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Absorción de Metal esencial en bacterias Gram-negativas: rayos x de fluorescencia, radioisótopos y fraccionamiento de la célula

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DOI:

10.3791/57169

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1 de febrero de 2018

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1Graduate Biomedical Sciences Microbiology Theme, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 3Office of the Provost, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

En este artículo

Resumen

Un protocolo para la extracción de una chaperona de periplasmic metales de transición en el contexto de sus socios de Unión nativos y caracterización biofísica de su contenido de sustrato mediante rayos x se presenta absorción fluorescencia y radiometal.

Resumen

Demostrar un método escalable para la separación del periplasma bacteriano del citoplasma. Este método se utiliza para purificar la proteína periplasmic con fines de caracterización Biofísica y medida sustrato transferencia entre compartimentos periplasmic y citoplásmicas. Limitando cuidadosamente el momento en que el periplasma se separado del citoplasma, el experimentador puede extraer la proteína de interés y análisis cada compartimento individual para sustrato sin contaminación remanente entre compartimientos. La proteína extraída del fraccionamiento puede entonces analizarse más para la determinación de la estructura tridimensional o perfiles de unión a sustrato. Por otra parte, este método puede realizarse después de la incubación con una radiosonda para determinar absorción por ciento total, así como la distribución del trazador (y por lo tanto metal transporte) a través de diferentes compartimentos bacterianas. Experimentación con un radiotrazador puede ayudar a diferenciar entre un sustrato fisiológico y sustrato artefactual, como los causados por mismetallation.

Fluorescencia de rayos x puede utilizarse para descubrir la presencia o ausencia de la incorporación de metal en una muestra, así como medir los cambios que pueden ocurrir en la incorporación de metal como un producto de condiciones de crecimiento, las condiciones de depuración y/o condiciones de cristalización. Fluorescencia de rayos x también proporciona una medida relativa de abundancia para cada metal, que puede utilizarse para determinar el mejor pico de absorción de energía metal a utilizar para la recolección de datos de dispersión de rayos x anómalo. RadioMetal absorción puede utilizarse como un método para validar la naturaleza fisiológica de un substrato detectada por fluorescencia de rayos x, así como apoyar el descubrimiento de nuevos sustratos.

Introducción

En bacterias Gram-negativas, piscinas citoplásmicos de los átomos de metales de transición son aumentados y reaprovisionados por Importadores de membrana interna ABC (cassette de unión a ATP) que mitigan la translocación del metal a través de la membrana interna. Periplasmic grupo a-1 sustrato proteinas (SBPs) componen un grupo de acompañantes que se unen los átomos de metal directamente y ferry por el periplasma entregar a cognado de Importadores ABC1. Otros racimos de SBPs se dedican al transporte de substratos, tales como metal quelatado (Cluster A-2), carbohidratos (grupos B y D-1) y aminoácidos (grupos B, C, F-2 y F-4); sin embargo, independientemente del sustrato, SBPs siguen una doblez de c-clamp evolutivamente conservado2. El mecanismo propuesto generalizado para la transferencia de sustrato PAS incluye la abrazadera en c en una serie de contorsiones que se asemejan a una Venus atrapamoscas3. En general, SBPs a-1 racimo purifican en una holo (metal-limite) forma, aunque el estudio de estos SBPs está limitada por la dificultad para generar apo (libre de metal) formas de proteína para experimentación4. Hasta la fecha, estrategias para el estudio de apo Cluster SBPs a-1 se han limitado a la mutagénesis, la diálisis y la desnaturalización parcial con etilendiaminotetracético (EDTA) del ácido quelante5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. datos estructurales procedentes de estos experimentos sugieren que el Cluster SBPs a-1 no puede seguir precisamente el mecanismo de la Venus atrapamoscas. Actualmente falta de la literatura es un método de producir apo SBPs a-1 grupo en vivo con socios de la Unión fisiológica.

Demostramos por primera vez mediante fraccionamiento celular para purificar YfeA, un Pas de a-1 racimo de pestis de Yersinia, el agente etiológico de la plaga, que fue convertida a la forma de apo a través de la interacción con su importador de ABC YfeBCDE cognado fisiológica en la célula. Mostramos que yfea es en la forma apo por espectroscopía de rayos x de energía dispersiva (EDS), también conocida como fluorescencia de rayos x. También demostramos YfeBCDE funcionalidad combinando fraccionamiento celular con estudios de absorción de metal radioactivos altamente sensible para distinguir entre absorción de metal a través de la membrana externa y metal importación a través de la membrana interna. El uso de un trazador radiactivo permite la detección de cantidades de pg/L de metales, mucho más bajos que el límite de detección por técnicas tales como inductivamente habían acoplada espectrometría de plasma (ICP-MS) o espectroscopia de absorción atómica (AAS). Esto permite la mínima perturbación del sistema en estudio. Además, los métodos tradicionales descritos a menudo requieren volúmenes de muestra más grandes, más post-proceso y vuelta tiempo, que no es típico para los ensayos de radiosonda. Así, utilizando un radiotrazador proporciona un método conveniente y sencillo de control de distribución de metal y absorción dentro de una célula. Queda por determinarse si un apo que SBP a-1 racimo producido con este método imprimiría las observaciones estructurales de las prácticas actuales para generar la proteína apo.

Fraccionamiento celular es un método establecido para separar compartimentos celulares con el propósito implícito de sondeo específicamente su contenido en el aislamiento12. Fraccionamiento celular es utilizado para confirmar la ubicación de una molécula durante el ciclo celular o medir la actividad de un compartimiento particular13. Por ejemplo, actividad de transporte de metal puede ensayarse mediante el sondeo de compartimentos celulares para sustrato metálico. Integración de fraccionamiento celular permite la distinción y comparación entre absorción de metal a través de la membrana externa y la transferencia de metal a través de la membrana interna. Estos procesos luego a su vez se pueden medir en el tiempo. En el caso de purificación de proteínas, los métodos más comunes de lisis celular y la separación de componentes solubles de componentes insolubles son trastornos mecánicos (molienda, mezcla), homogeneización de alta presión (es decir, prensa de la célula de presión francesa, celular disruptor) y frecuencias ultrasónicas (es decir., sonicación)14. Uso de frecuencias ultrasónicas para lyse las células generalmente es más adecuado para pequeños volúmenes; sin embargo, sonicación se conoce para generar calor excesivo que puede desnaturalizar la proteína. Para evitar generar calor excesivo, frecuencias ultrasónicas se aplican generalmente en arranques cortos secuenciales, que pueden ser desperdiciador de tiempo y sin querer degradar las moléculas de ADN en fragmentos más pequeños. Además, múltiples sondas de sonicación caro pueden ser necesarias para los experimentos preparativas y analíticos, como cada sondeo tiene un margen limitado para el volumen de muestra que pueda ser procesado. De alta presión para lyse las células evitan generar calor excesivo durante la lisis celular por refrigeración componentes de prensa de la célula de presión francesa antes de la lisis o funcionamiento un disruptor celular en un ambiente frío como el cuarto frío. Como sondas de sonicación, varios conjuntos de componentes de prensa de la célula de presión francesa deba comprar para procesar una amplia gama de volúmenes de muestra. Presión francesa celular prensa asambleas son fáciles de conectar pero torpe funcionar y limpiar, puede ser pesado para moverse y son propenso a la obstrucción de muestras densas. Ventajas al uso de frecuencias ultrasónicas y sistemas de alta presión para lyse las células incluyen recuperación muestra alta, capacidad de procesar varias muestras con contaminación mínima, y fuerza de corte ajustable, que puede ser adaptado para la optimización de la lisis de una amplia gama de tipos de muestras. Optimización puede ocurrir mediante el ajuste de la frecuencia ultrasónica, duración de ráfagas, pistón presión de libras por pulgada cuadrada (psi) y el número de pases a través de la prensa. Uso de interrupción mecánica para lisar las células puede ser la estrategia más trivial y menos costosa para la lisis celular. Interrupción mecánica puede presentar dificultades en la recuperación de la muestra y no es ideal para el procesamiento de muestras múltiples. Interrupción mecánica es más suave a las muestras de alta presión o frecuencias ultrasónicas, pero no es alto rendimiento y es propensa a lisis ineficiente. Una significativa limitación experimental de interrupción mecánica, alta presión de homogeneización y frecuencias ultrasónicas, es la perturbación incontrolable de toda la arquitectura celular tal que después de la lisis, se mezclan todos los componentes acuosos de la célula juntos. Además, todos los compartimentos de la célula no se rompen al mismo tiempo; por lo tanto, contenido de compartimientos que Lisan temprano puede ser objeto constantes fuerzas disruptivas más contenido de compartimientos que Lisan tarde. Fraccionamiento celular permite barato, técnicamente sencillo, eficiente compartimiento de separación del contenido de la celda, evitando la necesidad de equipo costoso y exposición de la muestra a fuerzas disruptivas, ásperas.

En el caso de la SBP, sustrato importado es reintroducido a potencialmente apo proteína y proteína holo regenera durante la lisis, antes de la cromatografía descendente u otras técnicas de purificación. Inclusión de quelante EDTA durante la lisis presenta un obstáculo adicional, donde metal afinidad como un primer paso de purificación de proteínas no es posible ya que EDTA se tira de metal de la resina de cromatografía y evitar la proteína vinculante15. Una solución simple y barata es fraccionamiento celular por choque osmótico, donde centrifugación diferencial y reactivos comunes de laboratorio permiten al investigador a extraer con cuidado suficiente proteína para el análisis funcional. Choque osmótico fraccionamiento utiliza un cambio de dos etapas de presión osmótica para separar compartimentos celulares. En primer lugar, un buffer hipertónico hace que las células a crenado como agua sale cada celular y en segundo lugar, un tampón hipotónico hace las células hincharse como agua vuelve a entrar en cada célula. Controlando cuidadosamente cuánto tiempo las células se hinchan, las membranas externas pueden selectivamente lisis (debido a la acumulación de presión osmótica del agua entrante), así el vaciar su contenido en el búfer. Preservación de las membranas internas asegura que el contenido citoplásmico se conserva en Esferoplastos y se separa fácilmente de periplasmic contenido por centrifugación.

YfeA es un polyspecific PAS capaz de unión de hierro, manganeso y zinc átomos16. Las proporciones relativas de metal incorporado puede ser alterado según suplementos metálicos durante el crecimiento y analizadas por fluorescencia de rayos x como en Advanced Photon Source16 del laboratorio nacional de Argonne. Fluorescencia de rayos x permite al investigador a perfil rápidamente un amplio conjunto de metales sin necesidad de grandes o difracción cristales de calidad e incluso puede recoger datos de solución proteica o precipitado de proteína.

Fluorescencia de rayos x puede rápidamente revelar resultados inesperados como, en este caso, el principal sustrato YfeA siendo cinc y no los sustratos fisiológicos documentado hierro o manganeso16. Si se utiliza antes de recopilar datos de dispersión de rayos x, fluorescencia de rayos x puede informar al investigador en diseño experimental, como la que bordea energía metal para utilizar para la recolección de datos de dispersión de rayos x anómalo. Igualmente útil como determinar la abundancia relativa de un metal, fluorescencia de rayos x también puede determinar si un metal está ausente en una muestra, proporcionando un método rápido de separar cristales de metal que contiene apo proteína de proteína de holo y la estimación de fuerza de señal sin necesidad de mucho tiempo de procesamiento de datos. A identificar una muestra con una señal fuerte de metal, se puede determinar la longitud de onda exacta a utilizar para la recolección de datos de dispersión de rayos x anómalo por la exploración de múltiples longitudes de onda de dispersión anómala (MAD).

Este protocolo detallado está destinada a nuevos experimentadores con éxito realizar fraccionamiento celular y hacer uso eficaz de hardware de línea de sincrotrón en el perfil del contenido metálico total y el estudio de proteínas de unión a metal.

Protocolo

1. cultura de arrancador bacteriana (día 1)

  1. En un matraz de 200 mL biselado, inocular 30 mL de caldo Luria Bertani (LB) con la cepa de Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL células que contienen plásmidos de pYFE316.
  2. Añadir 30 μl de ampicilina 50 mg/mL al matraz por aspiración con una pipeta y punta de 200 μl. Agitar durante la noche a 225 rpm a 37 ° c.

2. complementa la preparación de los medios mínimos M9 (día 2)

Nota: Esto es adaptado del manual Amresco.

  1. Preparar 6 L de medio líquido de la siguiente manera. En un matraz de 2 L biselado, añadir a 1 L de ultra pura H2O. Autoclave a 121 ° c por 20 min 10,5 g de media mínimo M9 y luego enfriar a temperatura ambiente.
  2. Asépticamente añadir las siguientes soluciones estériles suplemento: 2 mL/L de 1 M MgSO4, 10 mL/L de glucosa de 20% w/v, 0,1 mL/L de 1 M de CaCl2y 1 mL/L de ampicilina 50 mg/mL. Realizar este paso en un gabinete para mantener un ambiente estéril de seguridad biológica. Calentar a 37 ° c los medios de comunicación.

3. bacteriana subcultivo

  1. Añadir 5 mL/L de la cultura de arrancador a media mínimo M9 aspirando con una punta de pipeta y 5 mL automatizada. Agitar continuamente el subcultivo a 225 rpm a 37 ° c durante 9 horas.
    Nota: Durante este paso YfeABCDE es overexpressed por autoinducción de su nativo promotor de Y. pestis .
  2. Recuperar las células por centrifugación a 4.500 x g durante 30 min a 4 ° c. Resuspender las células en 50 mL de una solución de tampón fosfato helada (20 mM Na2HPO4 de pH 7,6, 50 mM NaCl) por aspiración con una pipeta y punta de 1 mL y congelar durante la noche a-80 ° c.

4. célula fraccionamiento (día 3)

  1. Descongelar la resuspensión en las células de pellet y de 4 ° C a 4.000 x g por 20 min a 4 ° c. Resuspender las células en 50 mL de tampón salino alto helada (200 mM Tris-HCl pH 8.0, NaCl, de 400 mM y EDTA 2 mM) aspirando con una punta de pipeta y 25 mL automatizada. Incubar la suspensión sobre hielo durante 20 min., con ocasional inversión para mezclar.
  2. Sedimenten las células a 4.500 x g por 20 min a 4 ° c. Resuspender las células en 50 mL de tampón salino bajo helada (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) aspirando con una punta de pipeta y 25 mL automatizada. Incubar la suspensión sobre hielo durante 20 min., con ocasional inversión para mezclar.
  3. Los Esferoplastos a 4.500 x g por 20 min a 4 ° c de la pelotilla. Recuperar el sobrenadante que contiene el periplasma. Suspender los Esferoplastos sedimentados en la solución salina amortiguada de fosfatos (paso 3.2) aspirando con una punta de pipeta y 25 mL automatizada y lyse las células por tres ciclos de presión francesa celular prensa a 1500 psi.
    Nota: Una prensa de la célula de presión francesa puede ser incómoda de operar y utiliza una bomba hidráulica para lisis celular. Tenga cuidado cuando la bomba hidráulica, asegurando la alineación apropiada del pistón con la prensa y mantener las manos libres de la bomba hidráulica.
  4. De la pelotilla de la ruina celular a 50.000 x g por 20 min a 4 ° c. Recuperar el sobrenadante que contiene el citoplasma. Si es necesario, las membranas externas e internas pueden ser más fraccionado16.

5. proteína purificación mediante FPLC

  1. Inmediatamente después del fraccionamiento, filtrar la fracción periplasmic utilizando una unidad de membrana de 0.45 μm. Utilice un filtro de jeringa de Luer lock para mayor facilidad y filtración rápida. Equilibrar una columna de intercambio aniónico 5 mL Q usando 20 mM Tris, pH 7,6, 0.05% p/v NaN3 carga del buffer en un caudal de 5 mL/min.
  2. Carga de periplasmic filtrado en la columna de intercambio aniónico previamente equilibrado 5 mL Q usando 20 mM Tris, pH 7,6, 0.05% p/v NaN3 carga del buffer en un caudal de 2 mL/min continuar para lavar la columna de intercambio de aniones Q 5 mL con 20 mM de Tris pH 7.6 , buffer de carga de w/v NaN3 0.05% hasta conseguir una lectura instantánea de A280 es un índice de flujo de 5 mL/min.
  3. Eluir la proteína encuadernada con 20 mM de Tris pH 7,6, 0.05% w/v NaN3, 0 - 1 M de NaCl por volúmenes de columna de más de 10 gradiente lineal en un caudal de 5 mL/min combinar fracciones que contengan un máximo de280 . APO YfeA elutes entre NaCl 200 mM y 300 mM de NaCl.
  4. El efluente por concentrador centrífugo se concentran hasta que el volumen alcance ~ 5 mL.
  5. Equilibrar una columna de filtración de gel Superdex 200 pg con 20 mM Bis-Tris, pH 6.3, 50 mM NaCl, 0.05% p/v de NaN3 gel filtración almacenador intermediario en un caudal de 2,5 mL/min.
  6. Carga el anión concentrado intercambio de elución a la columna de filtración de gel Superdex 200 pg pre equilibrado y purificar mediante gel filtración búfer de paso 5.5 en un caudal de 2,5 mL/min combinar fracciones que contengan un máximo de280 correspondiente a un ~ 30 kilodalton (kDa) proteína.
    Nota: La referencia siguiente es un ejemplo de experimento FPLC para demostrar el protocolo17.

6. cristalización de proteínas

  1. Concentran el efluente de la filtración de gel concentrador centrífugo a una concentración final de proteína de 22 mg/mL.
    1. Calcular la concentración de proteína dividiendo la A280 por 1,276 mg/mL. Este coeficiente de extinción teórica fue predicha por ExPASY ProtParam18.
      Nota: Una una280 muestra lectura de 5.104 AU corresponde a una solución de 4,000 mg/mL; 5.104 AU ÷ 1,276 mg / mL = 4.00 mg / mL.
  2. Mezcla 1,5 μl de proteína con 1,5 μl de 30% w/v PEG 4000, 50 mM NaCl, 20 mM Bis-Tris pH 6.3, 0.05% p/v de NaN3 sentado gota o colgante gota configuración por aspiración con una pipeta y punta de 10 μl.
  3. Incubar gotas de cristalización en 293 K durante 2-4 semanas.
  4. Flash-freeze cristales en la piscina de nitrógeno líquido para su envío al Sincrotrón.

7. rayos x fluorescencia (usando Software de línea de GM/CA)

  1. Desplácese a la ficha de aparador de la subpartida de energía se usa para programar la energía a 10.0 keV.
  2. Vaya a la ficha de análisis vaya a la muestra de montaje de ficha interactiva .
  3. Seleccionar la señal de fluorescencia de optimizar. Entrada 4.00 s bajo la subpartida tiempo . Seleccione tomar el espectro de fluorescencia. Ver el espectro mediante ficha de parcela .

8. MAD exploración para pico de absorción de energía de Metal (usando Software de línea de GM/CA)

  1. Mover la muestra de la viga. Vaya a la ficha de análisis vaya a la ficha de tabla periódica seleccionar el borde K del elemento de interés.
    Nota: El valor de la energía en energía subpartida está en eV.
  2. Desplácese a la ficha de aparador de la subpartida energía se usa para programar la energía al valor en el paso 8.1 en keV.
  3. Pasar la muestra a la viga. Vaya a la ficha de análisis vaya a la ficha de Auto entrada 2.00 s bajo la subpartida tiempo .
  4. Seleccione Start Scan. Ver el análisis de MAD con la ficha de parcela .
    Nota: El valor de la energía en la subpartida pico está eV en lugar de keV.
  5. Seleccione hecho con fluorescencia.
  6. Mover la muestra de la viga. Desplácese a la ficha de Hutch uso la subpartida energía establecer valor en paso 8.4 energía redondeada hasta los próximos eV (es decir, pico: 9658,3 eV, establece energía en eV 9659).
  7. Pasar la muestra a la viga. Recoger el conjunto de datos. Repita el paso 8.1-8.6 para todos los metales de interés.

9. analítica protocolo para análisis de absorción de metales radiactivos

  1. En un tubo de cultivo de 14 mL, inocular 5 mL de LB con cepa de e. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL células que contienen plásmidos de pYFE316. Añadir 5 μl de ampicilina 50 mg/mL por aspiración con una pipeta y punta de 10 μl. Agite a 225 rpm a 37 ° c durante 7 h.
  2. Sedimenten las células a 15.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de mesa. Lavar las células en 1 mL de medio mínimo de suplido M9 aspirando con una punta de pipeta y 1 mL. Repetir una vez.
  3. En un tubo cónico de 50 mL, las células en 30 mL de subcultura habían suplido media mínimo M9 aspirando con una punta de pipeta y 1 mL. Agite a 225 rpm a 37 ° c durante 9 horas.
  4. Determinar la cantidad de radiactividad que se requieren para alcanzar aproximadamente 100.000 cuentas por minuto (cpm).
    Nota: Esto variará según el radioisótopo y el instrumento utilizado para la detección. Por ejemplo, una muestra que contiene 7.4 kilobecquerel (kBq) (0,2 micro-curies (μCi)) de 52Mn da una lectura de 550.000 cpm en un detector gamma automatizado (NaI). Por lo tanto, la cantidad de radioactividad es necesario para obtener un recuento de 100.000 cpm puede determinarse utilizando la siguiente ecuación: (100.000 cpm/550.000 cpm) * 7.4 kBq (μCi 0,2) = 1.35 kBq (0.036 μCi).
    PRECAUCIÓN: decaimiento radiactivo como resultado la liberación de radiación de ionización, que es peligroso. Cuando se trabaja con radioactividad siempre usar la protección adecuada y seguir los principios de como baja como razonablemente posible (ALARA) por aumento de la distancia y el blindaje reduciendo el tiempo de exposición. Sólo personal especializado debe controlar radiactividad en laboratorios especialmente designados, que se licencia para el uso de materiales radiactivos.
  5. Multiplicar la radioactividad requiere calculada en 9.4 paso por el volumen total de la subcultura, para determinar la cantidad total de radiactividad necesaria. Aumentar esta cantidad (preferiblemente en un pequeño volumen de 50-100 μL) en el tubo que contiene el subcultivo que hay 100.000 cpm/mL y agitar bien para 30 s.
    Nota: Para 31 mL de la subcultura, la cantidad total de radiactividad necesaria es 1.35 kBq (0.036 μCi) x 31 mL = 41.3 kBq (1.12 μCi).
  6. Alícuota de 1 mL de la subcultura (ahora contiene trazador radioactivo) en centrífuga de 1,5 mL individuales tubos aspirando con una punta de pipeta y 1 mL, y lugar en un Termomezcladores de 37˚C, con un vórtex en el 1 × g. incluya suficientes tubos de modo que hay tres repeticiones para cada uno deseado de medición así como tres repeticiones adicionales para usar como estándares (a un lado para establecer las normas, no realice el análisis de fraccionamiento de normas).
    Nota: Ensayo en 1, 2 y 4 h requeriría total 12 tubos.
  7. Después de la incubación, centrifugar los tubos a 15.000 × g durante 30 s utilizando una centrífuga de banco (preferiblemente enfriada a 4 ° c) y descartar el sobrenadante.
  8. Resuspenda las células en 1 mL de hielo frío, alta sal tampón (paso 4.1) aspirando con una punta de pipeta y 1 mL y colocar inmediatamente en hielo por 20 min.
  9. Sedimenten las células otra vez a 15.000 × g durante 30 s utilizando una centrífuga de banco (preferiblemente enfriada a 4 ° c) y descartar el sobrenadante.
    Nota: El sobrenadante contiene metal free lances.
  10. Resuspenda las células en frío de hielo, bajo en sal tampón (paso 4.2) aspirando con una punta de pipeta y 1 mL, incubar en hielo por 20 min.
    Nota: Es importante aspirar suavemente a través de la pipeta para este paso.
  11. Sedimenten las células en 15.000 × g durante 30 s y recoger cada uno de los sobrenadantes en nuevo de 1,5 mL tubos de centrífuga. Ahora debe haber seis tubos por el momento.
    Nota: El sobrenadante contiene la fracción periplasmic y el sedimento contiene la membranosa y citoplásmica fracción. Nos referimos a la pastilla como la fracción citoplasmática.
  12. Medir la radioactividad en cada fracción (seis tubos por el momento), así como en las normas en paso 9.6. Utilice la cantidad de radiactividad en las normas para determinar la cantidad total de radiactividad originalmente añadido a cada muestra.
  13. Para determinar el porcentaje de absorción radiactiva en el periplasma, utilice la siguiente ecuación: (cpm promedio de cpm de periplasmic fracción/promedio de normas) x 100.
  14. Para determinar el porcentaje de absorción radiactiva en el citoplasma, utilice la siguiente ecuación: (cpm promedio de cpm fracción citoplasmática/promedio de los estándares) x 100.
  15. Para determinar el % de absorción total, utilice la siguiente ecuación: ((cpm promedio de la fracción periplasmic + cpm promedio de la correspondiente fracción citoplasmática) / (promedio de cpm de los estándares)) x 100.

Resultados

Gel de SDS-PAGE y cromatogramas de filtración de gel fueron recogidos para evaluar la calidad de la purificación de la proteína del fraccionamiento preparativo periplasma. La purificación de holo que yfea ha sido previamente descrito16; sin embargo, no se ha divulgado la purificación de apo YfeA. La estrategia para purificar apo YfeA descrita por este método utiliza una construcción de tipo salvaje recombinante que contiene una etiqueta de afinidad alguna, particularmente uno que podría ser utilizado para immunoblot de proteína (es decir, su etiqueta) y un anticuerpo monoclonal que reconoce que yfea no se ha descrito. Por lo tanto, se utilizan análisis de espectrometría de masas para verificar la purificación de YfeA. Para purificar YfeA por fraccionamiento, se recomienda utilizar un gradiente lineal de elución de la cromatografía de intercambio aniónico (figura 1). El gradiente de elución lineal mejora significativamente el enriquecimiento YfeA que aproximadamente el 8% de la fracción del periplasma al 49% del producto de intercambio de anión calculado por densitometría (figura 1). Esta composición se mejora hasta un 61% por filtración en gel, y el volumen de elución de la proteína apo es idéntico al volumen de elución de la proteína de holo (figura 2). Espectrometría de masas en análisis verifica la purificación de YfeA mediante la detección de 92,5% de la secuencia de aminoácidos de YfeA, espectros de polipéptido de YfeA total 246, péptidos únicos 24 y 50 espectros de polipéptido único. Alternativamente, para contrastar el producto degradado lineal con el producto de una elución gradiente de paso, se purificó YfeA por intercambio de aniones, utilizando un paso de lavado de 50 mM NaCl seguido por un paso de elución de 250 mM de NaCl (figura 1). El gradiente de paso marginal enriquece YfeA de composición 17% de la fracción del periplasma al 18% del producto de intercambio de anión calculado por densitometría. La elución gradiente de paso también enriquece a una banda de proteínas contaminantes espectrometría identificado como que contiene múltiples SBPs de e. coli de similar peso molecular. Debido a los límites de la resolución de la pg de Superdex 200 HiLoad 26/600, similitud en los pesos moleculares y estructuras de las SBPs contaminantes, filtración de gel había mejorado marginalmente YfeA enriquecimiento a 20% del producto de filtración de gel. Si un gradiente de elución lineal es inalcanzable para el intercambio de aniones, es aconsejable explorar múltiples lavados de paso en incrementos de 25-50 mM NaCl para identificar la concentración de NaCl necesaria para eliminar estos contaminantes.

Holo y apo purificada YfeA cristalizan en las mismas condiciones de cristalización, aunque imágenes de apo y holo YfeA morfologías de cristal muestran diferencias en el crecimiento cristalino entre apo y holo YfeA Estados (figura 3). Además de verificación de la espectrometría de masas, difracción de rayos x datos (no mostrados) de cristales de proteína purificada por este método confirman la purificación y cristalización de YfeA. El grado de contaminación del compartimiento (zinc citoplásmico volviendo apo a holo proteína en la fracción del periplasma) puede ser evaluado mediante la captura de espectros de fluorescencia de rayos x (figura 4). Dado que el zinc es el principal sustrato a recombinante YfeA16, espectros de fluorescencia de rayos x pueden distinguir rápidamente entre una muestra de YfeA que contiene una señal fuerte de zinc con holo YfeA (Figura 4A), indicativo de la Cruz contaminación, o una señal débil zinc sugestiva de apo YfeA y mínima contaminación cruzada (Figura 4B). Análisis de ICP-MS de lo media mínimo M9 confirmado niveles de metales de transición están en el rango micromolar sub (no mostrado); por lo tanto, la detección de solamente mínimas cantidades de metales de transición debe esperarse tras un exitoso fraccionamiento. Fraccionamiento analítico (figura 5) puede utilizarse para medir las tasas de transporte radiometal y capturar datos funcionales. Un minuto de 60 instantáneas que comparan fracciones periplasmic y citoplásmicas de las células de e. coli expresan YfeA el transportador completo de YfeABCDE solamente y ninguno de los componentes de YfeABCDE revela las consecuencias de expresar una proteína recombinante solo o con una proteína compleja en la aceptación de metal (figura 6). Las células de e. coli no expresan ninguna proteína recombinante transportan aproximadamente la mitad de los 52Mn añadido a los medios de comunicación al citoplasma con la retención mínima en el periplasma. Este control negativo representa transporte endógeno de manganeso. E. coli las células recombinante YfeA transportan aproximadamente un cuarto de los 52Mn añadido a los medios de comunicación al citoplasma con otro cuarto en el periplasma. Retención del manganeso en el periplasma y transportes limitada en el citoplasma muestra la demanda metabólica y cuellos de botella impuestos por producir YfeA en ausencia del transportador Yfe. E. coli las células recombinantes YfeABCDE transportador transportan casi el 100% de los 52Mn añadido a los medios de comunicación al citoplasma con la retención mínima en el periplasma. Transporte de manganeso aumentada en el citoplasma ilustra la contribución del transportador Yfe en transporte de manganeso.

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Figura 1. Purificación de YfeA por fraccionamiento. A. modelo hipotético para transportador Yfe. B. gel de SDS-PAGE de YfeA purificación de la fracción del periplasma, con elución gradiente lineal del intercambio de aniones. Gel de SDS-PAGE muestra el enriquecimiento de YfeA (30 kDa) a través de pasos de purificación. Flecha negra indica la posición de migración electroforética para YfeA. Estándares de peso molecular que se muestra en la derecha. (1) fracción periplasma. (2) flujo de columna de intercambio Q anión a través. (3) Q anión cambio columna pico elución. (4) superdex 200 pg gel filtración columna pico. C. YfeA enriquecimiento – buen ejemplo. Tratamiento de la imagen del gel de SDS-PAGE de B calcula enriquecimiento general de YfeA por densitometría para aumentar de un 8% de la fracción periplasmic al 61% del producto de filtración de gel. Cajas azules indican señal YfeA total utilizada para los cálculos de densitometría. Análisis de espectrometría de masas de la banda en caja en el carril 4 detectan 259/280 YfeA aminoácidos, presentados en la selección verde. Aminoácidos en el polipéptido maduro están representados en negrita negro capitalizada, y los aminoácidos que componen el péptido señal hendida en texto gris minúsculas en cursiva. D. YfeA enriquecimiento - mal ejemplo. SDS-PAGE gel de YfeA purificación de la fracción del periplasma, con elución gradiente paso del intercambio de aniones. Gel de SDS-PAGE muestra enriquecimiento de YfeA a través de pasos de purificación. Flecha negra indica la posición de la migración electroforética de contaminante principal proteína mejorada durante la cromatografía de intercambio aniónico. Estándares de peso molecular que se muestra en la derecha. (1) superdex 200 pg gel filtración columna pico. (2) Q anión cambio columna 250 mM NaCl paso gradiente elución. (3) fracción periplasma. Tratamiento de la imagen del gel de SDS-PAGE de D calcula enriquecimiento total marginal de YfeA por densitometría hasta un máximo del 20% del producto de filtración de gel. Cajas azules indican señal YfeA total utilizada para los cálculos de densitometría. Análisis de espectrometría de masa de la de la banda por flecha negra en el carril 1 detectado 26 péptidos únicos de LivJ (39 kDa), 25 péptidos únicos de EfeO (41 kDa) y péptidos únicos 17 de LivK (39 kDa). Todos los tres contaminantes son e. coli de periplasmic SBPs. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Cromatogramas de la filtración del gel YfeA APO y holo YfeA. Flecha negra indica la posición del volumen vacío. Filtración de gel picos para apo YfeA (curva negra) y holo YfeA (curva azul) muestran tanto proteína Estados responsables en el mismo volumen de elución, indicando que apo que yfea purificado de la fracción del periplasma tiene un radio hidrodinámico similar como holo que yfea purificada de total contenido celular después de prensa francesa.

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Figura 3. YfeA APO y holo YfeA morfologías de cristal. Holo YfeA cristaliza como un cristal monolítico, mientras que la apo YfeA generalmente produce cristales maclados en las mismas condiciones de cristalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. YfeA APO y holo espectros de fluorescencia de rayos x YfeA. A. espectros de fluorescencia de rayos x de holo YfeA que ha sido purificado de media mínimo M9 con ninguna curva de suplementación, verde metal adicional de la transición. Picos característicos están etiquetados para el manganeso, hierro y zinc. B. espectros de fluorescencia de rayos x de muestra YfeA producción en el contexto de YfeBCDE. Picos característicos están etiquetados para el manganeso, hierro y zinc. Curva azul. Espectros de fluorescencia de rayos x de YfeA purificada a partir de la YfeBCDE y exitoso fraccionamiento de la fracción del periplasma con mínima contaminación de metales de transición citoplásmicos o holo YfeA proteína. Curva roja. Espectros de fluorescencia de rayos x de YfeA purificado desde el contexto de YfeBCDE con el fraccionamiento fracasada de lisis excesiva y contaminación significativa de metales de transición citoplásmicos o holo YfeA proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. Generalizado de flujo de trabajo para el fraccionamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6. datos de fraccionamiento de absorción metal radioactivo de 60 min. Cada experimento fue realizado tres veces, y barras de error indican la desviación estándar. Barra roja. Las células de e. coli que no contienen el transportador Yfe transportan aproximadamente ~ 50% de los 52Mn en el citoplasma después de 60 minutos y mantienen niveles bajos de periplasmic 52Mn. barra azul. Las células de e. coli que contienen el transporte de transportador Yfe > 90% de los 52Mn en el citoplasma después de 60 minutos y mantener niveles bajos de periplasmic 52Mn. barra verde. Células de e. coli que contienen sólo YfeA transportan aproximadamente ~ 25% de los 52Mn en el citoplasma y conservan ~ 25% de los 52Mn en el periplasma después de 60 minutos.

Radiometal utilizado en este trabajo, 52Mn (t1/2 = d 5,59), fue producido en las instalaciones del ciclotrón de UAB (Birmingham, AL) por el bombardeo de protones en un destino natural de Cr y purificado como previamente divulgados19. PRECAUCIÓN: 52Mn es un emisor de positrones (β+avg = 242 keV, 29.4%) y también emite varios rayos gamma de alta energía con alta intensidad (Eγ = 744.2, 935.5, 1434.0 keV; I = 90,0% 94,5%, 100%). Por estas razones, el experimento debe realizarse siguiendo los principios de protección de radiación de ALARA, como se describe anteriormente. Todos los elementos designados como residuos radiactivos deben adecuadamente contenidos, claramente etiquetados y desechados según procedimientos establecidos.

Discusión

Fraccionamiento celular es una herramienta útil para sondear específicamente el contenido de un compartimento celular y puede servir como una herramienta útil para la extracción de pequeñas moléculas como los átomos del metal, así como macromoléculas como las proteínas. Cabe destacar que fraccionamiento celular no es una técnica absoluta y puede ser propenso sin cuidado de mezcla/resuspensión, temperatura de incubación y tiempo de incubación. Mezcla incompleta puede ocasionar lisis membranosa mínimo y así insignificante fraccionamiento, fraccionamiento a temperatura ambiente puede causar lisis rápida de ambas membranas dando por resultado la contaminación de la fracción de periplasmic con contenido citoplasmático, y tiempos de incubación prolongado también pueden resultar en excesiva lisis y por lo tanto la contaminación de la fracción. Un compromiso razonable para lograr la lisis de la membrana externa eficiente y relativamente completo (conservando la membrana interna) es la incubación de 20 minutos sobre hielo en el tampón hipotónico fraccionamiento. Otra consideración es el método de extracción, donde áspera extracción por agitación o vórtex podría poner en peligro la calidad del extracto como causando la agregación de la proteína. Se recomienda mezclar suavemente como espátula, inversión o aspirando con la pipeta para mantener material de alta calidad para el análisis de aguas abajo. Purificación del fraccionamiento preparativo de la célula puede ocurrir con eficacia variable según lo evidenciado por figura 1. En un experimento, YfeA comenzó como el 8% del contenido extraído de periplasmic (figura 1), mientras que en otro experimento, YfeA comenzó como 17% del contenido periplasmic (figura 1). Estas diferencias pueden surgir de varias razones tales como las condiciones de expresión variable (adición de EDTA a los medios de crecimiento puede aumentar la expresión de genes regulados por mecanismos de inanición tales como la regulación de la piel del promotor Yfe), uso repetido de congelados acciones permanentes y error humano. En lugar de ajustar los tiempos de incubación, se recomienda intensificar la preparación. Purificación de la fracción del periplasma se recomienda incluir una elución gradiente lineal del paso cromatográfico intercambio del anión. Una elución gradiente de paso es una estrategia de elución los usos discretos y abruptos cambios en la composición de la fase móvil (es decir., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, etcetera.). Una elución gradiente lineal es una estrategia de elución que utiliza un cambio gradual en el móvil fase composición (es decir, 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, etcetera). Un gradiente de paso es útil para separar moléculas que tienen afinidades diferentes por la fase estacionaria y una elución gradiente lineal es útil para separar moléculas que tienen afinidades similares para la fase estacionaria. En el caso de purificación de proteína con ninguna etiqueta de purificación artificial (para mejorar la afinidad por la fase estacionaria) de un compartimiento celular que es rica en especies de proteína única, se recomienda una elución gradiente lineal para separar proteínas de donaciones que pueden tienen afinidades similares a la fase estacionaria como la proteína de interés. Generalmente, se espera un rendimiento de 1-2 mg de apo purificada YfeA de cada litro de la cultura expresando YfeA de su endógeno promotor de Y. pestis .

Fluorescencia de rayos x es una técnica que permite al investigador determinar el contenido de metal en una muestra, y rápidamente informar al investigador sobre inesperada incorporación metal que sería desconocido. Aunque EDTA está incluido en el búfer de fraccionamiento hipertónica para quitar el metal libre o libremente asociados, YfeA derivado de la fracción del periplasma puede contener algunas proteínas del holo. Dado que el transporte de metales es un proceso dinámico, tal vez el contenido de proteína de holo origina YfeA que todavía no ha donado su carga a YfeBCDE. Cabe destacar que fluorescencia de rayos x sólo mide el contenido total de metal y no indica si metal es ordenado en un enrejado cristalino, o específicamente unido a una proteína. Para determinar si el metal es ordenó en un enrejado cristalino o destinado específicamente a una molécula de proteína, procesamiento y recopilación de datos de dispersión de rayos x se requiere. Sin embargo, fluorescencia de rayos x permite la evaluación rápida de la muestra de contaminación de metal y/o integración de proteína residual del holo. Tiempo de Radiación Sincrotrón es limitado y no siempre hay tiempo para diseñar una estrategia de recogida de datos de dispersión de rayos x sobre todas las muestras, así la fluorescencia de la radiografía es una técnica valiosa para la investigación de muchos cristales y prioridades para que las muestras de rayos x deben recogerse datos de dispersión. Además, fluorescencia de rayos x permite la recolección de las muestras que no pueden difractar radiografías. Mientras recolectaba datos de fluorescencia de rayos x, a veces la señal puede ser muy débil y los espectros resultantes uninformative. Para mejorar la fuerza de la señal de fluorescencia de rayos x o análisis de MAD, considere aumentar el tiempo de exposición o disminución de la atenuación del haz de rayos x. Cuando se identifica una muestra para la recolección de datos de dispersión de rayos x, se recomienda recoger datos de dispersión de rayos x en una parte diferente de la muestra que lo que se utilizaba para fluorescencia de rayos x y análisis para minimizar el daño de la radiación, mejorar la calidad de los datos de MAD colección y reducir al mínimo cualquier posibilidad para la reducción de la señal anómala.

Detección de trazadores radiactivos requiere nanomolar cantidades de material o menos, y el uso de estos marcadores como agentes de rastreo molecular proporciona un método simple y altamente sensible de sondar los procesos celulares. El ensayo de radiometal mencionado anteriormente puede ser usado para determinar absorción de metal total, distribución en compartimentos celulares, así como las tasas de absorción. De hecho, cada momento de datos requiere un fraccionamiento de 40 minutos; sin embargo, como se alcanza cada punto del tiempo, las células son inmediatamente peleteadas e incubadas en tampón salino alto (figura 5paso 1). RadioMetal mediciones de los medios, desechado tampón salino alto (figura 5paso 1) y fracciones citoplasmáticas y periplasmic después (figura 5paso 3) indican que la incubación de tampón salino alto elimina con éxito los metal libre restante de lances que quedaron después de la centrifugación inicial después de alcanzar el punto del tiempo. La centrifugación inicial elimina la mayoría (hasta un 80%) del metal free lances y la centrifugación después de incubación en el buffer sal alta también elimina metal free lances restantes adicional. No se espera que cualquier metal libre lances persistente significativamente influencia metal transporte durante el fraccionamiento de 40 minutos. La influencia del fraccionamiento de 40 minutos en transporte intracelular del metal es otra consideración para la interpretación de datos prudentes. Prácticamente el protocolo de fraccionamiento todo ocurre sobre hielo, aparte de la centrifugación 30 segundo entre pasos. Tiempo de transporte experimentos de curso han indicado que mantienen las células a 4 ° C abroga transporte metal20,21,22; de metal por lo tanto, porque los experimentos se produce sobre el hielo, el fraccionamiento de 40 minutos no se espera que aumente significativamente los niveles de metal en el periplasma de citoplasma y se espera que los niveles de metal ser representante de los puntos de tiempo en el que las células eran inicialmente centrifugalized.

Determinación de la absorción relativa en diferentes compartimentos celulares puede ayudar a informar datos XFS, corroborar la naturaleza fisiológica de un substrato como habilitar al investigador a investigar aún más los detalles moleculares de un mecanismo. Por ejemplo, además de genética mutagénesis a experimentos de absorción de radiometal proporciona un método directo para reforzar residuos funcionales claves o moléculas involucradas en transporte de substrato. Ventajas de análisis y experimentos de absorción de radiometal incluyen respuesta rápida, alto rendimiento, alta reproducibilidad y paralelización de experimentos comparando las condiciones de crecimiento y construcciones genéticas.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

También se recogieron datos en GM/CA@APS, que ha sido financiado en su totalidad o en parte con fondos federales del Instituto Nacional del cáncer (ACB-12002) y el Instituto Nacional de Ciencias de Medicina General (AGM-12006). Esta investigación utilizó los recursos de la fuente avanzada del fotón (APS), un departamento de energía de Estados Unidos (DOE) de ciencia usuario oficina funcionó para la oficina DOE de ciencia por el Laboratorio Nacional Argonne bajo contrato no. DE-AC02-06CH11357. Uso de la fuente avanzada de fotones fue apoyado por el Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia, oficina de energía ciencias básicas, bajo contrato no. W-31-109-Eng-38.

Nos gustaría reconocer la UAB Comprehensive Cancer Center - masa espectrometría/proteómica comparte instalaciones (P30CA13148-38) por su ayuda en el análisis de espectrometría de masas.

C.D.R. fue apoyado por una beca de la Universidad de Alabama en Birmingham oficina de diversidad, equidad e inclusión. L.L.R. fue apoyado por el Departamento de Radiología de la Universidad de Alabama en Birmingham. El Departamento de energía, oficina de ciencia, isótopo programa admite 52producción Mn y A.V.F.M. en grant DESC0015773.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
químicos
Polietilenglicol 4000, EMD MilliporeFisherM1097270100
Sal sódica de ampicilina (polvo cristalino)FisherBP1760-5
AMRESCO M9 Caldo MedioFisherNC9688886
Bis-Tris, Fisher BioReactivosFisherBP301-100
Cloruro de calcio dihidratado (ACS certificado)FisherC79-500
Dextrosa (D-glucosa) anhidra (polvo granular/ACS certificado)FisherD16-500
ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada (cristalino/ACS certificado)FisherS311-100
Bioreactivos Fisher Medios de microbiología: caldo LB, MillerFisherBP1426-500
Sulfato de magnesio heptahidratado (cristalino/certificado ACS)FisherM63-500
Azida de sodio, polvo blancoFisherBP922I-500
Cloruro de sodio (cristalino/certificado ACS)FisherS271-500
Fosfato de sodio dibásico anhidro (granular o en polvo/certificado ACS)FisherS374-500
Clorhidrato de Tris (Pequeñas Escamas Blancas/Biología Molecular)FisherBP153-500
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
<>fuerte>EquipoPlaca Cryschem
HamptonHR3-158
Unidades de filtro centrífugo EMD Millipore Amicon Ultra-15FisherUFC903024
Filtros de jeringa estériles EMD Millipore Millex: Membrana de PVFD DuraporeFisherSLHV013SL
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pgFisher28-9893-36
GE Healthcare HiTrap IEX HP Columnas preempaquetadasFisher17-1154-01
NombreCompañíaNúmero de catálogoComentarios
Cells
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLSFisher230280

Referencias

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