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Artículo de método

Equivalentes tridimensionales tejido humano inflamatorio de la encía

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DOI:

10.3791/57157

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3 de abril de 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology, The Nippon Dental University, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Nippon Dental University Hospital

En este artículo

Resumen

El objetivo del protocolo es construir un modelo de inflamatoria gingival humano in vitro. Este modelo de tejido co cultiva tres tipos de células humanas, queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, en condiciones de tridimensionales. Este modelo puede aplicarse a la investigación de enfermedades periodontales como gingivitis y periodontitis.

Resumen

Enfermedades periodontales (como gingivitis y periodontitis) son las principales causas de pérdida de dientes en adultos. Inflamación en la encía es la fisiopatología fundamental de las enfermedades periodontales. Actuales modelos experimentales de enfermedades periodontales se han establecido en varios tipos de animales. Sin embargo, la fisiopatología de los modelos animales es diferente a la de los seres humanos, lo que hace difícil analizar mecanismos celulares y moleculares y evaluar nuevos medicamentos para enfermedades periodontales. Aquí, presentamos un protocolo detallado para reconstruir equivalentes de humano tejido inflamatorio de la encía (iGTE) en vitro. Primero construimos equivalentes de tejido humano de la encía (GTE) utilizando dos tipos de células humanas, incluyendo fibroblastos gingivales humanos (HGF) y queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT), bajo condiciones tridimensionales. Creamos un modelo de la herida usando un golpeador de tejido para hacer un agujero en el GTE. Próxima, humanas THP-1 monocitos mezclados con gel de colágeno se inyectan en el orificio del GTE. Por adimistration de 10 ng/mL forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) por 72 h, distinguen células THP-1 en macrófagos a focos inflamatorios forma en GTE (iGTE) (IGTE también puede ser stumilated con 2 μg/mL de los lipopolisacáridos (LPS) por 48 h para iniciar la inflamación ). IGTE es el primer modelo en vitro de encía inflamatorio con células humanas de una arquitectura tridimensional. IGTE refleja importantes cambios patológicos (immunocytes hidrógeno, interacciones intracelulares entre fibryoblasts, las células epiteliales, monocitos y macrófagos) en enfermedades periodontales. GTE, GTE herido y iGTE pueden utilizarse como herramientas versátiles para el estudio de la cicatrización de heridas, regeneración tisular, inflamación, interacción célula-célula y medicamentos potenciales pantalla para enfermedades periodontales.

Introducción

Enfermedades periodontales son la principal causa de pérdida de dientes en adultos. Gingivitis y la periodontitis son las enfermedades periodontales más comunes. Ambos presentan cambios inflamatorios agudos o crónicos mediada por biofilms en encía. Gingivitis se caracteriza por inflamación aguda, mientras que la periodontitis se presenta generalmente como una inflamación crónica. A nivel histológico, los componentes bacterianos desencadenan la activación de las células inmunes como macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y mastocitos1,2. Estas células inmunitarias, especialmente macrófagos, interactúan con las células locales (incluyendo las células epiteliales gingivales, fibroblastos, células endoteliales y osteoblastos) dando lugar a lesiones inflamatorias en el tejido periodontal3,4. Modelos experimentales de enfermedades periodontales se han establecido en varios tipos de animales, como ratas, hámsters, conejos, hurones, caninos y primates. Sin embargo, la fisiopatología de los modelos animales es diferente a la de los seres humanos, lo que hace difícil analizar mecanismos celulares y moleculares y evaluar nuevos medicamentos de enfermedades periodontales5. Co cultivo de bacterias periodontales y células epiteliales orales humanos monocapa se ha utilizado para investigar el mecanismo de las infecciones periodontales6. Sin embargo, cultivos monocapa de células orales carecen de la arquitectura celular de tridimensional (3D) de tejido intacto; por lo tanto, no imitan la situación en vitro .

Aquí, equivalentes 3D tejido humano inflamatoria de la encía (iGTE) se establecen para representar enfermedades periodontales en vitro. Este modelo 3D de las enfermedades periodontales ocupa una posición intermedia entre los cultivos celulares monocapa y en modelos animales. Tres tipos de células humanas, incluyendo queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, se cultivan conjuntamente en gel de colágeno y estimulados por inflamatorias iniciadores para construir iGTE. IGTE simula de cerca las condiciones en vivo de diferenciación celular, interacción célula-célula y activación de los macrófagos en la encía. Este modelo tiene muchas aplicaciones posibles de drogas evaluación y análisis de nuevas aproximaciones farmacológicas en enfermedades periodontales, así como para analizar los mecanismos celulares y moleculares en la cicatrización de heridas, inflamación y regeneración de los tejidos.

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Protocolo

Este protocolo está diseñado para crear equivalentes de tejido gingival humano, modelos de heridas gingivales y gingivitis modelos. Queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT) fueron amablemente proporcionados del Profesor Norbert E. Fusenig de Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Alemania)7. Los fibroblastos gingivales humanos (HGFs) fueron aislados de tejidos gingivales según los protocolos previamente publicados8. El consentimiento informado fue obtenido previamente y el estudio fue aprobado según los lineamientos establecidos por el Comité de ética, la Nippon Dental University Facultad de vida Odontología de Tokio (número de autorización: NDU-T2012-35). Pasos del protocolo 1 al 3 deben realizarse en una campana de cultivo celular.

1. preparación de los equivalentes de tejido humano 3D de encía (GTE) (figura 1A)

  1. Mezclar colágeno tipo-un gel con 10% concentrado MEM-alfa y reconstrucción 10% buffer (2,2 g de NaHCO3 y 4,47 g HEPES en 100 mL 0.05 N NaOH) en un tubo de 15 mL estéril mediante pipeteo. Mantener la solución de colágeno mezclado en hielo hasta su uso.
  2. Colocar insertos de cultura 24-well (poro tamaño 3.0 μm) en una placa de 24 pocillos.
  3. Quitar HGFs de la superficie de cultivo con solución al 0.25% tripsina-EDTA. Suspender las células en 10 mL de medio de cultivo A (MEM-alfa + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Contar las células de un contador de células de Türk Bürker.
    1. Extraer la cantidad deseada de las células (1-5 x105 células/mL) y centrifugar durante 4 min a 190 x g.
    2. Suspender las células en la solución de colágeno mixta. Mantenga la mezcla en hielo hasta el siguiente paso.
  4. Agregar 0,5 mL de la mezcla de células de colágeno (0,5 – 2,5 x 105 células/pocillo) en el inserto de cultura sin producir burbujas. Incubar la mezcla por 10-30 min en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 º C para coagular la mezcla en un gel.
    Nota: Agregar la mezcla de colágeno en el centro de la inserción de la cultura para evitar la formación desigual del gel de colágeno.
  5. Añadir 1 mL de medio de cultivo en el pozo y 0,5 mL en el inserto. Incubar la placa de cultivo de 24 h o toda la noche en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 ° C.
  6. Eliminar las células HaCaT desde la superficie de cultivo con solución al 0.25% tripsina-EDTA. Suspender las células en 10 mL de medio B (DMEM 10% FBS + 1% GlutaMAX) y contar las células. Extracto de la cantidad necesaria de células (1 – 5 x 105 células/mL) con una pipeta, centrifugar durante 4 min a x 190 g. suspender las células en medio B.
  7. Retire el medio de los insertos de la cultura, que contienen la mezcla de HGF-colágeno, por la aspiración. Agregar 0,5 mL de suspensión de células HaCaT (0,5 – 2,5 x 105 células/pocillo) en la parte superior de la mezcla de HGF-colágeno. Incubar los cultivos para 24 horas o durante la noche.
    Nota: En este momento, el medio de la cultura bien debe ser A medias, mientras que el medio de la inserción de la cultura debe ser medio B.
  8. Reemplazar el medio de cultivo con KSR medio (co-cultivo) (MEM-alfa + 15% nocaut suero recambio + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Añadir 1 mL de medio de cultivo en la cultura bien y 0,5 mL en el inserto de la cultura. Incubar los cultivos durante 24 – 48 h.
  9. Reemplazar el medio de cultivo con medio KSR + 1% FBS. Añadir 1 mL en la cultura bien y 0,5 mL en el inserto de la cultura. Incubar los cultivos para 24 horas o durante la noche.
  10. Reemplazar el medio de cultivo en la cultura con 0,7 – 1 mediano KSR de mL. Retire completamente el medio de la inserción de la cultura (la superficie de la cultura debe estar expuesta al aire). Incubar los cultivos durante 1 – 2 semanas. Cambiar el medio en la cultura bien dos veces por semana.
    Nota: No deje que el aumento del nivel medio sobre la superficie de cultivo (la capa superior compuesta de queratinocitos). Mantenga la superficie de cultivo seco.

2. preparación de GTE herido (figura 1B)

  1. Preparar un golpeador de tejido de 1 – 3 mm de diámetro. Esterilizar con un autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
  2. Introduzca el punzón de tejido perpendicular GTE sobre 300 μm de profundidad y perforar un agujero en el tejido para simular una herida.
  3. En este paso, utilice el GTE de heridos para la investigación de regeneración de tejido y cicatrización de herida. Por otra parte, fijar GTE uso tampón neutro de formalina al 10% para realizar el análisis histológico.

3. preparación de GTE inflamatoria (iGTE) (figura 1B)

  1. Cultivar células THP-1 según el anterior informe9.
  2. Mezclar colágeno tipo-un gel con 10% concentrado RPMI 1640, almacenador intermediario de la reconstrucción de 10% (2,2 g de NaHCO3 y 4,47 g HEPES en 100 mL 0.05 N NaOH) y 10 ng/mL PMA. No la solución de colágeno mezclado en hielo hasta su uso.
  3. Cuenta de 1-2 x 106 THP-1 células y centrifugar durante 4 min a x 190 g. suspender las células en 1 mL de la solución de colágeno mixta. Mantenga la mezcla en hielo hasta el siguiente paso.
  4. Añadir mezcla de 10-30 μL THP-1-colágeno en el área de heridos de GTE. Reemplazar el medio de cultivo a 0,7 – 1 medio KSR de mL que contiene 10 ng/mL de PMA.
  5. Incubar la mezcla en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 ° C por 72 h.
  6. Utilizar el modelo para la investigación de gingivitis o enfermedad periodontal (por ejemplo, añadir potencial medicamento antinflamatorio a iGTE a ver sus efectos en el cytokine release10). Como alternativa, omite 72 h PMA-tratamiento, añadir 2 μg/mL de LPS en la cultura e incubar el tejido en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 ° C por 48 h11,12.

4. la fijación y el Immunostaining de montar toda de GTE y iGTE culturas

  1. Fijación de las culturas.
    1. Retire el medio de cultivo de la placa de 24 pocillos. Lavar los tejidos 2 veces con tampón fosfato salino (PBS).
    2. Añadir 1 mL de formol al 10% buffer neutro solución el prospecto y 1 mL a la cultura también. Deje la placa de 24 pocillos en un refrigerador a 4 ° C durante la noche.
    3. Retire la solución de tampón neutro de formalina 10% al día siguiente.
    4. Por todo Monte immunostaining, lavar los tejidos 3 - 4 veces con PBS después de la fijación.
    5. De hematoxilina y eosina (H & E) coloración y immunostaining regular, proceder con la deshidratación, inclusión en parafina y seccionamiento.
      Nota: Para todo immunostaining de Monte, puede omitirse este paso.
  2. Todo Monte inmunotinción
    Nota: Este protocolo fue modificado de la referencia 13.
    1. Lavar los tejidos 3 x en PBS 0.5 – 1% Triton, 10-30 min cada vez.
    2. Incubar los tejidos dos veces por 30 min en solución amortiguadora de bloqueo (PBS 1% Tritón + BSA de 10%), a temperatura ambiente.
    3. Lavar los tejidos 2 × en solución amortiguadora de bloqueo, 5 – 10 min cada vez.
    4. Añadir 50 μl de solución de anticuerpo primario en la dilución/concentración requerida a los insertos. Utilice una película delgada transparente plástico para envolver los insertos para evitar secar el tejido.
    5. Incubar el tejido durante 1 a 2 días a 4 ° C.
    6. Lavar los tejidos 3 veces, durante 30 minutos en PBS 1% Tritón + 10% de BSA. Lavar nuevamente 3 veces, durante 5 minutos en PBS 1% Triton.
    7. Añadir 50 μl de anticuerpo secundario en solución amortiguadora de bloqueo (PBS 1% Tritón + BSA de 10%) y 5 μl de solución de Hoechst 33342 (tinción de NucBlue en vivo de la célula) para cada insert. Utilice una película delgada transparente plástico para envolver los insertos para evitar secar el tejido.
    8. Incubar durante 1 a 2 días a 4 ° C. Envolver la placa de 24 pocillos en una toalla de papel húmeda y luego ponerlo en un envase plástico para ser utilizado a lo largo de la incubación.
    9. Lavar los tejidos 3 veces, durante 10 min en el Tritón de PBS 1%
    10. Utilice una aguja afilada para cortar la membrana de la inserción de la cultura para obtener el tejido. Colocar la membrana en un portaobjetos.
      Nota: El tejido debe estar en la membrana.
    11. Añadir 2-3 gotas de medio de montaje de fluorescencia. Cubrir el tejido con una cubierta de vidrio y conservar a 4 ° C en la oscuridad hasta su análisis.
    12. Ver los tejidos con un láser confocal de barrido microscopía (LSM).

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Resultados

Las células HaCaT muestran morfología típica del keratinocyte bajo observación microscópica de contraste de fase (figura 2A). Scanner electrón microscópico (SEM) las imágenes demostraron que las superficies de células HaCaT estaban cubiertas por microvellosidades muchos. Conexiones intercelulares entre las células HaCaT fueron mediadas por procesos de membrana (figura 2B). Las células HaCaT expresaron epitelio gingival marcador K...

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Discusión

Este protocolo se basa en métodos de creación de tejido gingival equivalentes y equivalentes de tejido adiposo subcutáneos, según anteriores informes8,21,22. Aunque este es un método simple y fácil, algunos pasos requieren especial atención. Por ejemplo, la mezcla de colágeno debe conservarse en hielo hasta su uso para evitar la formación de gel en la solución. Cuando se agrega la mezcla de colágeno en el inserto de la cultura, ...

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Divulgaciones

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) subvenciones para la investigación científica (26861689 y 17 K 11813). Los autores desean agradecer al Sr. Nathaniel Green por corrección.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Colágeno tipo I-ANitta Gelatin IncPara hacer dermis de GTE
MEM-alphaThermo Fisher Scientific11900073Medio de cultivo celular
Inserto de cultivo celular (para placa de 24 pocillos), tamaño de poro 3.0 μ mCorning, Inc.353096para el cultivo de tejidos
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061 Reactivo de cultivo celular
DMEMThermo Fisher Scientific31600034Medio de cultivo celular
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828028Reactivo de cultivo celular
Perforadora de tejidosShibata system service co., LTDSP-703Para perforación de agujeros en GTE
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific31800022Medio de cultivo celular
BSASigma-AldrichA3294Para inmunotinción
Hoechst 33342 (tinción de células vivas NucBlue)Thermo Fisher ScientificR37605Para el etiquetado de núcleos
Medio de montaje de fluorescenciaDakoPara el montaje de muestras después de la
inmunotinciónAnticuerpo anti-citoqueratina 8 + 18 [5D3]abcamab17139Para identificar epitelio
Microscopio electrónico de barridoHitachi, Ltd.HITACHI S-4000Para observar la topografía y la composición de la superficie de las muestras
Microscopía de barrido láser confocalLSM 700; Carl Zeiss Microscopía Co., Ltd.LSM 700Para la observación de muestras de tinción de inmunofluorescencia
Anti-Citoqueratina 19 anticuerpoabcamab52625Para la identificación del epitelio
Anti-vimentina anticuerpoabcamab92547Para la identificación de fibroblastos y macrófagos activados
Anticuerpo anti-TE-7MilliporeCBL271Para la identificación de fibroblastos en la dermis
Anti-CD68 anticuerpoSigma-AldrichSAB2700244Para la identificación de macrófagos
Anticuerpo CD14 humanoR& D SystemsMAB3832-SPPara la identificación de macrófagos
Alexa Fluor 594 anticuerpo secundario conjugado contra cabras anti-conejoThermo Fisher ScientificA11012Para tinción por inmunofluorescencia
Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario anti-ratónThermo Fisher ScientificA11001Para tinción por inmunofluorescencia
imágenes celulares EVOS FLThermo Fisher ScientificPara la observación de la inmunofluorescencia de la muestra que tiñe
las células THP-1Banco de células Riken BRCRCB1189 Para la fabricación de iGTE
PMA (Forbol 12-miristato 13-acetato)Sigma-AldrichP8139Para diferenciar células THP-1
contra cabras Sistema de adquisición de

Referencias

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