Summary
דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.
Abstract
תזמון שכפול ה-DNA הוא מאפיין חשוב הסלולר, מפגין יחסים משמעותיים עם הכרומטין, שעתוק DNA מוטציה המחירים. מתרחשים שינויים בתזמון שכפול במהלך התפתחות של סרטן, אבל העיתוי שכפול תפקיד ממלא בהתפתחות, המחלה לא ידוע. דג זברה הוקמו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד שכפול תזמון. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש של דג זברה כדי לקבוע תזמון שכפול ה-DNA. לאחר מיון תאי העוברים, דג זברה למבוגרים, ניתן לבנות דפוסי תזמון שכפול DNA הגנום כולו ברזולוציה גבוהה על-ידי קביעת שינויים מספר עותק DNA בעזרת ניתוח של נתונים רצף ' הדור הבא '. דג זברה מודל המערכת מאפשרת הערכה של השינויים תזמון שכפול להתרחש ויוו במהלך ההתפתחות, והוא יכול לשמש גם כדי להעריך שינויים סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה או הקווים המוטנטים. שיטות אלה יאפשרו מחקרים חוקרת את מנגנוני ואת גורמים של שכפול עיתוי הקמה, אחזקה במהלך הפיתוח, העיתוי שכפול תפקיד ממלא מוטציות tumorigenesis, ואת ההשפעות של perturbing תזמון שכפול על פיתוח ומחלות.
Introduction
עבור תאים לחלק בהצלחה, הם חייבים קודם בדייקנות ובנאמנות לשכפל את הגנום כולו שלהם. שכפול גנום מופיעה תבנית לשחזור, המכונה תוכנית1תזמון שכפול ה-DNA. תזמון שכפול ה-DNA הוא מתואם עם כרומטין הארגון, סימני epigenetic ג'ין ביטוי2,3. שינויים בתזמון שכפול להתרחש במהלך הפיתוח, ויש תוכניות באופן משמעותי הקשורים תעתיק והשינויים סימני כרומטין, ארגון4,5. יתר על כן, שכפול התזמון הוא מתואם עם תדרים mutational, שינויים בתזמון שנצפו בסוגים שונים של סרטן-6,-7,-8. למרות ההבחנות הללו, מנגנונים של גורמים של שכפול עיתוי הקמה ורגולציה ידועות עדיין במידה רבה, התפקיד אותו ממלא בהתפתחות ואת המחלה הוא לא נקבע. בנוסף, עד לאחרונה שכפול הגנום כולו עיתוי השינויים המתרחשים במהלך פיתוח חוליות רק נבדקו במודלים התרבות תאים.
דג זברה, רזבורה rerio, מתאימים היטב לימודים שכפול תזמון ויוו במהלך הפיתוח, כמו זוג ההזדווגות יחיד ניתן תשואות של מאות העוברים המתפתחים במהירות עם קווי דמיון רבים יונקים פיתוח9, 10. יתר על כן, במהלך פיתוח דג זברה, ישנם שינויים מחזור התא, כרומטין הארגון ותוכניות תעתיק החולקות קשרים עם תזמון שכפול הדנ א11. דג זברה הם גם מודל גנטי מעולה, כפי שהם נתונות במיוחד למניפולציות של transgenesis, מוטגנזה מכוונת, מוטציות יישוב, מסכי גנטי זיהו גנים רבים הדרושים עבור פיתוח חוליות12. לכן, דג זברה יכול לשמש לזיהוי גנים המעורבים שכפול עיתוי הקמה, אחזקה, כדי לבחון את ההשפעות של deregulating שכפול תזמון על פיתוח חוליות. קווים הטרנסגניים יכול לשמש גם כדי להעריך את תזמון שכפול של סוגי תאים בודדים מבודדת timepoints התפתחותיים שונים או בתנאים המחלה. חשוב, ישנם מודלים שונים דג זברה של מחלות אנושיות יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של שכפול תזמון המחלה היווצרות והתקדמות9,13,14.
לאחרונה, הפרופילים תזמון שכפול הראשון היו להפיק של דג זברה, ביסוס זה כמערכת מודל ללמוד שכפול עיתוי ויוו15. כדי לעשות זאת, תאים נאספו מעוברים דג זברה-בשלבים רבים של פיתוח, בסוג תא מבודד דג זברה למבוגרים. התאים היו אז לפי FACS (תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון) בהתבסס על תוכן ה-DNA כדי לבודד אוכלוסיות שלב G1 ו- S. באמצעות המדגם G1 כפקד מספר עותק, העתק מספר וריאציות בשלב S אוכלוסיות היו נחושים ומשמש להסיק שכפול היחסי תזמון16. שינויים בתזמון שכפול ניתן לאחר מכן ישירות להשוות בין סוגי תאים ודוגמאות התפתחותיים שונים, זה שימש לקביעת שינויים בתזמון שכפול המתרחשים ויוו במהלך פיתוח חוליות. שיטה זו מציעה כמה יתרונות על פני שיטות אחרות גנומית, בעיקר כי זה לא דורש תיוג עם תחליפי תימידין או immunoprecipitation של ה-DNA4,6.
. זה מפורט הפרוטוקולים של הגנום כולו פרופיל DNA שכפול תזמון-ברזולוציה גבוהה בדג זברה. פרוטוקולים אלה שימשו לקביעת יחסים עם תכונות גנומית של epigenetic הגנום דג זברה, כמו גם יצירת פרופיל שינויים ביחסים אלו שמתרחשות במהלך הפיתוח. פרוטוקולים אלה בקלות גם מותאמים ללמוד שינויים בתזמון שכפול זנים מוטציה של דג זברה, במודלים של המחלה. בנוסף, שיטות אלה מספקים בסיס ניתן להרחיב על ללמוד שכפול תזמון סוגי תאים ספציפיים, על-ידי מיון הראשון החוצה את סוגי תאים בודדים מ דג זברה. דג זברה יכול לשמש כמערכת מעולה ויוו דגם ללמוד שכפול תזמון וכדי לחשוף בסופו של דבר בפונקציות ביולוגיות של תכונה epigenetic חשובה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל החיות שטופלו בהתאמה קפדנית עם פרוטוקולים אושרה על ידי אוקלהומה מחקר קרן מוסדיים חיה טיפול רפואי לשימוש הוועדה.
1. הגדרת דג זברה בוגרת לגידול
- השתמש קבוצה גדולה של דג זברה זכר ונקבה בוגרים של זן יחיד לגידול. ישנם הבדלים קטנים במבנה הגנטי של דג זברה של אפילו זן יחיד, השתמש עמית גדולים כדי להבטיח תוצאות יהיו נציג של השונות הגנטית באוכלוסייה, לא מוגבל תת קבוצה קטנה של האוכלוסייה.
- בלילה לפני העוברים ייאספו, למקם את עשרות מבוגרים רבייה רבייה טנקים, להשתמש במספרים שווים בקירוב של זכרים ונקבות. בהתאם הניסוי, להשתמש באסטרטגיות רבייה הבאות.
- רבייה אסטרטגיה 1: במקום כמה דג זברה זכר ונקבה במיכלים גידול בודדים, להפריד בין הזכרים לבין הנקבות עם מחיצה. אם נעשה שימוש בגישה זו, הגדרת טנקים רבייה שונים רבים, בריכה העוברים מכל אחת כדי להבטיח ההשתנות הביולוגי מייצג של האוכלוסייה.
- רבייה אסטרטגיה 2: לשלב עשרות דג זברה זכר ונקבה במיכל גדול הרבייה. להשתמש באסטרטגיה זו כל עוד ישנם מספר גדול מספיק של העוברים, סביר להניח באו ממגוון רחב של המייסדים והם ולכן נציג גנטית של האוכלוסייה.
2. matings - איסוף, מיון, דיור דג זברה עוברי לניסויים מתוזמן
- לבצע matings מתוזמן, מתחיל ברגע האור מחזורי להיות בבוקר. למחוק את כל העוברים שנוצרו בין לילה.
- לאפשר הדגים מתרבים במים רדודים (3-5 ס מ) לתקופה של 10 דקות, עם תחתית כפולה עבור עוברי לברוח דרך.
- לאחר 10 דקות, לאסוף העוברים על ידי מזיגת דרך מסננת ושטיפה לתוך צלחת 10-ס מ עם בקבוק שטיפה. בריכה כל העוברים שנאספו בנקודת זמן זהה, לסמן אותם עם הזמן אוסף, ומקום מיד בתוך אינקובטור ב- 28.5 ° C.
- מאות עוברי ניתן לצפות מן זוג ההזדווגות אחת ביום. לאפשר מבוגרים להתרבות תוך עשר דקות מחזורים עד מספר העוברים שהושג הוא פחות מ-20.
- כ 1-1.5 h לאחר איסוף, מיון עוברי להסיר את העוברים מופרית ומתה. כדי למיין את העוברים, להסיר מן החממה ולצפות תחת מיקרוסקופ ויבתר.
- ספור עוברי ומניחים על צפיפות של עוברי 100 לכל צלחת 10 ס מ.
- להוסיף E3 טריים בינונית (5 מ"מ NaCl, מ"מ 0.17 אשלגן כלורי, 0.33 מ מ CaCl2, 0.33 מ מ MgSO4) וחוזרים עוברי החממה 28.5 ° C.
3. Dechorionate, deyolk, ולתקן את העוברים דג זברה
הערה: סעיף זה של הפרוטוקול מיועד העוברים לפני 48 שעות שלאחר ההפריה (hpf). אין צורך להסיר את chorions של העוברים בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות (לאחר 48 hpf), כפי שהם נופלים לעתים קרובות באופן טבעי. אין צורך deyolk או להסיר את chorions של דגים בוגרים 5 הימים פוסט הפריה (dpf).
- כאשר עוברים מגיעים לגיל ההתפתחותי הרצוי, לוודא המתאים התפתחות מורפולוגית תחת מיקרוסקופ אור על פי "שלבים של עובריים פיתוח של דג זברה"17.
- העברת העוברים בשלבים עד 1500 ל צינור חרוטי 15-mL ולשטוף מספר פעמים עם E3.
- להוסיף 1 מ"ל של E3 ו µL 20 Pronase פתרון (30 מ"ג/מ"ל) עבור כל העוברים 100 ו מערבולת בעדינות. עד 1500 עוברי ניתן dechorionated צינור יחיד עם 15 מ"ל של E3.
- להניח צינור על צידה, לארגן העוברים בתוך שכבת אפילו כדי להבטיח השטח המרבי יחס נפח. בעדינות להתסיס צינור כל 2-3 דקות עד chorions כל נפל ממני העוברים. הזמן הכולל dechorionation משתנה בהתאם לפעילות Pronase.
- להסיר את תגובת שיקוע ולשטוף בעדינות את העוברים 3 פעמים עם 10 מ"ל של E3. במקום העוברים על קרח למשך שארית סעיף זה של הפרוטוקול.
- להסיר את E3 ולשטוף העוברים עם מאגר הטרי deyolking קר כקרח (0.5 x פתרון גינזבורג דגים רינגר, ללא סידן: 55 מ"מ NaCl, 1.8 מ"מ אשלגן כלורי, 1.25 מ"מ NaHCO3).
- להוסיף 1 מ"ל של המאגר הקר deyolking עבור עוברי עד 500.
- שימוש של P1000, בעדינות פיפטה עוברי למעלה ולמטה 5 - 10 פעמים כדי לשבש את שק החלמון.
- להעביר 1 מ"ל 1.5 mL microfuge ובשעות צנטריפוגה-4 ° C ו- 500 x g במשך 5 דקות.
- הסר גלולה supernatant, תשטוף עם 1 מ"ל של PBS קר כקרח x 1 (buffered פוספט תמיסת מלח, pH 7.0) כדי להסיר את תמיסת רינגר. צנטריפוגה ב 4 ° C ו- g x 500 במשך 5 דקות.
- בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאים 1 מ"ל של PBS 1 x. במקום הצינור על קרח.
- להוסיף 3 מ"ל של אתנול כקרח (EtOH) צינור חרוטי 15-mL. מערבולת של צינור EtOH בעדינות על הגדרה נמוכה.
- שימוש של P1000, לאט לאט (טיפה 1 לשניה) טפטוף דג זברה העובר תא ההשעיה לתוך EtOH בעת vortexing בעדינות.
- להוסיף סכום של 1 מ"ל של התליה תא העובר, הפתרון הסופי קיבוע של 75% EtOH.
- לאחר 1 מ"ל של תא ההשעיה נוספה, בעדינות מערבולת צינור כדי לערבב מקום ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה. מומלץ למקם את הצינורות בצד שלהם כדי להבטיח השטח המרבי יחס נפח ולהפחית את מספר העוברים ואת התאים ביחד. חנות תאים עובריים ב-20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שבועות.
4. צביעת DNA ו FACS מיון עוברי
הערה: סעיף זה של הפרוטוקול מיועד עוברי-1 dpf.
- להסיר תאים עובריים EtOH-קבוע-20 ° C, צנטריפוגה ב g 1500 x 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- במקום הצינור על קרח, בזהירות הסר תגובת שיקוע. שימוש של P1000, resuspend בעדינות תאים 1 מ"ל של טריות קר PBS-BSA (1 x PBS, אלבומין פרה 1%).
- צנטריפוגה תאים על 4 ° C ו- g x 1500 למשך 5 דקות ומניחים על קרח.
- הסר תגובת שיקוע, resuspend תאים propidium יודיד (PI) צביעת פתרון (µg 50/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7.0), שימוש 200 µL עבור כל העוברים 1000.
- מאפשרים לתאים דגירה בפתרון PI למשך 30 דקות בקרח, בעדינות ערבוב כל 5 דקות.
- מניחים מסננת תא ניילון 40 µm על צינור חרוטי 50-mL על קרח. בעדינות פיפטה תאים כדי לערבב, לסנן דרך רשת השינוי.
הערה: אם הצינורות מרובים של העוברים מן timepoint באותה נאספו בסעיף 3 של הפרוטוקול, לשלב אלה העוברים בשלב הזה כך הן כל ממוינות ביחד. - שימוש בדירה בתוך סוף פומפה מזרק, בעדינות לשבש כל הנותרים גושים של תאים על רשת השינוי.
- לשטוף התאים דרך המסנן עם 500 µL של PBS קר-BSA עבור כל העוברים 1000.
- מיקום רשת 40-מיקרומטר מעל צינור חרוטי 15-mL על קרח ולסנן התליה תא מהצינור חרוט 50-mL בפעם השנייה לתוך הצינור 15-mL.
- באמצעות תא המתאים מיון כלי נגינה, הגדר את עירור לייזר זיהוי 561-nm, פליטה ל- 610/20 כדי לזהות propidium יודיד.
- לערבב 15 מ"ל שפופרת של תאים מוכתם בקצרה על-ידי vortexing ומקום בייצור מכשירים ב 4 º C.
- להפעיל תאים על זרם איטי קצב, אידיאלי 1.0 מ"ל לדקה, על מנת לקבל פרופיל נקיים מחזור התא, הימנעות מערבוב G1 או G2/M תאים עם ה-S שלב האוכלוסייה.
- שער ראשון, עבור x SSC FSC-A-(פיזור קדימה אזור על-ידי פיזור מצידו) כדי להסיר את פסולת (איור 1 א').
הערה: תאים מן העוברים יכול להיות משתנה גדלים בהתאם לסוג התא והבמה. המסנן דחיסות נייטרלית (ND) ייתכן שיהיה צורך להחליף בין 1.0 ל- 1.5 בהתאם לגודל כדוריות. שער אזור גדול לאיסוף רוב התאים של הסרת לכלוך. - השער השני, עבור האס-אזור (האס-A) לפי PI-אזור (PI-A), כדי להסיר את הלכלוך ותא doublets (איור 1B).
- שלישית, שער עבור האס-A על ידי האס-W (רוחב) כדי להסיר את כל doublets תא הנותרים (איור 1C).
- להציג את אוכלוסיית מגודרת היסטוגרמה עם מספר הטלפון הנייד (ספירה) על האזור יודיד-y ואת propidium (PI-A) בציר ה-x. עבור עוברי hpf 24, זה אמור לתת פרופיל מחזור התא סטריאוטיפי כמו דמות 1D.
- כדי למיין את האוכלוסייה שלב S, להגדיר את השער מצד ימין של הפסגה G1 בצד שמאל של הפסגה G2, כולל רק כמות מזערית של אוכלוסיות G1 ו G2. עבור עוברי hpf 24, זה תכלול בדרך כלל כ- 10-15% מהאוכלוסייה מגודרת (ראה איור 1D).
- כדי למיין את האוכלוסייה G1, להגדיר את השער בצד שמאל של הפסגה G1, לא להעביר בראש הפסגה. להתאים את רוחב השער G1 כמו צר ככל האפשר (ראה איור 1D).
- חזרה לשער ה-G1 ואוכלוסיות שלב S כדי להבטיח נאות הראשונית חסימה (איור 1E).
- למיין את אוכלוסיות שלב G1 ו- S לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל עם 3 מ ל PBS-BSA. המטרה צריכה להיות כדי להשיג בין 500,000 ו 1 מיליון או יותר תאים ממוינים לפי שבר (שלב G1 ו- S).
- לאחר מיון הושלמה, צנטריפוגה צינורות-1500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הערה: בגדר תא קטן יהיה קשה לראות וזה חשוב למנוע שיבוש זה, כך להשתמש רצוי רוטור דלי מתנדנדים מעל הרוטור קבוע-זווית. - בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend גלולה עם 1 מ"ל של PBS 1 x. להעביר תאים 1.5 mL microfuge ובשעות צנטריפוגה ב 6,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- להסיר את כל הנוזל מהצינור ובזהירות להקפיא יבש גלולה ב-20 ° C. חנות בגדר ב-20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שבועות.
5. DNA בידוד, RNase וטיפול, טיהור DNA
- הסר תא צניפה-20 ° C ומקום על קרח.
- להוסיף 400 µL מאגר מרחביות (50 מ מ טריס-HCl (pH 8.0), 10 מ מ EDTA, 1 M NaCl, 0.5% מרחביות) גלולה, resuspend.
- להוסיף proteinase K ריכוז סופי של 0.2 מ"ג/מ"ל ומערבבים בקצרה על-ידי vortexing.
- דגירה בדגימות ב 56 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, מערבולת כל 15 דקות.
- לאחר 2 h, לבצע חילוץ פנול-כלורופורם על-ידי הוספת µL 400 של פנול-כלורופורם (אלכוהול פנול: כלורופורם: Isoamyl 25:24:1, רווי 10 מ מ טריס, pH 8.0, 1 מ"מ EDTA).
- מערבולת עבור מדגם s וצנטריפוגה 20 ב g 16,000 x עבור 5 דקות להפריד בין שלבים.
- בזהירות להסיר את פאזה מימית העליון (400 µL) העברת צינור 1.5 מ.
- לבצע משקעים EtOH על-ידי הוספת µL 40 של 3 מ' סודיום אצטט (pH 5.2), 2 µL של גליקוגן, 1 מ"ל של EtOH.
- מערבולת כדי לערבב ביסודיות במקום ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כדי לזרז את הדנ א. גם יכול להיות זירז מדגם ב-80 מעלות צלזיוס, או על קרח יבש לשעה.
- . דגימת צנטריפוגה-4 ° C ו- g x 16,000 למשך 30 דקות ל- DNA גלולה
- ביטול supernatant, תשטוף גלולה עם 1 מ ל 70% EtOH. צנטריפוגה ב 4 ° C ו- g x 16,000 במשך 5 דקות.
- למחוק את supernatant ואת air-dry צנפה בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות.
- להמיס גלולה ב 96 µL של מים בלוק, ולהוסיף 4 µL של RNase A (2 mg/mL).
- מערבבים היטב בעזרת vortexing, דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
- מבצע החילוץ פנול-כלורופורם על-ידי הוספת µL 100 של פנול-כלורופורם, ההליך הבא בשלבים 5.2.1 - 5.2.2.
- בצע למשקעים EtOH על-ידי הוספת 10 µL של 3 מ' סודיום אצטט, גליקוגן µL 1 µL 250 EtOH, בעקבות ההליך בשלבים 5.3.1 - 5.3.5.
- Resuspend צנפה ב- 60 µL טה מאגר (10 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0), EDTA 10 מ מ (pH8.0)) ולקבוע את ריכוז הדנ א באמצעות שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית כמותית. מאגר ה-DNA ב-20 ° C.
הערה: חשוב לכמת הדנ א באמצעות צבע מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית איגוד ה-DNA, או אמצעים אחרים יותר אמין מאשר שיטות מבוססות-ספקטרומטר UV.
6. הכנת ספריות DNA ורצף הדור הבא
הערה: G1 עותק מספר הפניה מדגם עבור כל מקור ביולוגי נדרש עבור כל הפעלה רצף (קרי WT, מוטציה, מהונדס, תא קו, וכו '). השווה בין כל שלב S דוגמאות מאותו מקור ביולוגי ב רצף זהה נוסעות אסמכתא G1 זהה. הפעל משכפל ביולוגית לפחות שני של כל דגימה כדי להבטיח עקביות בין הדגימות.
- למהול 1 µg של ה-DNA לאמצעי הסופי של 50 µL, העברת צינור מיוחד עבור sonication.
- להטות דנ א גנומי יעד של 250-300 bp ב ultrasonicator ממוקד, על פי מפרט היצרן פרוטוקול.
- ודא איכות וגודל הוטו DNA גנומי באמצעות מכונת אלקטרופורזה אוטומטי, על פי מפרט היצרן פרוטוקול. וודאו כי אין לשיא גדול של ~ 250-300 bp ה-DNA גנומי הוטו.
- להכין רצף ספריות באמצעות ערכת הכנה של ספריית ה-DNA עם מולטיפלקס oligos עבור רצף על פלטפורמה אילומינה, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
- ודא איכות של הספרייה במכינה באמצעות מכונה אוטומטית אלקטרופורזה, על-פי הפרוטוקול של היצרן. וודאו כי אין לשיא גדול של ~ 400-450 bp, ויש פסגות מינימלי עבור הדימרים פריימר (80-85 bp) ו הדימרים מתאם (~ 120 bp).
- לכמת ספריות באמצעות ערכת כימות של ספריית DNA עבור רצפי DNA הדור הבא, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
- µL 15 שתדללו של ספריית לשם ריכוז של 5 nM ו לשלב מרובב ספריות כפי הדרוש להשגת הרצוי באופן ייחודי מיפוי לקרוא ספירות לכל דגימה.
הערה: מספר ייחודי מיפוי קריאות לפי המדגם יקבע את הרזולוציה. שימוש גם 5 מיליון ממופה בהיקף קורא כדי להעריך את התזמון שכפול של הגנום דג זברה. מומלץ להתחיל עם 10-20 מיליון קריאות. - לבצע לזווג-end 100 bp כל הגנום רצפי DNA של דגימות בפלטפורמה רצף הדור הבא, על פי הוראות היצרן.
7. ניתוח של נתוני רצף
הערה: בהתאם להוראות סעיף זה מיועדים כקו מנחה לניתוח. להשתמש באמצעים נוספים ליישור רצף, סינון, עיבוד, וכו '. סעיף זה של הפרוטוקול יעסוק השיטה המועדפת של ניתוח בעבודה זו. אם נעשה שימוש באמצעים נוספים, להתאים את הפרמטרים והפונקציות כדי להתאים למטרות האלה. הפקודות שלהלן מוזנים Ubutnu או Mac מסוף, עם החבילות המתאימות מותקן.
- להשיג את הגירסאות האחרונות של הגנום דג זברה (danRer10, החל כאשר פרוטוקול זה נכתב) מהדפדפן הגנום UCSC באמצעות הפקודות הבאות:
wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz- דחיסה של קובץ ה-fa.gz עם הפקודה הבאה:
gunzip danRer10.fa.gz - ליישר נתונים רצף הגנום באמצעות BWA-מ באמצעות הפקודות הבאות:
bwa mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
- דחיסה של קובץ ה-fa.gz עם הפקודה הבאה:
- להמיר קובץ .sam קובץ .bam באמצעות samtools עם הפקודה הבאה:
samtools להציג -bS input.sam > output.bam- למיין את הקבצים מסודרים רצף באמצעות samtools עם הפקודה הבאה:
samtools למיין output.bam > output_sorted.bam - אינדקס את הקובץ .bam באמצעות samtools עם הפקודה הבאה:
samtools מדד output.bam
- למיין את הקבצים מסודרים רצף באמצעות samtools עם הפקודה הבאה:
- מארק PCR כפילות עם פיקארד באמצעות הפקודות הבאות:
java-Xmx2g-ג'אר picard.jar MarkDuplicates \
INPUT=input.bam
OUTPUT=output.bam
REMOVE_DUPLICATES = false
METRICS_FILE=output_metrics.txt - ליצור קבצי טקסט (. txt) הקריאות עבור כל כרומוזום באמצעות הפקודה הבאה:
כי אני ב {1.25}; האם כרום = "chr" $i; אקו $CHROM; samtools להציג input.bam $CHROM | לחתוך -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {ט}. txt; עשיתי
הערה: העמודות בקובץ. txt שנוצר הן דגל, מיקום, mapQ, זוג chr, זוג מיקום וגודל פרגמנט, בהתאמה. - לקרוא קבצי. txt לתוך Matlab (או כל תוכנה דומה אחרת) באמצעות הפונקציה textscan.
- לסנן קריאות באיכות נמוכה במיפוי על-ידי הגדרת סף mapQ של 30.
- הסר את קריאות עם דגלים עבור יישור לא הראשי, PCR כפילויות או מיפוי זוג כרומוזום שונים.
- לסנן כל קריאה עם זוג שלהם מעבר לסף מסוים מרחק של 2000 bp.
- הערכת נתונים סטטיסטיים של קריאות שנוצר כדי לקבוע מספר סטטיסטיקות קריאה, כיסוי, הוספה גודל ואיכות (איור 2).
- לקבוע כיסוי קריאה ב- windows 100 bp קבוע עבור כל דגימה על ידי ספירת מספר הקריאות במרווחים לחץ דם 100 על פני האורך של כל כרומוזום.
- חישוב שהחציון ספירת עבור windows כל קריאה.
- לסנן אזורי כיסוי גבוהה על-ידי הסרת windows גדול מסטיות תקן 5 החציון.
- הגדרת אזורים עבור ניתוח הדגימות הפניה G1 על ידי מציאת מקטעים לאורך כל כרומוזום עם 200 קריאות באמצעות חלונות הזזה.
- לקבוע עומק קריאה בכל מדגם שלב S על ידי ספירת מספר הקריאות שלב S בחלונות ספירת 200-קריאה מוגדרת עבור ההפניה G1 הנלווה.
- להחליק את הנתונים הגולמיים באמצעות הפונקציה csaps בתוכנה, עם גורם אינטרפולציה (p) של 10-16.
- לנרמל את הנתונים מוחלקים ניקוד-z עם ממוצע 0 וסטיית התקן של 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות נתוני תזמון שכפול שפורסמו, שכפול נציג תזמון פרופילים אמצעי בקרה הינם מסופקים15. השלבים הראשונים של עיבוד לערב יישור הנתונים רצף הגנום, חישוב אורך הקריאה סטטיסטיקות כיסוי של הגנום וסינון באיכות נמוכה, אינטראקצית, ו- PCR קריאות כפולים. קריאה סטטיסטיקה עבור מדגם רצף דג זברה טיפוסי מוצגים באיור2. לאחר סינון, קריאה ספירות נחושים בטיפוח הנתונים וחלונות בגודל משתנה החליק, מנורמל. שכפול החליק/מנורמל טיפוסי פרופילים התזמון של כרומוזום דג זברה נציג עבור משכפל ביולוגי מוצגים באיור 3 א. הפרופילים עבור הביולוגית וניסויים משכפל צריך להיות דומה מאוד מבחינה ויזואלית (ראה איור 3A) ולהציג גם קורלציה גבוהה לאורכו של הכרומוזום (איור 3B). הם צריכים גם להציג קורלציה גבוהה בין עיתוי ערכים הגנום כולו (איור 3C). Autocorrelation, שיטה להערכת דפוס המשכיות, אמור לשמש כדי להעריך את מידת מבנה בערכת הנתונים (דמות תלת-ממד). Autocorrelation עבור תוכניות מובנות תזמון בוגר צריך להיות גבוהה במרחקים קצרים, ירידה הדרגתית כפי מגדילה המרחק. דוגמאות המציגות הפארמצבטית גבוהה בין הביולוגי ניסיוני משכפל, אות חזק autocorrelation צריך להיחשב דגימות באיכות גבוהה יכול להיות משולב כדי להשיג דגימה כיסוי גבוה יותר.
איור 1: מיון דג זברה העוברים ניתוח התזמון שכפול. (א) מגודרת אוכלוסייה של כל התאים מיינת לשם פיזור קדימה אזור (FSC-A) על ידי פיזור מצידו (האס-A). הצבעים מייצגים את הצפיפות של פחי בעלילה נקודה עם צפיפות גבוהה-כדי-נמוכה מיוצגים באמצעות צבעים הנעים בין אדום-כדי-ירוק-עד-כחול. (B) מגודרת אוכלוסיית התאים x SSC FSC מגודרת מיון עבור האס-A לפי אזור יודיד propidium (PI-A). (ג) מגודרת אוכלוסייה של האס PI מגודרת תאים ממוינים עבור האס-A בצד רוחב פיזור (האס-W). היסטוגרמה (D) של כל האוכלוסיות מגודרת הצגת פרופיל סטריאוטיפי מחזור התא. מיון שערים עבור תאים בשלב G1 ו- S מוצגים על ידי האפור מוצל התאגרף עם קווים שחורים. אוכלוסיות שלב Backgated G1 (E) ו- S להראות כי gating הראשונית כבשו את רוב התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: רצף לקרוא נתונים סטטיסטיים עבור מדגם דג זברה טיפוסי. ראפ (A) מיפוי איכות מן הסטטיסטיקה של ערכים mapQ. (B) היסטוגרמה של ההתפלגות בגדלים הוספה על כל רצפי קורא. (ג) לקריאה סטטיסטיקה עבור סכום קוראת ממופה, קורא המכילים דגל באיכות נמוכה, קורא עם זוגות מיפוי השונות כרומוזום (זוג diff chr), קורא עם זוג מעבר מרחק סף (צמד מרוחק), ו- PCR כפילויות. (D) מספרים נציג של סכום ממופה, שאינן ממופות, אינטראקצית קריאות, כיסוי, וקרא רזולוציה לריצה רצף אופייני של מדגם דג זברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: דג זברה נציג שכפול תזמון תוצאות, אמצעי בקרה. (א) שכפול התזמון לאורכו של נציג כרומוזום עבור שני ביולוגי משכפל hpf 28 העובר (Siefert, 2017). (B) המתאם בין ערכים תזמון שכפול בחלונות 2 מגה-בתים לאורכו של כרומוזום נציג עבור הביולוגי משכפל של 28 העוברים hpf שמוצג באיור 3 א. (ג) הגנום כולו קורלציה בין ניסיוני (rep3) ושכפול של העוברים hpf 28 של שכפול ערכים תזמון עבור ביולוגית (rep1 ו- rep2). המפה צבע מייצג מקדם המתאם של פירסון. Autocorrelation (ד) עבור תוכנית מובנית תזמון בוגרת מציג autocorrelation גבוהות במרחקים קרובים זה פוחת בהדרגה על פני מרחקים ארוכים יותר ויותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דג זברה לספק מערכת מודל חדש וייחודי ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA. מתי matings מתוזמן מבוצעות כפי המפורט בעלון זה נסיוני, אלפי עוברי ניתן לאסוף ביום אחד לניסויים. אלה העוברים לפתח באופן סינכרוני באמצעות בדיוק בעיתוי ומתאפיינות במובהק שלבי הפיתוח. דג זברה יכול להיות בקלות ובדייקנות מבוים על ידי מורפולוגיה באמצעות של stereomicroscope, העוברים דג זברה מבחוץ ולפיתוח ברורים שטיחות. פרוטוקול זה מפרט את השימוש דג זברה העוברים ללמוד שכפול תזמון במהלך פיתוח חוליות.
אזורים של פרוטוקול שעלול להציג בעיות כוללים הבטחת סינכרונית התפתחות העוברים דג זברה, אובדן תאים במהלך ההכנה, FACS מיון, הכנה הספרייה. העיתוי של פיתוח דג זברה היא הטמפרטורה תלוי, לכן השימוש דג זברה המותאמים מחזורים/כהה, מאילן 28.5 ° C לניסויים. כדי להבטיח פיתוח סינכרונית, לבצע בדיוק בעיתוי matings, ולאסוף את העוברים בחלונות קטנים מאוד (10 דקות או פחות). זה חיוני כדי לשמור על עוברי ב 28.5 ° C ולהבטיח שהם מבלים זמן מינימלי בטמפרטורת החדר. העיתוי של דג זברה פיתוח הוא גם מאוד תלוי הצפיפות של העוברים באזור נתון. זה קריטי לא הבית העוברים על צפיפות גבוה יותר העוברים 100 לכל צלחת 10 ס מ, או שהם לא יתפתח כראוי. הזמן האופטימלי כדי להסיר את העוברים מופרית ומתה הוא כשהם התקדמו לשלב התא 4-16, ניתן לזהות בקלות כמו מופרית (שימוש "שלבים של עובריים פיתוח של דג זברה"17 כמדריך). עוברי מתים מופיעים בדרך כלל כדורים שחורים ומופיעות עוברי מופרית כתא-1. לעבוד מהר ככל האפשר כדי להפחית את הזמן בטמפרטורת החדר.
מתי dechorionating עוברי, חשוב להבטיח ש-chorions כל יוסרו מן העוברים. שמור עוברי בפתרון pronase עד chorions רוב זה ירד. למחוק את כל העוברים הנותרים עם chorions שלם או להסיר את chorions שלהם עם מלקחיים. פיפטה עוברי באמצעות תנועה איטית וחלקה. לא פיפטה במהירות כמו זה נושא תאי מתח מיותר ולהוביל לאובדן של תאים. חשוב גם שלא לעשות שימוש P200 כמו זה יכול לגרום מוגברת מאמץ גזירה שתוצאתו שבירה של תאים. לעומת זאת, פיפטה העברה פלסטיק לא ייתכן קטן מספיק נשא או לספק מספיק מאמץ גזירה שלמאחה לשבש את שק חלמון, disaggregate את התאים. פיפטות חלופי יכול לשמש בתנאי נשא ו הטיה יהיה מקביל האופטימלית P1000.
כאשר FACS מיון 28 hpf, אם תא סטריאוטיפי מחזור פרופיל לא מתקבל, להתאים את המתח על לייזר PI כך הפסגה G1 ממורכזת סביב 50K. הרווחים עבור FSC ו האס עשוי גם צריכים להיות מותאמים כך האוכלוסיות gating ותא מופיעים דומים איור 1. אם עדיין יש קושי, צריך להיות החלפת המסנן ND, ויש המתחים FSC ואת האס מותאם כדי להבטיח את הרוב של תאים בתוך השער. זה צריך להיות ברור יש פאי מכתים, כמו יהיה מגוון המעריכה לזוג PI-א ההיסטוגרמה צריך להראות שתי הפסגות ברורה, לשיא גדול-2N ה-DNA של התאים G1 ו לשיא קטנים בעוצמה כפולה עבור ה-DNA של 4N תוכן של תאים G2/M. אם זה עדיין לא מתקבל גם ייתכנו מספר נמוך של תאים שלמים, בעיות עם ההכתמה PI או בעיות עם קיבוע, הפרוטוקול יהיה צורך ניתן למטב בהתאם.
תאים מעוברים מוקדם (לפני 10 hpf) לא ייתן פרופילי מחזור התא טיפוסי, כמו אחוז גבוה של תאים אלה נמצאים בשלב S. דגימות אלה יכול להיות כאל דוגמאות שלב S, בהשוואה הפניה G1 מעוברים hpf 24 שעות ביממה. העוברים בין 10 hpf ו-24 hpf ייתן פרופילים מחזור התא ביניים, ניתן למיין במידת הצורך. האוכלוסייה S-שלב גם ניתן לזהות, ממויין על-ידי שילוב תימידין תחליפי כגון אדו (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) או BrdU (Bromodeoxyuridine) פולסים קצרים לפני קיבוע, עם זאת, זה לא הכרחי לקביעת מדויק תזמון שכפול.
אידיאלי הכנת ספריה צריך יהיה לעבוד עם µg 1 של ה-DNA. תיאורטית תאים ממוינים ~ 300,000 יניב µg כ 1 של ה-DNA (הערכת ~3.3 pg/גרעין), עם זאת, תמיד יש אובדן לאורך כל הפרוטוקול. 500,000 עד 1 מיליון תאים ממוינים צריך לתת יותר 1 µg של ה-DNA. העובר hpf 24 טיפוסי יהיה כ- 18,000 כדוריות, 10-15% מתוכם יהיו בשלב-S. עוברי בשלבים מוקדמים יותר של פיתוח יהיה הרבה פחות תאי, אבל יש אחוזים גבוהים של תאים בשלב-S.
ביצוע טיהור מדויק ובחירת גודל באמצעות beads מגנטי הוא קריטי כדי ביטול רכיבים לא רצויים משלב הכנת ספריה. בצע הוראות היצרן בקפידה, מיטוב נוספות העשויים להידרש. כמות קטנה של הדימרים PCR היא בדרך כלל לא בעיה רצינית, אבל מתאם הדימרים רצף ביעילות רבה כך הם צריכים להיות ממוזער. זו יכולה להיות מושגת על-ידי התאמת למתאם ה-DNA יחס הראשונית, וביצוע בחירה גודל מדויק במהלך הכנת ספריה.
רצף יחיד-end ייתכן המתאימים לצרכים שונים ניסיוני. יחיד-סיום זול והוא מספק את מרבית המידע הנדרש שכן גישה זו מתבססת על ספירת קריאות; סוף-לזווג מספק יכולת גבוהה יותר של PCR להסיר כפילויות אופטי וכדי לפתור תחומי רצפים חוזרות ולשינויים מבניים אחרים (אשר נפוצים הגנום דג זברה). החלק ניתוח להלן יעסוק רק קריאות לזווג-קצה הרצף. קריאות רצף קצר יכול להיות גם מתאים. פעולה זו תספק מספר גבוה יותר של קריאות במחיר נמוך יותר, אבל הקריאות עשוי להיות קשה יותר למפות. החלק ניתוח שלהלן ממוטב עבור קריאות bp 100 ולאחר התאמות עשוי להיות נחוץ אם נעשה שימוש באורך קריאה קצר יותר.
פרוטוקול זה בקלות גם ניתן להתאים לשימושים נוספים של המודל דג זברה. זה כבר היה בשימוש לניתוח של דג זברה האלוף. במשך fibroblasts (תאי ZTF), תא ראשי תרבות קו מבודד מן האלוף. במשך דג זברה למבוגרים. ללמוד סוגי תאים מבודדים של דג זברה, סמני הטרנסגניים יכול לשמש לזיהוי ולבידוד סוגי תאים בודדים לפני צביעת ומיון לתוכן ה-DNA. אסטרטגיה אפשרית אחת יהיה להשתמש קו הטרנסגניים לבטא סמן פלורסנט מונחה על ידי יזם רקמות ספציפיות, וכדי הראשון מבודד התאים על ידי FACS מיון, עקב קיבוע ומיון לתוכן ה-DNA. בנוסף, השימוש של צבעי ה-DNA חדיר תא עשוי לאפשר בידוד בו זמנית של סוגי תאים בודדים, כמו גם אוכלוסיות שלב G1 ו- S. עיבודים אלה כדי פרוטוקול זה יכול גם לאפשר שכפול תזמון מחקרים במודלים אחרים ויוו .
אפשרות מרגש לשימוש עתידי של פרוטוקול זה היא ללמוד את התפקיד של שכפול תזמון במחלה. ישנם מספר מודלים הסרטן בין דג זברה, חלקם ספונטניים inducible אחרים, יכול לשמש כדי לקבוע מתי מתרחשים שינויים בתזמון שכפול במהלך oncogenesis. פעולה זו תאפשר הערכה של עיתוי שכפול תפקיד ממלא בהתקדמות tumorigenesis ומחלות. יתר על כן, דג זברה הם מודל מצוין עבור והתרופות הקרנה והוא יכול לשמש כדי לזהות תרופות המשפיעות על שכפול תזמון התקנה, אשר יש הפוטנציאל לשימוש בטיפול בסרטן.
דג זברה היא מודל חדש מבטיח ללמוד שכפול תזמון. פרוטוקול זה להרשות רבים אחרים את ההזדמנות לנצל את המודל הזה לומד את התפקיד של שכפול תזמון בתחום הפיתוח המחלה. פרוטוקול זה ניתן להתאים לשימוש עם ויוו מודל התפתחותי מערכות אחרות, כגון דרוזופילה melanogaster צפרדע רפואית זריזה, ואת ממצאי העבר אל העתיד נראה אלה ואורגניזמים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי לאומי כללי לרפואה למדעי של מכוני הבריאות הלאומיים דרך מעניקה 5P20GM103636-02 (כולל Flow Cytometry תמיכה הליבה) ו- 1R01GM121703, וכן פרסים מהמרכז אוקלהומה עבור תאי גזע בוגרים מחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
