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Formación de covalente ADN aductos carcinógenos activados enzimáticamente y fármacos In Vitro y su determinación por 32P-postlabeling

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DOI:

10.3791/57177

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20 de marzo de 2018

1Department of Biochemistry, Charles University

En este artículo

Resumen

Evaluación de la potencia de los productos químicos ambientales y las drogas, ser enzimáticamente bioactivación intermedios generando covalente DNA aducciones, es un campo importante en el desarrollo de cáncer y su tratamiento. Se describen los métodos para la activación de compuestos para formar que aductos de ADN, así como técnicas para su detección y cuantificación.

Resumen

Aductores de ADN covalente formado por sustancias químicas o fármacos con potencia carcinógena se juzgan como uno de los factores más importantes en la fase de iniciación de los procesos cancerígenos. Esta unión covalente, que se considera la causa de la tumorigénesis, ahora se evalúa como un dogma central de la carcinogénesis química. Aquí se describen los métodos que emplean las reacciones catalizadas por el citocromo P450 y las enzimas de biotransformación adicionales para investigar la potencia de productos químicos o drogas para su activación a metabolitos formando estos ADN aductos. Se presentan los procedimientos que describe el aislamiento de fracciones celulares que poseen enzimas de biotransformación (microsomales y citosólicas muestras con citocromos P450 u otras enzimas de biotransformación, es decir, peroxidasas, NADPH: citocromo P450 oxidorreductasa H:quinone oxidorreductasa de NAD (P) y xantina oxidasa). Además, se describen métodos que puede utilizar para la activación metabólica de las sustancias químicas analizadas por estas enzimas, así como aquellos para el aislamiento de ADN. Además, los correspondientes métodos capaces de detectar y cuantificar ADN químicos/drogas-derivados de aductores, es decir, diferentes modificaciones de la técnica de P-postlabeling de 32y empleo de marcado radiactivo analizado productos químicos, son muestra en detalle.

Introducción

El metabolismo de xenobióticos (ambientales productos químicos o drogas) se produce en dos fases1. Fases I y II pretenden representar los compuestos originalmente hidrófobos (no soluble en agua) más hidrofílico (soluble en agua), por lo tanto haciéndolos fácilmente excretable por la orina, heces o sudor. Fase I (funcionalización) reacciones incluyen la oxidación, reducción, y la hidroxilación catalizada por enzimas como la citocromo P450s (P450s, APP), peroxidasas (es decir., ciclooxigenasa, COX), aldo-ceto reductasas (AKRs) y microsomal monooxigenasas que contienen flavina (consistente). Fase I también incluye reacciones de reducción, mediadas por una variedad de reductasas , microsomal NADPH: citocromo P450 reductasa (POR) y citosólica oxidorreductasa H:quinone de NAD (P) (NQO1), xantina oxidasa (XO) y aldehído oxidasa (AO)1 . En la segunda fase (verbal), los grupos funcionales que se adjunta en fase se solía conjugar las moléculas polares pequeñas para aumentar más la polaridad. Ejemplos de enzimas consideradas para participar en la reacción de fase II incluyen Sulfotransferasas (resultados), N, O- acetiltransferasas (NATs), metiltransferasas como catecol -O- metiltransferasa (COMT), glutatión S- Transferasas (GSTs) y uridina difosfato glucuronosyltransferases (UGTs)1. La clasificación de las enzimas de fase I o II es, sin embargo, no rígidos, y algunas enzimas pueden agruparse sin duda en cualquier categoría.

Las enzimas P450 (EC 1.14.14.1) son la hemo que contiene las proteínas presentes en distintos organismos, que participan en la biotransformación de muchos productos químicos, catalizando su conversión3,4. Las enzimas P450 catalizan la hidroxilación de muchos sustratos, con una reacción donde un átomo de dioxígeno se introduce en la molécula de xenobióticos, mientras que el segundo átomo de oxígeno se reduce para formar agua por la reacción que requiere dos electrones [la ecuación (1 de3,)]4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

Las enzimas P450 localizadas en la membrana del retículo endoplásmico de células de mamífero (sistemas de P450 microsomales) son miembros del sistema monooxigenasa multienzimáticos, que contiene más NADPH: citocromo P450 reductasa (POR) y citocromo b5 , el sustrato de la enzima denominada como NADH: citocromo b5 reductasa. Una teoría generalmente aceptada presume que el donante de los dos electrones necesarios para P450 es el sistema de la NADPH/POR. Sin embargo, citocromo b5 puede también actuar como donante de electrones de P450, es decir, como un donante del electrón reducción P450 durante la segunda reducción de su ciclo de reacción, donde actúa junto con NADH: citocromo b5 reductasa2,3,4.

Mamíferos utilizan varias enzimas P450 (por ejemplo, las enzimas de las familias 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 y 27) para la síntesis de valiosos compuestos endógenos, tales como esteroides y usarlos para el catabolismo de los productos naturales2,3 . Las otras enzimas de la mamíferas CYP, como humano CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 y 3A4, metabolizan sustancias químicas exógenas que se utilizan como drogas. 5 , 6 las más importantes enzimas catalizan el metabolismo de fármacos son App de la subfamilia 3A, especialmente CYP3A4. Las conversiones de los xenobióticos, como pro-carcinógenos y pro-sustancias tóxicas, son mediadas por humanos CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 y 3A42,5. La mayoría de estas App está presente en el hígado (excepto CYP1A1 y 1B1). Sin embargo, la APP se expresa también en varios órganos extrahepáticos. Tal P450s podría ser de gran importancia, principalmente cuando ellos participar en el metabolismo de la bioactivación de sustancias químicas (fármacos) intermedios reactivos en estos órganos7. Varios P450s son inducidas por varios compuestos que son sus sustratos, aunque esto no es necesariamente el caso.

Muchas enzimas P450 desempeñan un papel en la toxicidad de productos químicos (drogas). Pueden convertir los xenobióticos no sólo en sus metabolitos de desintoxicación, pero también activarlas a especies reactivas, que modificar macromoléculas endógenas que además exhiben diferentes propiedades biológicas, generalmente causando su toxicidad. ADN, lípidos y proteínas pueden ser los objetivos para su modificación por reactivos electrophiles y radicales generados a partir de productos químicos activados. En el caso de ADN, resolver varios genes importantes respuestas y sus mecanismos ya conocen a2,3,4,5.

Los cambios en el ADN pueden resultar en una disminución en el control del crecimiento celular, y este fenómeno es considerado como el factor predominante que lleva al desarrollo de procesos cancerígenos. La generación de covalente DNA aducciones con productos químicos que potencia carcinógena es juzgado como uno de los pasos más importantes en la fase de iniciación de cancerígenos procesos8,9,10,11. Se demostró que las relaciones entre la formación de ADN aductos y tumorogénesis ocurre, mientras que una disminución en la cantidad de ADN aductos es responsable de quimioprevención8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. la formación de carcinógeno/drogas-derivados de aductos de DNA depende de las bases individuales del ADN y es afectado por las secuencias de estas bases en el ADN. Aductores de las reparaciones de ADN depende de su ubicación (en el filamento de la DNA transcrito o no transcrito) y tipos de nucleótido modificado secuencias8,11,12,15, 16.

En este artículo, describen los procedimientos utilizando la conversión catalizada por la enzima de sustancias químicas (fármacos) para investigar su potencia para ser activado en metabolitos que modificado ADN (generar ADN aductos). Unión covalente del ADN, la sustancia de ensayo debe ser generalmente activado por reacciones oxidantes o reductoras, dependiendo de los fármacos individuales. Activación oxidativa o reductiva de químicos probados es mediado por un sistema enzimático dependiente de P450 presente en la fracción microsomal subcelular o por reducción con reductasas presentes tanto en microsomas (POR, NADH: citocromo b5 reductasa, enzimas P450) y en fracciones celulares citosólicas subcelulares (NQO1 XO, AO, peroxidasa). Metabolitos reactivos después de eso se unen al ADN formando ADN aductos. Porque las reacciones oxidativas y reductivas son importantes para activar varias drogas para estas especies reactivas, se describen los procedimientos experimentales empleando el sistema enzimático de oxidación/reducción. Además, los correspondientes métodos capaces de detectar y cuantificar estos ADN aductos se describen en detalle.

Dos procedimientos independientes para determinar si la sustancia activa sistemas enzimáticos, se enlaza al ADN se recomiendan: la técnica de P-postlabeling de 32y utilizando compuestos radiactivos marcados (por ej., 3H o 14 C). Para el primer piloto, investigación el ensayo P-postlabeling de 32se recomienda. La determinación del contenido de ADN en soluciones, evaluadas con precisión, debe preceder a ambos métodos.

32postlabeling P técnica utiliza la hidrólisis enzimática del ADN modificado por productos químicos no radiactivo (cancerígeno drogas) para 3´-phosphodeoxynucleosides, fosforilación adicional con fósforo radioactivo (32P) en el 5´- OH posición y la separación de Deoxinucleótidos químicos aductos de Deoxynucleótidos por (no modificados) normal por cromatografía17 (figura 1). Modificados por el compuesto químico del ADN es hidrolizado por una mezcla de endonucleasa, nucleasa micrococcal y exonucleasa, conocida como la fosfodiesterasa del bazo. La mezcla de ADN hidrolizado que contiene ambos normal (sin modificar) y modificado desoxinucleósidos 3´-Unión es reaccionado con ATP [γ -32P] en presencia del portador (no radiactivo) ATP y T4 Polinucleótido cinasa de la a pH 9,5 a forma 5´- 323´ marcado con P, 5´-bifosfonatos (procedimiento "estándar" en la figura 1). El pH alcalino utilizado es capaz de reducir al mínimo la actividad enzimática de la cinasa T4 Polinucleótido al dephosphorylate desoxinucleósidos 3´-Unión en posición 3´. Separación y resolución de 32P etiquetados aductos de Deoxynucleótidos etiquetados por que no es modificado por los productos químicos se lleva a cabo por cromatografía en capa fina (TLC) intercambio multidireccional polietilamina (PEI) celulosa (figura 2 ). En los pasos de la primera y segunda elución (en dirección a D1 y D2), se eluyen Deoxynucleótidos por (no modificados) normal etiquetados como fosfato [32P] desde el inicio de la placa de TLC-PEI-celulosa utilizando soluciones de electrólitos en un pedazo corto de papel cromatográfico aplicado en la parte superior de la placa del TLC, mientras que el Deoxynucleótidos por que contienen químicos enlazados exhibiendo propiedades hidrofóbicas (carcinógeno/drogas-aductores) se mantienen en el inicio de la placa de celulosa PEI resolverse además con varios diversos sistemas solventes en D3 y D4 (figura 2). Localización de aductos se realiza mediante autorradiografía de pantalla mejorado; aductores de los separados son detectados como manchas oscuras reconocibles en las radiografías. Las áreas de puntos son suprimidas de la placa y utilizadas para cuantificar la radioactividad por centelleo líquido o conteo Cerenkov. Un fósforo de almacenamiento de información de método que se ha adaptado y cuantificar ADN aductos en cromatogramas detectados por 32ensayo P-postlabeling ahora también se utiliza. 18 máquina el Imager instantánea se utiliza con frecuencia para tal detección y cuantificación de ADN aductos. Este método proporciona más de 10 - veces mayor sensibilidad para detectar 32P que la técnica de pantalla había mejorado autorradiografía19.

Cantidades de ADN aductos son determinadas como valores de relativa aducción etiquetado (RAL), calculado utilizando la ecuación (2) como sigue:

CPM. en aducción Deoxynucleótidos por
RAL =---(2)
actividad específica de 32P-ATP (en cpm / pmol) Deoxynucleótidos por x pmol

Los valores de RALs son el cociente de tasas de conteo de Deoxynucleótidos aducidos por sobre las tasas de recuento del total [aducidos y normal (no modificados) Deoxynucleótidos por] Deoxynucleótidos por20,21. Sin embargo, este cálculo se basa en igual etiquetado eficiencias de aductos y normal Deoxynucleótidos por22. El procedimiento clásico ("estándar") de los 32P-postlabeling técnica es apropiado para varios ADN aductos (voluminosos y no voluminosos aductos), sin embargo, su sensibilidad no es satisfactoria detectar aductos encontradas bajas cantidades en el ADN. Mediante este procedimiento, la cantidad de un aducto en 10 Deoxynucleótidos por7 sin modificaciones en el ADN (0,3 fmol aducto/μg de DNA) es detectable.

Una variedad de modificaciones de este clásico 32procedimiento P-postlabeling se han utilizado para elevar la sensibilidad de la técnica. Hasta 10 a 100 veces mayor sensibilidad de la determinación de aductos por 32P de etiquetado se ha logrado utilizando limitando los niveles de ATP [γ -32P] (el procedimiento de intensificación). 23 , 24 otro procedimiento proporcionando que un aumento en la sensibilidad del método de P-postlabeling de 32utiliza una incubación de digeridos ADN conteniendo aductos con nucleasa P1 (de Penicillium citrinum)21 (figura 1). Esta enzima prefiere al dephosphorylate desoxinucleósidos sin modificar 3´-Unión, mientras que el Deoxynucleótidos por químicos enlazados (aducidos nucleótidos) son esencialmente no los sustratos de esta enzima. Por lo tanto, desfosforilatado desoxinucleósidos 3´-Unión (es decir, Desoxirribonucleosidos) no es fosforiladas por la cinasa T4 Polinucleótido de fosfato [32P] de γ -32P] ATP. Sin embargo, algunos de los nucleótidos que son productos químicos límite (Deoxynucleótidos aducidos por), como aductos arilamina sustituido en C8 de desoxiguanosina, puede bedephosphorylated por esta enzima. En contraste, la mayoría otros aductos (p. ej., aductos sustituido en N2 de desoxiguanosina) no son defosforilaciones por nucleasa P1. Esta modificación de 32postlabeling P hace este método mucho más sensible, aumentando su sensibilidad por más de tres órdenes de magnitud. Además, esta versión de 32P-postlabeling ofrece un método donde mayores cantidades de ADN (5-10 μg) y un exceso de portador-libre [γ - 32P] ATP puede utilizarse.

Otro método para enriquecer los aductos, descrito por Gupta25, utiliza el fisicoquímicas propiedades de Deoxinucleótidos voluminosos aductores, que pueden extraerse en n-butanol en presencia de un Tetrabutilamonio de agente de transferencia de fase cloruro (TBA) (figura 1) antes de [32P] etiquetado de fosfato, mientras que sin modificar Deoxynucleótidos por mal son extraídos por este solvente orgánico. Sin embargo, aductos menos hidrofóbicos, que consiste en por ejemplo de Deoxynucleótidos por modificado con grupos voluminosos no aromáticos o alkyl pequeños residuos, no son efectivamente extraído con n-butanol. Por lo tanto, son esencialmente indetectables cuando son analizadas por esta modificación de 32método P-postlabeling.

Las anteriores versiones de 32postlabeling P aumento de la sensibilidad y la cuantificación de ADN aductos enormemente (hasta tres órdenes de magnitud), siendo capaz de detectar una aducción por9,1010 normal nucleótidos (0.3 - 3 amol/μg de DNA). Estos dos métodos se recomiendan para las pruebas de los productos químicos para su eficacia que se unen covalentemente al ADN y, por lo tanto, se describen en este trabajo en los detalles.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las normas para el cuidado y uso de animales de laboratorio (311/1997, Ministerio de agricultura, República Checa), que está en conformidad con la declaración de Helsinki.

1. aislamiento de fracciones Microsomal y citosólicas hepáticas

  1. Preparar el hígado fracciones subcelulares (microsomas ricos en enzimas P450 o cytosols ricos en reductasas o peroxidasas solubles) de ratas por simple centrifugación diferencial (105.000 x g).
    Nota: El pellet y sobrenadante se toman como microsomas y cytosols, respectivamente.
    1. Lavar las muestras de hígado (1-10 g) dos veces con tampón 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, que contiene 150 mM buffer KCl (buffer 1) (volúmenes mayores de 10 veces que el peso del tejido, es decir, 10-100 mL) y cortar el tejido en trozos pequeños (de tamaño 2 x 2 mm).
    2. Homogeneizar los tejidos en presencia de este buffer (> 3 mL/g de peso/volumen) en homogeneizador a 4 ° C por 5 min y descarte las piezas no homogeneizada residual del tejido por filtración utilizando papel de filtro. Centrifugar el homogeneizado a 600 x g por 10 min a 4 ° C y transferir el sobrenadante a otro tubo de centrifugación.
    3. Volver a homogeneizar el pellet en buffer 1 (1 mL por cada 1 g de tejido), repita el paso 1.1.3. y descartar el precipitado. Centrifugue los sobrenadantes a 15.000 x g por 20 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a otro tubo de centrifugación.
    4. Centrifugar el sobrenadante a 105.000 x g durante 60 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante (citosol) y almacenar en alícuotas (1-10 mL) a-80 ° C. Caracterizar el citosol por la cantidad de proteína utilizando el método descrito por Bradford26.
    5. Resuspenda el precipitado en tampón de fosfato de sodio de 100 mM, pH 7.4 (> 2 mL/g de peso/volumen), centrifugar a 105.000 x g durante 60 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Volver a homogeneizar el sedimento (microsomas) en tampón 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, que contiene 150 mM KCl y 20% de glicerol (< 5 peso volumen mL/g) en homogeneizador a 4 ° C. Almacenar los microsomas en alícuotas de 1 mL 0,5 - a-80 ° C. Se caracteriza por los microsomas del contenido de proteínas utilizando el método descrito por Bradford26.
    6. Determinar la concentración de citocromo P450 en los microsomas.
      Nota: La concentración de enzimas P450 en los microsomas se mide según lo descrito por Omura y Sato27, determinación de la absorción del complejo P450 reducción con monóxido de carbono (CO). Monóxido de carbono es un compuesto tóxico y debe ser manejado con cuidado y en una campana.

2. incubaciones de Test químicos (cancerígenos, drogas) con ADN en presencia de sistemas enzimáticos

  1. Incubación de la prueba de productos químicos (cancerígenos, drogas) con el ADN en presencia de sistemas enzimáticos oxidativos que contiene citocromos P450
    1. Preparar mezclas de incubación que contenga, en un volumen final de 0,75 mL a 4 ° C, los siguientes compuestos y sistemas enzimáticos.
      1. Mezcla de 100 mM de tampón fosfato, pH 7,4, (0,375 mL) con sistema de generación de NADPH (10 mM MgCl2, 10 mM D-glucosa 6-fosfato, 10 mM NADP+, 1 U/mL D-glucosa 6-fosfato deshidrogenasa) o 10 mM NADPH (75 μL).
      2. Agregar en los microsomas de esta mezcla o puro recombinante P450 en Supersomes, que son los microsomas aislados de células de los insectos transfected con una construcción de baculovirus que contiene el cDNA de recombinante P450 enzimas, 50 pmol P450 enzimas en 50 μl microsomal o supersomal preparaciones - fracciones microsomales hepáticas aisladas en el laboratorio o de una fuente comercial.
      3. Añadir DNA de timo de becerro 1 mg (0,3 mL de solución stock - 3,3 mg/mL en agua destilada) y agitar en un agitador vortex durante 5 s.
      4. Por último, agregar 7.5 drogas de ellipticine de prueba μl 0,1 mM disuelto en DMSO y 42,5 μL agua destilación para alcanzar un volumen de la mezcla de incubación de 0,75 mL. Utiliza los productos químicos marcados con 3H o 14C o químicos sin etiquetar, dependiendo del procedimiento para la detección de ADN aductos.
      5. Agitar en un agitador vortex durante 5 s. Incubar en abierto tubos a 37 ° C durante 30-60 minutos.
      6. También prepara dos incubaciones de control similar, pero (i) sin un sistema de activación (microsomales muestras) o (ii) con él, pero sin la sustancia de ensayo.
  2. Incubaciones de prueba de productos químicos (cancerígenos, drogas) con el ADN en presencia reductoras sistemas enzimáticos
    1. Preparar mezclas de incubación que contenga, en un volumen final de 0,75 mL a 4 ° C, los siguientes compuestos y sistemas enzimáticos.
      1. De la mezcla a 4 ° C, 100 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, que contiene 0.2% Tween 20, (0,375 mL), solución 10 mM de cofactor de la enzima reductora NQO1 (NADPH) (75 μL), fracción citosólica (fracciones citosólicas hepáticas - aislados en el laboratorio o en caso de utilizar las citosólicas fracciones aisladas de donantes humanos individuales que se obtuvieron de la fuente comercial que contenga 1 mg de proteína (50 μL)).
      2. Añadir DNA de timo de becerro 1 mg (0,2 mL de solución stock - 3,3 mg/mL de agua destilada) y agitar en un agitador durante 5 s.
      3. Por último, añadir 7,5 μl 0,1 mM de sustancia (disuelto en agua destilada y metanol, etanol, DMSO, dependiendo de la solubilidad del compuesto) y 42.5 μL agua destilada agua para alcanzar un volumen de 0,75 mL de la mezcla de incubación. Etiquetado de productos químicos de uso con 3H o 14C o químicos sin etiquetar, dependiendo del procedimiento para la detección de ADN aductos (véase abajo).
      4. Purgar la mezcla de reacción con argón durante 1 minuto agitar en un agitador durante 5 s. Incubar en tubos cerrados a 37 ° C durante 30-60 minutos.
      5. También prepara dos incubaciones de control similar, pero (i) sin un sistema de activación (fracciones citosólicas) o (ii) con él, pero sin productos químicos de la prueba.
  3. Extracción de mezclas de incubación con disolventes orgánicos para eliminar el exceso de sustancias de ensayo
    1. Mezclar la mezcla de incubación en un tubo de ensayo con una tapa con el mismo volumen de acetato de etilo (éter dietílico o hexano) mediante la adición de estos solventes. Agite el contenido del tubo en una coctelera hasta la forma de una emulsión.
    2. Spin (3 min) 1.600 x g en una centrífuga a temperatura ambiente. Si las fases orgánicas y acuosas no son separados adecuadamente, una vez más por un largo período o a una centrifugación mayor velocidad de centrifugado.
    3. Eliminar la fase orgánica superior, recoger con una pipeta. Si pequeños volúmenes (< 400 μL) son utilizados, utilizar una pipeta automática equipada con una punta adecuada. Dejado de lado esta fase orgánica.
    4. Repita los pasos 2.3.1., 2.3.2. y 2.3.3. Eliminar solventes orgánicos residuales por una corriente de gas nitrógeno (se necesitan al menos 5-10 min de extracción).
  4. Aislamiento de ADN de incubaciones
    1. Extracción de ADN de soluciones con fenol/cloroformo y su precipitación con etanol
      1. Eliminar proteínas para aislar ADN de mezclas de incubación mediante la extracción de proteínas de soluciones de ADN con fenol, fenol/cloroformo (1:1) y cloroformo, por el procedimiento que se muestra a continuación.
      2. Combinar la mezcla de incubación con la misma cantidad de fenol o fenol/cloroformo (1:1) en un Falcon o tubo Eppendorf con tapa. Revolver la mezcla hasta la forma de una emulsión.
      3. Spin (3 min) 1.600 x g en una centrífuga a temperatura ambiente. Si no se separan correctamente las fases orgánicas y acuosas, girar una vez más durante un período prolongado o a mayor velocidad de centrifugación.
      4. Transferir la fase superior de agua con una pipeta a un nuevo tubo de polipropileno. Si pequeños volúmenes (< 400 μL) son utilizados, utilizar una pipeta automática equipada con una punta adecuada. Eliminar la interfaz de proteína junto con la fase orgánica.
      5. Combinar la fase de agua superior con la misma cantidad de una mezcla de fenol y cloroformo (1:1). Reproducir pasos 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. Combinar la fase de agua superior con la misma cantidad de cloroformo y repita los pasos 2.4.1.2. -2.4.1.4. El ADN se recuperan por precipitación con 2 volúmenes de etanol frío (-20 ° C). Determinar el volumen de la solución de ADN.
      7. Adaptar la concentración de cationes monovalentes por adición de cloruro de sodio de 5 M para el final las concentraciones de 0,1 M. agitar vigorosamente. Combinar con 2 volúmenes de etanol frío (-20 ° C) y mezclar bien. Frío a-20° C.
      8. Almacenar a-20 ° C hasta que se precipita el ADN. Cuando el ADN está fragmentado durante las incubaciones (e.g., por la formación de radicales de oxígeno durante la reacción de activación enzimática) o durante el procedimiento de aislamiento para el tamaño del ADN que es pequeño (< 1 kb) o cuando el ADN está presente en pequeñas cantidades (< 0.1 mg / mL), el tiempo de enfriamiento tiene que ser aumentada y disminución de la temperatura a-70 ° C.
      9. Spin (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C en una centrifugadora. Si el ADN está presente en concentraciones bajas o en forma de pequeños fragmentos, girar una vez más durante un período prolongado (30 min). Deseche el sobrenadante.
      10. Para quitar cualquier solutos (o residuos de la sustancia de ensayo) que podría estar presente en el ADN precipitado, lavar el ADN con etanol al 70% y éter dietílico. Lavado de precipitados ADN con frío (-20 ° C) etanol al 70%. Spin (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C en una centrifugadora. Deseche el sobrenadante.
      11. Repita el paso 2.4.1.10. Lavado de precipitados ADN con frío (-20 ° C) etanol al 70%. Spin (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C en una centrifugadora. Deseche el sobrenadante.
      12. Repita el paso 2.4.1.10. Poner el tubo en forma vertical sobre un papel absorbente para eliminar el sobrenadante residual. Lavar el pellet de DNA mediante la adición de 1 mL de éter dietílico para desechar los residuos potenciales de la prueba química del ADN aislado. Spin (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C en una centrifugadora. Deseche el sobrenadante.
      13. Disolver el precipitado de DNA en el volumen adecuado (generalmente en 100-400 μL para alcanzar una concentración de ADN de 0.5 - 1 μg/μl) de agua destilada (o en cloruro de sodio citrato de sodio y 1,5 mM 0,15 mM). La solución de ADN puede colocar a 4 ° C durante la noche, o puede ser calentada a 37 ° C durante 10-30 minutos aumentar la disolución de ADN.
      14. Antes de almacenaje, separar el DNA en pequeñas alícuotas (10-20 μl), porque la repetida congelación y descongelación de soluciones de ADN podría resultado en una disminución de la aducción las concentraciones. Conservar a-80 ° C o más frío.
        Nota: Determinación espectrofotométrica de ADN: el método simple y exacto, que es ampliamente utilizado para medir la cantidad de ADN en una preparación si la muestra es pura (es decir, sin cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol u otros los ácidos nucleicos), es la medición espectrofotométrica de la cantidad de ADN de UV irradiación absorbida por las bases (consulte los procedimientos descritos previamente)28.
  5. Procedimientos para la detección de ADN aducción formación
    1. 32 Análisis P-postlabeling
      Nota: Utiliza la hidrólisis del ADN hidrolizado preparado en esta etapa para el análisis de aductos (2.5.1.), así como de Deoxynucleótidos por (no modificados) normal (2.5.7)..
      1. Nucleasa micrococcal (MN) se disuelven en agua a una concentración de ~ 450 unidades (U) / mL. Dializan contra agua destilada y ajustar a 300 U/mL. Solución de fosfodiesterasa (SPD) de bazo de dializarse y ajuste a 4 U/mL.
      2. Mezcla de MN y SPD a concentraciones finales 150 mU/μl MN y 2,5 mU/μl SPD (solución de MN/SPD). Tomar la solución de ADN que contiene 12.5 μg y evaporar a sequedad en un evaporador. Disuelve en 6,5 μl de agua destilada.
      3. Añadir solución de MN/SPD de 5,0 μL (concentración final de MN es 60 mU/μl, concentración final de SPD es 1 mU/μL) y 1,0 μL de tampón de digestión (concentración final de succinato de sodio es de 20 mM, concentración final de CaCl2 es 8 m m). El volumen final de la mezcla es 12.5 μl. mezcla y permiten reacciones por 3 h a 37 ° C.
      4. Eliminar 2.5 μl (transferencia a otro tubo) para mayor dilución y análisis de Deoxynucleótidos por sin modificar (2.5.7).
    2. Procedimiento de enriquecimiento nucleasa P1
      1. A la restante 10.0 μL de hidrolizado, añadir tampón de acetato de sodio de 0.65 μl (concentración final, 40 mM), solución de2 de vivencias de 0.65 μl (concentración final 0,1 mM), 1.25 μl NP1 solución (concentración final, 0.385 μg/μl) y 0.45 μL agua destilación. El volumen final de la mezcla es 13 μl.
      2. Deje que la mezcla reaccione durante 30 min a 37 ° C y poner fin a la reacción con la adición de 3 μl de solución de Tris.
    3. n-procedimiento de enriquecimiento de Butanol
      1. Añadir a la restante 10.0 μL de hidrolizado de ADN, 215 μl de solución de formiato de amonio 11,6 mM, pH 3.5 y 25 μl 10 mM TBA cloruro en solución. Extraer con 250 μl n-butanol (saturada con agua) mediante la mezcla vigorosa. Spin (3 minutos) a 1.600 x g para separar las capas y sacar el superior n-capa de butanol. Extraer una vez más con 250 μl n-butanol (saturada con agua), hacer girar, despegar el superior n-capa de butanol y se combinan con el extracto anterior.
      2. Añadir 400 μL de agua (saturadas con n-butanol) a este extracto y mezclar vigorosamente. Girar para separar las capas y eliminar la capa acuosa inferior. Repita este procedimiento de lavado con 400 μL de agua (saturadas con n-butanol). Agregar 3 μl de solución de Tris-HCl, pH 9.5, de 250 mM al n-capa de butanol. Se evaporan n-butanol a sequedad en un evaporador a la temperatura ambiente.
      3. Disolver el residuo en 100 μl n-butanol, evaporar a sequedad otra vez y disolver el residuo en 16.0 μL de agua.
    4. Etiquetado de los aductos
      1. Añadir 1 μl de tampón de bicina (etiquetado buffer) y 4.5 μl de una mezcla que contiene 100 μCi [γ -32P] ATP, 45 pmol de frío ATP y 10.0 U de T4-PNK (T4-phosphonucleotide quinasa) 16.0 solución μl de mezcla de enriquecimiento NP1 o butanol. Las concentraciones finales de los reactivos será el siguiente: bicina de 20 mM, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiotreitol, espermidina de 0,5 mM y 0.5 U/μl T4-PNK, ATP de 3 μm. El volumen total de la mezcla es de 20 μl.
      2. Deje que la mezcla reaccione durante 30 min a temperatura ambiente. Aplicar toda la muestra (es decir. 20 μl) sobre la placa de TLC celulosa PEI (2.5.6.).
    5. Evaluación de la eficacia de NP1 o n -butanol mejorar procedimientos
      1. Lave la parte inferior del tubo con 50 μl de agua. Mezcla vigorosamente durante 30 s y vuelta (1 minuto) a 1.600 x g en una centrífuga para establecer allí no es ninguna contaminación en la tapa. Punto 5 μL en una placa de TLC celulosa PEI (20 x 20 cm). Cromatógrafo en una solución de 280 mM (NH4)2hasta4 y 50 mM NaH2PO4, pH 6,8.
    6. Separación de TLC de Deoxynucleótidos aducidos por
      1. Lavado preliminar a las placas de TLC con agua destilada. Se recomienda especialmente para las placas hechas en casa.
        Nota: Este lavado debe llevarse a cabo para eliminar el color amarillo de placas, de un color que puede elevar el fondo, particularmente en el frente del solvente.
      2. Ver toda la muestra sobre la placa de TLC celulosa PEI y empezar a cromatografía (2.5.4.); limpiar de aductos se realiza mediante el desarrollo de la placa en las direcciones D1 y D2 (figura 2).
      3. Desarrollar la placa en una dirección D1 (figura 2). Tampón de fosfato de sodio de uso de 1,7 M, pH 6.8, para asegurar que el ADN aductos son restantes en el inicio de la placa de TLC. Desarrollar de manera análoga, la placa en una dirección D2 utilizando este이 buffer. Para obtener información sobre posibles reservas para los procedimientos, consulte soluciones descritas para la resolución de varios tipos de aductos20,28.
        Nota: El desarrollo de la placa en una dirección D2 puede omitirse.
      4. Lave la placa en agua desionizada después de cromatografía por unos 5 min en dos baños consecutivos. Después de esto, seque las placas.
      5. Desarrollar las placas en dirección a D3 y D4 con 3,5 M litio formiato de tampón, pH 3.5, que contiene 0.5 a 8.5 M urea para D3 Dirección M Tris-HCl buffer, pH 8.0, que contiene urea LiCl y 8,5 M de 0.8 M para D4 dirección (figura 2). Los solventes deben ajustarse para desarrollar los puntos de la aducción sobre la placa de TLC. Para obtener información sobre posibles reservas para los procedimientos desarrollo D3 y D4, vea las soluciones descritas para la resolución de varios tipos de aducciones23,24,25,28.
      6. Para evitar cualquier problema en D4, después desarrollo en una dirección de D4 y un lavado con agua, se desarrollan las placas (a lo largo de D4) en 1,7 M fosfato sódico, pH 6.0 (usualmente asignado como desarrollo en dirección a D5), a la parte superior de una mecha de papel (12 x 11,5 cm).
        Nota: La dirección D5 puede también omitirse. En este caso, es necesario abrir el tanque del TLC cuando el solvente ha llegado a la cima del TLC y permite un funcionamiento de hasta 60 minutos. Este método es incluso mejor que agregar una mecha (el método utilizado con frecuencia en muchos laboratorios para eliminar cualquier problema en D4).
    7. Cuantificación de Deoxynucleótidos por (no modificados) normal después de la hidrólisis
      1. Diluir una alícuota de hidrolizado (de 2.5.1. describiendo la hidrólisis del ADN) con agua destilada, (es decir., 2,5 μl de la mezcla de digestión de 2.5.1. ajustado a 250 μl y 10 μl de esta solución se ajustó a 150 μL).
      2. Tomar alícuota de esta recopilación un 5 μl (10 pmol normal Deoxynucleótidos por), añadir 2,5 μl de tampón 10 mM Tris-HCl, pH 9.0 y la etiqueta como en 2.5.4. (el volumen final de la mezcla es de 10 μl). Dejar para reaccionar durante 30 min a temperatura ambiente.
      3. Tomar un μl 4 alícuotas de la mezcla y diluir hasta 750 μl con 10 mM Tris-HCl, pH 9.0. Mezcla y vuelta para establecer que no hay contaminación de la tapa. Se aplican 5 μL en una placa de TLC celulosa PEI. Desarrollar la placa de TLC en una solución de 280 mM (NH4)2entonces4 y 50 mM NaH2PO4, pH 6,5. Deje que se seque después de TLC.
      4. Uso de autorradiografía que se realiza en aproximadamente 45 minutos a temperatura ambiente para localizar los Deoxinucleótidos sin modificar cuatro bis-fosfatos. Corte para cuantificación por centelleo líquido o conteo Cerenkov.
    8. Cálculo del pariente aducción etiquetado (RAL)
      1. Determinar los valores de las cuentas en los puntos de la aducción y las cuentas en la alícuota de Deoxynucleótidos por (normal) etiquetados.
        Nota: Este último debe determinarse en 180.000 cuentas menos material que el anterior, una figura que es el factor de conversión para aplicar a la cuenta de Deoxynucleótidos por (normal) sin modificar para la evaluación de los valores RAL de aducto de niveles. RAL de ADN aductos se calcula según la ecuación (2) se muestra más arriba.
    9. Detección de atascamiento de la prueba de carcinógenos o drogas a ADN mediante fármacos radiactivos marcados
      1. Evaluar las 3H o 14C radiactividad de ADN modificado con productos químicos por recuento de centelleo líquido.
      2. Añadir 10-50 μl de solución de ADN a 3 mL de una solución de centelleo en el vial de centelleo. Mezclar bien. Medida de la radiactividad mediante el contador de centelleo.

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Resultados

Utilizando los protocolos descritos aquí para la utilización de la activación de enzima-catalizado (es decir, P450, peroxidasa, reductasa) para investigar la potencia de los productos químicos (cancerígenos, drogas) para ser metabolizado a productos intermedios dando por resultado su covalente Unión a DNA (generación de ADN aductos), hemos sido capaces de resolver (i) un nuevo mecanismo de la acción farmacológica de la ellipticine agente contra el cáncer (para una revisión véase,...

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Discusión

En este trabajo, se demuestra una metodología ampliamente accesible para el estudio de la potencia de los productos químicos que bioactivación a intermediarios metabólicos, resultando en generación de covalente DNA aducciones. Este es un tema crucial, porque la evaluación de la potencia de los productos químicos ambientales o medicamentos de su activación enzimática a metabolitos generando covalente ADN aductos es un campo importante en el desarrollo de cáncer y su tratamiento. La modificación del ADN por agentes carcinó...

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Divulgaciones

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la Fundación para la ciencia Checa (GACR, grant 17-12816S).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
TrisSigma-Aldrich252859
Cloruro de potasioSigma-AldrichP9541
Acetato de sodioSigma-AldrichS2889
Fenol Roth0032.8
Fenol/Cloroformo/IsoamilalcoholRothA156.1
EtanolPenta70390-11000
ADN del timo de terneraSigma-AldrichD4522
NADHSigma-AldrichN7004
NADP+Sigma-AldrichN5755
NADPHSigma-AldrichN7505
D-glucosa 6-fosfatoSigma-Aldrich7647001
D-glucosa 6-fosfato deshidrogenasaSigma-AldrichG6378
SupersomasCorning Gentest456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Microsomas hepáticos humanosCorning Gentest452172
Tween 20Sigma-AldrichP1379
HipoxantinaSigma-Aldrich77662
2-hidroxipirimidinaSigma-AldrichH56800
Acetato de etiloSigma-Aldrich437549
Éter dietílicoSigma-Aldrich179272
Nucleasa microcócica de Staphylococcus aureusSigma-AldrichN3755
Fosfodiesterasa del bazo del bazo de ternera, Calbiochem tipo II524711
Nucleasa P1 de Penicillium citrinumSigma-AldrichN8630
BicineSigma-Aldrich163791
DL-DithiotreitolSigma-AldrichD0632
EspermidinaSigma-AldrichS2626
Cloruro de tetrabutilamonioSigma-Aldrich86870
n-ButanolSigma-Aldrich437603
T4-polinucleótido quinasaUSB Corp70031Y
[γ-32P]ATPHartman Analytic GmbHFP-201
Placas TLC de celulosa impregnadas de PEIMacherey-Nagel801053
Packard Instant Imager A202400PackardG120337
EllipticinaSigma-Aldrich285730
3-Nitrobenzanthronepreparado (sintetizado) como se muestra en la ref. 40

Referencias

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture - lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , Imperial College Press. London. 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), PubMed ID: 7031643 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts - biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), PubMed ID: 4053037 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, PubMed ID: 14209971 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), PubMed ID: 16936898 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), PubMed ID: 19152223 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), PubMed ID: 12419844 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), PubMed ID: 12782579 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), PubMed ID: 28263536 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), PubMed ID: 23114584 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

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