El objetivo del protocolo es construir un modelo de inflamatoria gingival humano in vitro. Este modelo de tejido co cultiva tres tipos de células humanas, queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, en condiciones de tridimensionales. Este modelo puede aplicarse a la investigación de enfermedades periodontales como gingivitis y periodontitis.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Equivalentes tridimensionales tejido humano inflamatorio de la encía
En este artículo
Resumen
Resumen
Enfermedades periodontales (como gingivitis y periodontitis) son las principales causas de pérdida de dientes en adultos. Inflamación en la encía es la fisiopatología fundamental de las enfermedades periodontales. Actuales modelos experimentales de enfermedades periodontales se han establecido en varios tipos de animales. Sin embargo, la fisiopatología de los modelos animales es diferente a la de los seres humanos, lo que hace difícil analizar mecanismos celulares y moleculares y evaluar nuevos medicamentos para enfermedades periodontales. Aquí, presentamos un protocolo detallado para reconstruir equivalentes de humano tejido inflamatorio de la encía (iGTE) en vitro. Primero construimos equivalentes de tejido humano de la encía (GTE) utilizando dos tipos de células humanas, incluyendo fibroblastos gingivales humanos (HGF) y queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT), bajo condiciones tridimensionales. Creamos un modelo de la herida usando un golpeador de tejido para hacer un agujero en el GTE. Próxima, humanas THP-1 monocitos mezclados con gel de colágeno se inyectan en el orificio del GTE. Por adimistration de 10 ng/mL forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) por 72 h, distinguen células THP-1 en macrófagos a focos inflamatorios forma en GTE (iGTE) (IGTE también puede ser stumilated con 2 μg/mL de los lipopolisacáridos (LPS) por 48 h para iniciar la inflamación ). IGTE es el primer modelo en vitro de encía inflamatorio con células humanas de una arquitectura tridimensional. IGTE refleja importantes cambios patológicos (immunocytes hidrógeno, interacciones intracelulares entre fibryoblasts, las células epiteliales, monocitos y macrófagos) en enfermedades periodontales. GTE, GTE herido y iGTE pueden utilizarse como herramientas versátiles para el estudio de la cicatrización de heridas, regeneración tisular, inflamación, interacción célula-célula y medicamentos potenciales pantalla para enfermedades periodontales.
Introducción
Enfermedades periodontales son la principal causa de pérdida de dientes en adultos. Gingivitis y la periodontitis son las enfermedades periodontales más comunes. Ambos presentan cambios inflamatorios agudos o crónicos mediada por biofilms en encía. Gingivitis se caracteriza por inflamación aguda, mientras que la periodontitis se presenta generalmente como una inflamación crónica. A nivel histológico, los componentes bacterianos desencadenan la activación de las células inmunes como macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y mastocitos1,2. Estas células inmunitarias, especialmente macrófagos, interactúan con....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Este protocolo está diseñado para crear equivalentes de tejido gingival humano, modelos de heridas gingivales y gingivitis modelos. Queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT) fueron amablemente proporcionados del Profesor Norbert E. Fusenig de Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Alemania)7. Los fibroblastos gingivales humanos (HGFs) fueron aislados de tejidos gingivales según los protocolos previamente publicados8. El consentimiento informado fue obtenido previamente y el estudio fue aprobado según los lineamientos establecidos por el Comité de ética, la Nippon Dental University Facultad de vida Odont....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Las células HaCaT muestran morfología típica del keratinocyte bajo observación microscópica de contraste de fase (figura 2A). Scanner electrón microscópico (SEM) las imágenes demostraron que las superficies de células HaCaT estaban cubiertas por microvellosidades muchos. Conexiones intercelulares entre las células HaCaT fueron mediadas por procesos de membrana (figura 2B). Las células HaCaT expresaron epitelio gingival marcador K.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo se basa en métodos de creación de tejido gingival equivalentes y equivalentes de tejido adiposo subcutáneos, según anteriores informes8,21,22. Aunque este es un método simple y fácil, algunos pasos requieren especial atención. Por ejemplo, la mezcla de colágeno debe conservarse en hielo hasta su uso para evitar la formación de gel en la solución. Cuando se agrega la mezcla de colágeno en el inserto de la cultura, .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) subvenciones para la investigación científica (26861689 y 17 K 11813). Los autores desean agradecer al Sr. Nathaniel Green por corrección.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colágeno tipo I-A | Nitta Gelatin Inc | Para hacer dermis de GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Medio de cultivo celular |
| Inserto de cultivo celular (para placa de 24 pocillos), tamaño de poro 3.0 μ m | Corning, Inc. | 353096 | para el cultivo de tejidos |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 Reactivo de cultivo celular | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Medio de cultivo celular |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Reactivo de cultivo celular |
| Perforadora de tejidos | Shibata system service co., LTD | SP-703 | Para perforación de agujeros en GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Medio de cultivo celular |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | Para inmunotinción |
| Hoechst 33342 (tinción de células vivas NucBlue) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | Para el etiquetado de núcleos |
| Medio de montaje de fluorescencia | Dako | Para el montaje de muestras después de la | |
| inmunotinciónAnticuerpo anti-citoqueratina 8 + 18 [5D3] | abcam | ab17139 | Para identificar epitelio |
| Microscopio electrónico de barrido | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | Para observar la topografía y la composición de la superficie de las muestras |
| Microscopía de barrido láser confocal | LSM 700; Carl Zeiss Microscopía Co., Ltd. | LSM 700 | Para la observación de muestras de tinción de inmunofluorescencia |
| Anti-Citoqueratina 19 anticuerpo | abcam | ab52625 | Para la identificación del epitelio |
| Anti-vimentina anticuerpo | abcam | ab92547 | Para la identificación de fibroblastos y macrófagos activados |
| Anticuerpo anti-TE-7 | Millipore | CBL271 | Para la identificación de fibroblastos en la dermis |
| Anti-CD68 anticuerpo | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | Para la identificación de macrófagos |
| Anticuerpo CD14 humano | R& D Systems | MAB3832-SP | Para la identificación de macrófagos |
| Alexa Fluor 594 anticuerpo secundario conjugado contra cabras anti-conejo | Thermo Fisher Scientific | A11012 | Para tinción por inmunofluorescencia |
| Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario anti-ratón | Thermo Fisher Scientific | A11001 | Para tinción por inmunofluorescencia |
| imágenes celulares EVOS FL | Thermo Fisher Scientific | Para la observación de la inmunofluorescencia de la muestra que tiñe | |
| las células THP-1 | Banco de células Riken BRC | RCB1189 Para la fabricación de iGTE | |
| PMA (Forbol 12-miristato 13-acetato) | Sigma-Aldrich | P8139 | Para diferenciar células THP-1 |
Referencias
- Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
- Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases a....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
