencia de destino es larga (> 500 pares de bases), diseño de los oligonucleótidos como propagación hacia fuera como sea posible para asegurar el enriquecimiento efectivo de la cromatina en toda la región de destino todo.
      Nota: Hemos observado una captura óptima con oligonucleótidos ....

Resultados

Debido a la necesidad de grandes cantidades de entrada de la cromatina para HyCCAPP tener éxito, las células crecen a niveles relativamente altos de confluencia. Tripán coloración azul se utiliza para confirmar que las tasas de muerte celular son moderadas (< 10%). En experimentos de única copia, contenido de cromatina antes de la hibridación captura tiene que ser en la gama femtomolar, que generalmente requiere al menos 10⁹ células como material de partida. Antes experiment.......

Discusión

El método de HyCCAPP descrito aquí tiene muchas características únicas que lo convierten en un enfoque de gran alcance para descubrir el ADN-las interacciones que de lo contrario seguiría siendo difícil de alcanzar. La naturaleza del proceso da HyCCAPP la flexibilidad para trabajar en diferentes organismos y regiones del genoma. Es un método, sin embargo, que tiene varias limitaciones a tener en cuenta.

HyCCAPP es un método que evita las modificaciones celulares que potencialmente puede ser ap.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Herramienta PrimerQuest	IDT
OligoAnalyzer 3.1	IDT		Analyze captura oligonucleótidos
PairFold	UBC		Analyze interactions
RPMI 1640 medios	Thermo Fisher	11875093
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamina	Thermo Fisher	25030081
Suero fetal bovino	Thermo Fisher	26140079
Countess contador de células automatizado	Thermo Fisher
850 cm2 botella con rodillo	Greiner Bio-one	680058
Sistema de rodillos	Wheaton	22-288-525
37 % formaldehído	Sigma-Aldrich	F8775
Glicina	Sigma-Aldrich
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021
Cóctel de inhibidores de la proteasa	Sigma-Aldrich	P4380
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Branson sonificador digital SFX 150	Emerson
Qubit 3.0 fluorímetro	Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR kit de ensayo	Thermo Fisher	Q32850
Bioanalyzer 2100	Agilent
Agilent DNA 1000	kit Agilent	5067-1504
MES sal sódica	Sigma-Aldrich	M3885
NaCl 5M	Thermo Fisher	AM9760G
EDTA	Sigma-Aldrich
Imán DynaMag-2	Thermo Fisher	12321D
Imán DynaMag-15	Thermo Fisher	12301D
Dynabeads M-280 atreptavidina	Thermo Fisher	60210
Tubos de ligamiento bajo	Eppendorf	22431081
Horno de hibridación	SciGene
Agitador de tubo y rotador	Thermo Fisher	415110Q
DNasa I (sin RNasa)	New England BioLabs	M0303
SSC buffer 20× concentrado	Sigma-Aldrich	S6639