Optimización de un análisis de la expresión Multiplex basados en ARN usando Material de archivo de cáncer de mama

Summary

Degradación de ácidos nucleicos en el tejido archival, la heterogeneidad del tumor y la falta de muestras de tejido fresco congelado puede afectar servicios de diagnóstico de cáncer en laboratorios de patología en todo el mundo. Este manuscrito describe la optimización de un panel de biomarcadores utilizando un ensayo multiplex grano magnético para clasificar los cánceres de mama.

Abstract

Degradación de ácidos nucleicos en el tejido archival, la heterogeneidad del tumor y la falta de muestras de tejido fresco congelado puede afectar servicios de diagnóstico de cáncer en laboratorios de patología en todo el mundo. Amplificación del gene y la expresión diagnóstico pruebas utilizando material de archivo o material que requiere transporte al servicio de laboratorios, necesita una prueba más robusta y precisa, adaptada a flujos de trabajo clínicos actuales. Nuestro equipo de investigación ha optimizado el uso del ensayo de Plex de Invitrogen™ QuantiGene™ (Thermo Fisher Scientific) cuantificar RNA en material de archivo utilizando la tecnología de ADN ramificado (bDNA) en granos magnéticos de Luminex xMAP^® . El análisis de expresión génica se describe en este manuscrito es un método rápido y múltiplex de novela, que puede clasificar con precisión el cáncer de mama en los diferentes subtipos moleculares, omitiendo la subjetividad de la interpretación de técnicas de imagen. Además, debido a la entrada de material requerido, tumores heterogéneos pueden ser microdissected de láser con hematoxilina y eosina (H & E) secciones manchadas. Este método tiene una amplia gama de aplicaciones incluyendo clasificación tumor con potencial diagnóstico y medición de biomarcadores en líquido biopsias, que permitirían mejor gestión paciente y control de la enfermedad. Además, la cuantificación de biomarcadores en material de archivo es útil en investigación oncológica con acceso a las bibliotecas de material clínico anotado, en el que los estudios retrospectivos pueden validar biomarcadores potenciales y su evolución clínica correlación.

Introduction

Optimización de ensayos basado en RNA usando archivo formalina-fijo material parafina-encajado (FFPE) es difícil debido a la variabilidad en el tratamiento quirúrgico del tejido y la degradación del ARN causada por formol usado para tejido integridad preservación^{1, 2}. Para superar la limitación de la realización de estudios de expresión génica precisa de material de archivo, nuestro grupo utiliza el ensayo de grano magnético multiplex de bDNA. En lugar de amplificación enzimática de una plantilla de destino, la tecnología bDNA utiliza hibridación de sondas específicas y la amplificación de un reportero señal³. Las secuencias de reconocimiento corto de las sondas de detección y captura están diseñadas para hibridar a fragmentos cortos de RNA del objetivo⁴. Además, el uso de homogenados de tejido como material de partida directo en este ensayo, supera la inevitable pérdida de ARN, que resulta del análisis que requiere purificación y previa extracción de RNA. Amplificación de la señal, el uso de secuencias cortas de reconocimiento y la exclusión de un paso de purificación, contribuyen a reducir variación técnica del ensayo. La tecnología ofrece la posibilidad de multiplexar el ensayo (hasta 80 blancos de RNA) y medir la expresión de un grupo de objetivos de baja material de entrada. Este protocolo describe la preparación y tinción de muestras de tejido para Microdisección láser. La coloración de las diapositivas de membrana facilitar la proyección de imagen del tumor y la arquitectura histológica para proporcionar selección exacta y perfiles de: (1) el tumor y los conductos normales en el tejido mamario y (2) clones de la célula maligna en tumores heterogéneos.

Clasificación molecular del cáncer de mama es un proceso que interroga marcadores moleculares para categorizar tumores de pacientes en tres clases moleculares, es decir, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico luminal, humano (HER2)-subtipo enriquecido y basal. El subtipo HER2-enriquecido está bien definido, con alta expresión de HER2 receptor, debido a la amplificación del gen ERBB2, combinada con baja o ausencia de receptores de estrógeno (ER) y receptor de progesterona (PgR). El subtipo luminal es generalmente positivo para ER y el subtipo basal es en general negativo para los tres receptores (HER2, ER, PgR) y significativamente se traslapa con la mama triple negativos subtipo diagnóstico cáncer (TNBC)^5,6. Otros marcadores se utilizan para determinar las características epiteliales y mesenquimales. Fibronectina (FN1) es un componente principal del compartimiento mesenquimal del tejido de mama. Mayor expresión de FN1 se acompaña de Ki67 alta coloración y muestra una firma para un tumor más invasivo^7,8 y se asocia con metástasis⁹. Interesante, FN1 fue encontrada para estar presente en microvesículas que se origina en las células del tumor, que induce la activación de la señal mitogénica en fibroblastos receptores¹⁰. Por lo tanto, circulan microvesículas como exosomas son un marcador potencial de la detección temprana o de la metástasis y recaen¹¹.

Selección de áreas de tumor para subclasificación transcripcional del cáncer de mama recurrente ha sido realizada por macrodissection^12,13. Para superar la heterogeneidad del tejido y aumentar la sensibilidad, fiabilidad hemos combinado clásico tejido de coloración con los métodos de generación de perfiles moleculares multiplexores. Como una prueba del principio, dos clones de cáncer de mama diferentes se han definido por su firma mesenquimal epitelial y potencial metastático. El flujo de trabajo del protocolo descrito puede ser fácilmente traducido a la actual configuración clínica y utilizar selectivamente aislar y caracterizar los subtipos de tejido usando perfiles de mRNA específicos.

Protocol

Aprobación ética para el uso de material de tejido de mama en este estudio se obtuvo de la Universidad investigación ética Comité (UREC) de la Universidad de Malta (Ref: 22/2012).

1. preparación de tejido

1. Mediante adecuados procedimientos H & E¹⁴, preparar referencia teñido de tejido y digitalmente, escanear diapositivas de referencia durante la microdisección.
2. Con un micrótomo, corte secciones de tejidos de 20 μm en un baño de agua libre de ARNasa a 40 ° C. Recoger las secciones en las diapositivas de la membrana para Microdisección láser utilizando materiales y equipo limpio y descontaminado de Rnasa.
3. Secar los portaobjetos de la membrana a 37 ° C en un incubador de secado durante la noche. La mancha utilizando el apropiado H & E procedimiento¹⁵ con soluciones de grado de biología molecular y aumentar el tiempo de tinción de hematoxilina a 6 min. Si es necesario, mancha las diapositivas de la membrana con el apropiado immunohistochemical protocolos¹⁶.

2. Microdisección láser

1. Establecer los límites de la diapositiva y calibrar el movimiento de la etapa.
   1. Mover el punto de vista de láser en un área vacía de la diapositiva de la membrana. Calibrar el enfoque de láser disparando un láser dispararon aumentando intervalos de enfoque (5%) hasta que el láser comienza a perforar a través de la membrana. Drenaje y microdissect cualquier forma y afinar el foco del láser para maximizar la eficiencia del láser durante la disección del láser.
   2. Aumentar la velocidad de movimiento del escenario a un punto donde no se comprometa la eficacia de la disección de láser. Calibrar el laser en la lente del objetivo seleccionado y recalibrar si cambiar objetivos (láser velocidad de 1 – 15%), foco en el 70 – 75% y poder al 90-100% cuando se utiliza el objetivo de 4 X.
2. Analizar los portaobjetos de tinción de membrana usando el objetivo 4 de X.
3. Seleccionar y delimitar las zonas de microdissection de la diapositiva de la membrana. Láser diseccionar un área mínima de 42 mm². Registro la zona disecada para determinar el volumen homogeneizante del tampón de muestra a utilizar.
4. Utilizar el mecanismo de elevación de tapa para recuperar la sección disecada en las tapas de difusor de tubos etiquetados atado Apéndice correspondiente. Si no se recupera la sección disecada en la tapa, repita la disección del laser de la zona.

3. tejido lisis

Nota: Varias soluciones y los materiales se suministran junto con kits de mencionado en la Tabla de materiales.

1. Prepare el volumen requerido de mezcla homogeneización para la lisis de la muestra mediante homogeneización solución y proteinasa K a una proporción de 60: 1.
2. Pipetee 2.4 μL de homogeneizar la solución en cada tubo por cada 1 mm² de área de tejido, vortex durante 10 s a velocidad máxima y centrifugar a temperatura ambiente durante 5 s a 2.500 x g.
3. Incubar en un bloque de calentamiento a 65 ° C por 12 a 18 h con agitación a 600 rpm.
4. Centrifugue los lisados a 21.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Usando una pipeta, cuidadosamente aspirar el sobrenadante y dispensar en un tubo etiquetado fresco. Evite aspirar los fragmentos de tejido de la membrana, esto puede reducir la calidad de los resultados.
6. Guarde el sobrenadante en un congelador de-80 ° C.

4. hibridación basada en análisis

1. Realice los siguientes preparativos.
   1. Caliente previamente la mezcla de lisis el frasco del reactivo en una incubadora a 37 ° C por 30 min y mezclar suavemente por inversión.
   2. Si los homogenados de tejido se congela, descongelar a temperatura ambiente e incubar a 37 ° C por 30 min vórtex las muestras a la velocidad máxima después de la incubación.
   3. La incubadora de agitación en 54 ° C y colocar la sonda del kit de validación de la temperatura en un pozo vacío de una placa de 96 pocillos. Después de 2 h Verifique la temperatura en el termómetro digital y ajuste la temperatura del delta de sacudir la incubadora para corregir cualquier diferencia de temperatura.
   4. Deshielo y agitar la punta de prueba sistema y bloqueo reactivo para 10 s, centrifugar a temperatura ambiente durante 5 s a 2.500 x g y mantener en hielo.
   5. Mantenga el frasco de proteinasa K en el hielo durante el uso.
   6. Someter a ultrasonidos los granos captura a 46 KHz durante 3 min., luego vortex a máxima velocidad por otros 3 minutos.
2. Preparar una mezcla de grano de trabajo 25 μl por pocillo por ampliar en consecuencia los siguientes reactivos: 4.25 μl de agua libre de nucleasa, 16.65 μl de mezcla de lisis, 1.00 μl del bloqueo reactivo, 0.10 μl de proteinasa K, 0,50 μl de granos de la captura, 2.50 μl de sonda conjunto.
3. Vórtice la mezcla de grano de trabajo durante 10 s a velocidad máxima, luego Pipetear 25 μL/pocillo a la placa de separación magnética.
4. Pipetee 25 μl tejido homogeneizado a una placa de 96 pocillos de separación magnética y 25 μl solución para 3 pozos como los espacios en blanco de homogeneización.
5. Sellar la placa de separación magnética con un sello de presión de plástico transparente y colocar la placa en la incubadora a 54 ± 1 ° C por 18 – 22 h agitando a 600 rpm.
6. Preparar una solución 1 X wash buffer 24 pozos por 31,5 mL de libre de Rnasa de mezcla agua con 0,1 mL de lavado Tampón mL del componente 1 y 1,67 de componente de tampón de lavado 2.
7. Retire la placa de la incubadora. Ajustar la temperatura de la incubadora agitación 50 ± 1 ° C.
8. Montar la placa de separación magnética en la lavadora de la mano placa magnética y trábela en su lugar. Retire el sello de presión y espere 1 minuto para las bolas magnéticas resolver.
9. Paso de lavado: Invierta la placa de separación magnética montada en el plato sobre el fregadero y la mancha blanca /negra suavemente sobre un papel para quitar la solución residual. Utilizando una pipeta multicanal añadir 100 μl de solución tampón de lavado 1 X en cada pozo y espera 15 s. Repita este paso para lavar la placa 3 veces.
10. Pipetee 50 μl de reactivo previo a cada pocillo. Selle la placa con un sello de placa de aluminio y agitar la placa a 800 rpm durante 1 min a temperatura ambiente. Incubar durante 1 h a 50 ± 1 ° C agitando a 600 rpm.
11. Repita el paso 4.9 (paso de lavado).
12. Pipetee 50 μl del reactivo del amplificador a cada pocillo. Selle la placa con un sello de placa de aluminio y agitar la placa como en el paso 4.10.
13. Repita el paso 4.9 (paso de lavado).
14. Vórtice de la sonda de la etiqueta de 10 s a velocidad máxima. Añadir 50 μl de la sonda de etiqueta a cada pocillo. Tapar y agitar la placa (paso 4.10).
15. Repita el paso 4.9 (paso de lavado).
16. Vórtice ficoeritrina estreptavidina (SAPE) durante 10 s a velocidad máxima. Añadir 50 μl de SAPE a cada pocillo. Tapar y agitar la placa (paso 4.10).
17. Repita paso 4.9 (paso de lavado) excepto usar el tampón de lavado SAPE en lugar del tampón de lavado.
18. Añadir 130 μl de tampón de lavado SAPE a cada plato así y sellado con un sello de placa de aluminio. Agitar la placa a 800 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos.
19. Puesta en marcha el analizador de grano magnético. Realizar la calibración y verificación, siguiendo las instrucciones del fabricante.
20. Establecer un protocolo en el analizador de grano magnético usando los siguientes parámetros: tamaño de la muestra: 100 μl; Puerta DD: 5.000 – 25.000; Tiempo de espera: 90 s; Región de evento/grano grano: 100; y haga clic en siguiente. Seleccione los números de cuentas respectivas en el panel y definir las regiones de grano con los genes respectivos destino indicado por el fabricante.
21. Agregar un nuevo análisis seleccionando "crear lote utilizando un protocolo existente" desde la ficha de lotes . En el diseño de la placa designar los pozos como desconocido o en blanco, respectivamente y proporcionar una etiqueta para cada muestra en el Panel muestras .
22. Retire el sello de placa de aluminio de la placa de 96 pocillos de reacción. Abrir la bandeja de la placa haciendo clic en el botón de expulsión , la placa de carga en el analizador de grano magnético. Haga clic en retractarse| Ejecutar por lotes para iniciar el analizador. Después de leer, expulse y retire la placa de 96 pocillos. Limpiar y cerrar el analizador de grano magnético según lo recomendado por el fabricante.

5. Análisis de datos

1. En el lote| Ficha de resultados , seleccione el archivo de los análisis respectivos y haga clic en el botón exportar to.csv . The.csv abrir archivo usando un software de hoja de cálculo.
2. Observar las cuentas de perla y omitir ningún resultado, < 40 granos/región.
3. Promedio de los valores de los pocillos del blanco y calcular la desviación estándar (SD) y límite de detección (LOD) (espacio en blanco media + (3xSD)) por el gene de la blanco. Establecer los valores más bajo que el LOD como desapercibido.
   Nota: Si cualquiera de los valores de expresión normalización son detectado, mirar los datos de la muestra como inadecuada. Considerar valores de expresión más 20.000 como sobre el límite de sensibilidad superior. Los lisados de estas muestras deben diluirse y volver a analizar.
4. Reste el promedio en blanco de los datos crudos por gene.
5. Calcular la media geométrica de los genes de normalización seleccionados por muestra. Normalizar datos individuales de la muestra para la media geométrica respectiva.
6. Análisis de datos en plataformas de ciencia de datos o utilizando algoritmos definidos.
   1. Importar los datos en la plataforma de la ciencia de datos haciendo clic en Agregar datos. Arrastre el archivo de datos en el Proceso de trabajo y conectar a un operador [Seleccionar atributos] , luego a un principales análisis de componentes (ACP) operador y luego al puerto de t resul.
   2. En el Atributo seleccionar operador seleccionar el subconjunto de datos de genética normalizada y una variable nominal como subtipo de cáncer de mama. Ejecutar el proceso haciendo clic en jugar. En la ficha gráficos seleccione la "dispersión de Color 3D" en el estilo de tabla y la variable nominal en el campo de Color . Evaluar la variabilidad de los datos PCA en una parcela de 3 dimensiones.

Results

El método descrito ha sido aplicado para la medición simultánea de 40 transcripciones en H & E tinción (figura 1), microdissected (figura 2) altamente degradado material FFPE. Usando este método, se muestra la caracterización precisa del estado del receptor (Figura 3A), clasificación de tumores en subtipos moleculares luminal y basal¹⁷y expresión diferencial del marcador mesenquimal, FN1, al comparar el tumor y tejido de control emparejado (figura 3B), en los diversos subtipos del receptor de positivos y negativos.

Figura 1: expresión génica usando H & E tinción material. Correlación entre un perfil de la expresión derivado de una sección del tumor sin mancha en comparación con una sección de tumor manchadas. [Pearson correlación p-valor = 5.34E-26]. Reproducido con permiso de¹⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: láser microdisección de tejidos FFPE. (A) H & E tinción de diapositiva; (B) coloración Immunohistochemical para la expresión de ER; (C) la coloración de immunohistochemical HER2; (D) sección de 20 μm sin manchas en las diapositivas de membrana de Microdisección láser. La flecha amarilla indica una zona de tumor invasivo que no está demarcada claramente debido a la falta de coloración. (E) A 20 μm sección teñida con H & E para la mejor delineación de áreas de interés. Flechas blancas indican camino de disección laser mientras que la flecha roja muestra el enfoque de láser durante la disección. Todas las ilustraciones fueron capturadas con 10 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: expresión de estatus (A) del receptor y (B) mesenquimal marcador FN1, en tumor de mama en comparación con emparejado normal. Los subtipos de cáncer de mama diagnóstico clásicos se definen según el resultado de diagnóstico usando immunohistochemistry y fluorescencia en situ del hibridación (pescado) para la coloración de immunohistochemical equívoca de HER2. Se ilustra la expresión normalizada de (A) HER2 y ER, FN1 (B) medido por el ensayo de hibridación en HER2 positivo, ER positivo y casos TNBC en comparación con el paciente emparejado tejido mamario normal. La estadística de prueba de Kruskal Wallis (K-W χ²) muestra que la expresión de HER2 es significativamente (p < 0.05) más alta en el tejido del tumor en comparación con los tejidos normales igualados en la cohorte de HER2 positivo y significativamente menor en la cohorte TNBC. No se encontró expresión de ER a ser significativamente mayor en el tejido del tumor en comparación con el normal emparejado en el ER positivo y cohortes TNBC. FN1 es significativamente mayor en el tejido del tumor en los subtipos HER2 y ER positivo y muestra una tendencia a ser elevados perceptiblemente en el tejido del tumor también en la cohorte TNBC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: estudio de caso: heterogeneidad tumoral. Tumores morfológicamente distintos fueron microdissected y trataron como muestras distintas. (A) el maestro de exploración de la sección de H & E. (B, C) Un 10 x y 40 x aumentos, respectivamente para cada morfología del tumor identificado. (D) coloración Immunohistochemical para ER con 10 aumentos. (E) coloración Immunohistochemical para Ki67 en 10 aumentos que muestran una actividad mitótica mayor en tumor 1. (F) normalizó los niveles de expresión del gen ESR1 en cada tumor que muestra expresión relativamente alta e igual entre los tumores como se espera de los resultados de immunohistochemical. (G) normalizó los niveles de expresión de FN1, un marcador mesenquimal, donde mayor expresión FN1 es acompañada de Ki67 alta coloración que muestran una firma para un tumor más invasivo. El inverso se observa en tumor 2, que parece ser un tumor de lenta proliferación con un potencial maligno menor representado por la expresión reducida de FN1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Un análisis bDNA multiplex basados en grano fue optimizado para cuantificar la expresión génica en RNA degradado derivado de tejido de cáncer de mama FFPE y conductos de la mama normal. Optimizar el análisis, involucrados desarrollar un algoritmo para clasificar tumores de cáncer de mama en los subtipos luminales y basals utilizando 8 biomarcadores conocidos y potenciales 5 normalización de genes. Normalización de datos se realizó mediante permutaciones de los genes de normalización. La selección de los genes de normalización se basó en la mejor predicción del estado del receptor usando los genes de clasificador de Luminal Basal. Para clasificar los subtipos Luminal Basal de los tejidos FFPE, los genes de normalización seleccionados fueron Beta-actina (ACTB), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) e hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).

El método puede adaptarse para el uso en otro diagnóstico y líneas de investigación tras la selección adecuada del conjunto de gene normalización. Una aplicación importante de este método en el sector de investigación es la medición de biomarcadores en material de archivo que está anotado bien con los resultados clínicos. Podría validar posibles marcadores predictivos en estudios retrospectivos, con rapidez y precisión y evitar estudios prospectivos a largo plazo en espera de datos de supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad. Actualmente nuestro grupo está investigando el uso de la prueba para detectar receptores positivos exosomas, que requiere el desarrollo de un nuevo algoritmo que usa alternativo normalización de genes de normalización de datos. El uso de biopsias líquidas y ensayos de expresión genética sólida permitirá ensayos multiplex de alto rendimiento adaptados para el manejo de los pacientes durante el tratamiento y proporcionar un medio para seguir la eficacia del tratamiento, posibles recaídas debido a la resistencia a la terapia y la capacidad metastásica del tumor.

Este método también tiene una amplia gama de posibles aplicaciones en el diagnóstico de tumores y se adapta al actual flujo de trabajo diagnóstico. Las principales ventajas de este método en el área de diagnóstico incluyen: (1) la aplicación de ensayos de alto rendimiento, (2) excluyendo la subjetividad y resultados dudosos procedentes de medidas basadas en la imagen, (3) detección precisa de objetivos múltiples al mismo tiempo que mejorar la precisión y no minimizar el uso de preciosas muestras de pacientes y (4) requiere de instalaciones altamente especializadas y recursos humanos. El proceso de muestreo optimizada, junto con la entrada de material requerido para el ensayo multiplex basados en grano, permite más investigación de la heterogeneidad del tumor; mediante Microdisección láser para separar con precisión los focos múltiples de tejido maligno de la misma sección del paciente, es posible comparar varios genes entre ellos, así como con el tejido normal combinado (figura 4). Entrada material es vital para la aplicación de diagnóstico en las biopsias del tumor que proporcionan tejido tumoral limitada. La capacidad del ensayo para medir la expresión génica de muestras de RNA degradadas permite fácil transporte de las muestras para el análisis dentro de una institución o al servicio de los laboratorios. Además, análisis de la sección entera era también posible con H & E tinción de material (figura 1).

Para el éxito de este protocolo, es imprescindible: (1) asegurar el correcto muestreo del tumor sitio/s que son lisis para el análisis y (2) desarrollar bien optimizado y validado algoritmos de normalización de datos, para cada panel de expresión génica o el pronóstico individual o biomarcadores predictivos. El primero depende de la experiencia técnica del técnico/científico realizar el muestreo. Se recomienda tomar un núcleo adicional y preparar un microarray de tejido (TMA) en el mismo formato del ensayo multiplex grano magnético (formato de 96 pocillos). Esto proporcionará un archivo de sitios de tumor como una réplica de las muestras utilizadas para el análisis de RNA. TMAs también pueden ser evaluadas con otras técnicas de seguimiento investigación o validación de los resultados. El desarrollo de algoritmos de normalización es dependiente en el material investigado y los genes de normalización seleccionados para la normalización. Diferentes paneles de normalización de genes se seleccionan según el nivel y variabilidad de expresión en la muestra analizada y esto varía entre los tejidos de cáncer de distintos orígenes, exosomas de plasma o células tumorales circulantes. Validación del ensayo incluye muestra de procesamiento puesto que diversas preparaciones también resultará en algoritmos de normalización diferentes.

En Resumen, el uso de la tecnología bDNA en combinación con la tecnología magnética de grano y la selección del adecuado panel de genes diana, le proporcionará la ventaja de medir la expresión génica directamente en lisados de tejidos derivados de pequeñas cantidades de material de paciente, incluyendo microdissected exosomas material y circulación de las células del tumor. Además de la detección de heterogeneidad del tumor, el uso adecuado de los paneles tiene el potencial para detectar tumor derivado de exosomas para el diagnóstico temprano y detección precoz de recidivas. Puesto que no hay necesidad para un paso de amplificación de ácidos nucleicos, la amplificación de la señal usando la tecnología bDNA, combinada con el complejo basado en el grano, medidas de múltiples genes en el material de archivo clínico anotado y proporcionar un recurso para validación de biomarcadores.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtomo	Leica	RM2235
Heamatoxylin Sigma		MHS16-500mL
Eosina Y Aquaeous solution	Sigma	HT110216-500mL
Suero Normal	de Conejo Monosan	MONX10963	Dilución de trabajo: 1/40
Conejo Biotinilado anti-ratón	Dako	E0354	Dilución de trabajo: 1/200
Anticuerpo ER (6F11)	Vector Laboratories	VPE614	Dilución de trabajo: 1/45
Anticuerpo HER2 (CB11)	Novocastra	CB11-L-CE	Dilución de trabajo: 1/325
Anticuerpo Ki67 (MIB-1)	Dako	M7240	Dilución de trabajo: 1/500
Kit de complejo de biotina Avidina	Laboratorios Vector	PK-6100
Nikon Eclipse Ti-E Microscopio	invertidoObjetivos Nikon	Ti-E	4x, 10x, 20x y 40x
Membranas de microdisección láser	Máquinas moleculares & Industrias	S0103
mmi CellCamera 1.4	Máquinas moleculares & Industrias	MX4285c-ACK07
mmi Cellcut Plus	Máquinas Moleculares & Industrias
Tapas difusoras	Máquinas moleculares & Industrias	50210
mmi Celltools Software v.4.01rcl	Máquinas moleculares & Industrias
Eppendorf Thermomixer comfort	Eppendorf	5355000038
bloque calefactor de 1,5 ml para Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22670522
bloque calefactor de placa de 96 pocillos para Eppendorf Thermomixer Eppendorf		22670565
Labnet Vortemp 56 incubadora de agitación	Labnet	52056A-220
LX200 Analizador de bolas magnéticas 100/200	Luminex
Kit de procesamiento de muestras Invitrogen QuantiGene - Tejidos FFPE ThermoFisher	Scientific	QS0109
Kit de ensayo Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 (separación magnética)	ThermoFisher Scientific	QP1011
Película de sellado Thermaseal RTS		manual Thermaseal
	ThermoFisher Scientific	QP1011
Invitrogen QuantiGene Incubadora Kit de validación de temperatura	Affymetrix/Panomics	QS0517
Proteinasa K (50µ g/µ L)	ThermoFisher Scientific	14622
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets	ThermoFisher	Scientific Varios
Vórtice de Múltiples Velocidades	Kisker Biotech	MSV-3500
Sonicator	Silvercrest
RNASEZAP	Sigma	R2020-250ML
Sello de placa de aluminio de 96 pocillos	Sigma	Kit de validación de temperatura Z721549-100EA
	ThermoFisher Scientific	QS0517
Comunidad de RapidMiner Studio 7.1.001	Plataforma de ciencia de datos	RapidMiner
Horno de hibridación	Hybaid (Thermo Scientific)