El planarian Schmidtea mediterranea es un excelente modelo para estudiar las células madre y regeneración de los tejidos. Esta publicación describe un método para eliminar selectivamente un órgano, la faringe, por la observación de animales de la azida de sodio químicos. Este protocolo también describe métodos para el monitoreo de la regeneración de la faringe.
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Artículo de método
Química la amputación y la regeneración de la faringe en el Planarian Schmidtea mediterranea
En este artículo
Resumen
Resumen
Planarias son gusanos planos que son muy eficientes en la regeneración. Deben esta capacidad a un gran número de células madre que pueden responder rápidamente a cualquier tipo de lesión. Modelos de lesiones comunes en estos animales eliminar grandes cantidades de tejido, lo cual daña múltiples órganos. Para superar el daño de tejido amplia, se describe aquí un método para eliminar selectivamente un único órgano, la faringe, en el planarian Schmidtea mediterranea. Logramos esto por los animales remojo en una solución que contiene la azida de sodio inhibidor de la citocromo oxidasa. Breve exposición a azida de sodio provoca la protuberancia de la faringe del animal, que llamamos "química amputación." Química amputación elimina la faringe entera y genera una pequeña herida en la faringe se fija al intestino. Después de lavado amplia, todos los animales amputados regeneran una faringe completamente funcional en aproximadamente una semana. En el resto de la regeneración de la unidad de cuerpo de la faringe nuevas células. Presentamos un detallado protocolo de amputación química y describir los métodos histológicos y de comportamiento para evaluar éxito amputación y regeneración.
Introducción
La regeneración es un fenómeno que ocurre en todo el reino animal, con capacidad regenerativa de la regeneración de todo el cuerpo de ciertos invertebrados a más facultades en vertebrados1. Sustitución de tejido funcional es un proceso complejo y a menudo implica la restauración simultánea de múltiples tipos de células. Por ejemplo regenerar el miembro de Salamandra, osteoblastos, condrocitos, neuronas, músculos y células epiteliales deben ser reemplazado2. Estos tipos de celda recién generado también tiene que organizarse adecuadamente para facilitar la nueva función del miembro. Comprensión de estos procesos complejos ....
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Protocolo
1. preparación
-
Preparación de agua de la planaria 17
- Mantener planarias en una solución de sal de X Montjuïc 1. Para preparar el planarian agua, hacer soluciones stock individuales de 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M de MgCl2, 1 M KCl y 5 M de NaCl en agua ultrapura. Filtro-esterilizar con un almacenamiento a largo plazo de la filterfor superior de la botella de 0.2 μm.
Nota: Utilizar sólo agua desionizado ultrapura (con una resistividad de 18,2 MΩ a 25 ° C) para preparar Montjuïc sales. - Para preparar un stock de 1 L de solución salina de 5 X, mezclar 5....
- Mantener planarias en una solución de sal de X Montjuïc 1. Para preparar el planarian agua, hacer soluciones stock individuales de 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M de MgCl2, 1 M KCl y 5 M de NaCl en agua ultrapura. Filtro-esterilizar con un almacenamiento a largo plazo de la filterfor superior de la botella de 0.2 μm.
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Resultados
Exposición a la azida de sodio altera la motilidad normal de planarias, causando animales y writhe. Estos movimientos la fuerza la faringe de la parte ventral del animal, y después de aproximadamente 6 minutos en solución de azida de sodio, puede verse la punta blanca de la faringe (figura 1B-panel de la izquierda). Unos minutos más tarde, animales activamente contraen y extienden totalmente la faringe empujando con fuerza fuera del cuerpo. <.......
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Discusión
Este protocolo describe un método de ablación selectiva de la faringe con azida de sodio. Otros estudios de ablación dirigida en planarias han utilizado cirugía modificada para eliminar fotorreceptores21 o tratamiento farmacológico a la ablación de las neuronas dopaminérgicas22. Una ventaja importante de amputación química sobre los métodos existentes es que no requiere cirugía. La estructura rígida de la faringe en comparación con el resto del cuerpo planarian facilita su .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Alejandro Sánchez Alvarado, quien apoyó la optimización inicial y el desarrollo de esta técnica. Trabajo en laboratorio de Carolyn Adler está financiado por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Cornell.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuï c solución salina |
| Sulfato de magnesio anhidro (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuï c solución salina |
| cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuï c solución |
| salina Cloruro de potasio (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuï c solución |
| salina Cloruro de sodio (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuï c solución salina |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuï c solución salina |
| Nalgene copolímero de polipropileno esterilizable en autoclave lowboy con grifo | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Almacenamiento de agua planaria |
| Océano instantáneo Espectro de sal marina | Marcas Agua | planaria amazónica | |
| Sulfato de gentamicina | Gemini Bioproductos | 400-100P Agua | planaria |
| Hojas de afeitar | Ciencias de la microscopía electrónica | 71970 | Picar hígado |
| Mangas pasteleras desechables-16", paquete de 12 | limículas | Wilton | Amazon |
| mL Jeringas | BD/VWR | 309647 | Alícuotas de hígado |
| Placas de Petri-35 mm/60 mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Recipientes de plástico (varios tamaños) | Ziploc | Amazon | Planarias de vivienda en cultivo estático |
| Azida de sodio | Sigma | S2002 | |
| Pipeta de transferencia | Pinzas Globe Scientific | 138030 | |
| - Pinza Dumont, Estilo 5 | Ciencias de Microscopía Electrónica | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Estreptavidina, Alexa Fluor 488 conjugado | ThermoFisher | S11223 | |
| Glicerol | Fisher BioReactivos | BP229-1 |
Referencias
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M.
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Reimpresiones y permisos
