Artículo de método

Dos fotones Intravital proyección de imagen de leucocitos durante la respuesta inmunitaria en hígado de ratón tratados con lipopolisacárido

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DOI:

10.3791/57191

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6 de febrero de 2018

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1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Establecimos un protocolo quirúrgico novedoso para la proyección de imagen de dos fotones de hígado en ratones con la invasión mínima. Con esta técnica identificamos la estructura detallada del hígado durante la endotoxemia inducida por lipopolisacáridos. Esperamos que este método puede utilizarse para determinar la efectividad del tratamiento de reactivos diferentes a la migración de leucocitos hepáticos.

Resumen

La sepsis es un tipo de infección grave que puede causar falta del órgano y tejido daños. Aunque las tasas de morbilidad y mortalidad asociada a sepsis son tratamiento muy alto, no directo o mecanismo relacionado con el órgano se ha examinado en detalle en tiempo real. El hígado es el órgano clave que administra las toxinas e infecciones en el cuerpo humano. En este documento, se intentó realizar intravital la proyección de imagen del hígado del ratón después de la inducción de endotoxemia para rastrear la motilidad de las células inmunes, tales como neutrófilos y macrófagos capsulares hepáticos (LCMs). Por consiguiente, hemos diseñado un nuevo método quirúrgico para la exposición del hígado con cirugía mínimamente invasiva. Ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con lipopolisacárido (LPS), una endotoxina común. Con nuestro nuevo enfoque quirúrgico para la exposición y la proyección de imagen intravital de la contratación de ratón, hígado, que encontramos del neutrófilo en proteína tratados con LPS LysM-verde fluorescente (GFP) hígado de ratón fue aumentada en comparación con los en tampón fosfato hígado tratados con solución salina. Después del tratamiento de LPS, el número de neutrófilos aumentó significativamente con el tiempo. Además, utilizando ratones CX3Cr1-GFP, con éxito visualizado hígados macrófagos residentes llamados LCMs. Por lo tanto, para investigar la eficacia de nuevos reactivos para el control inmune movilidad en vivo, determinar la motilidad y la morfología de los neutrófilos y LCMs en el hígado puede permitirnos identificar efecto terapéutico en órgano falla y tejidos daños causados por activación de leucocitos en la sepsis.

Introducción

El hígado es el órgano metabólico importante en mamíferos; actúa como una torre de control de energía, hormonas y la desintoxicación1. Debido a su importancia, los investigadores han llevado a cabo muchos experimentos in vitro e in vivo para aclarar los cambios en el hígado durante la inflamación. La microscopia intravital ha sido utilizada para capturar imágenes en vivo del hígado2 . De hecho, hígado varios métodos de proyección de imagen han sido introducido2,3,4,5,6. Sin embargo, con el fin de desarrollar un enfoque quirúrgico más simplificado y lograr la estabilización de órgano blanco y las células inmunes, se diseñó un protocolo simple que pueda guiar investigadores para minimizar su esfuerzo para la proyección de imagen intravital.

En este estudio, hemos introducido una cámara de proyección de imagen estable y novela y técnica quirúrgica que podría ser utilizado para minimizar el sangrado y posibles infecciones. Se confirmó que el hígado permaneció intacto por más de 2 h. Con este método, se identificaron con éxito morfología de neutrófilos bajo condición séptica y LCMs7 . Puesto que este método minimiza el físicos y biológicos factores de confusión tales como inflamación de temblor e inesperada durante el procedimiento quirúrgico, Anticipamos que este método podría ser utilizado para observar reacciones agudas de células inmunes en el hígado en respuesta a reactivos como LPS.

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Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo las directrices de la atención institucional del Animal y uso Comité de Yonsei University College of Medicine, Corea. Proteína LysM verde fluorescente (GFP; gfp / +) ratones8 y CX3Cr1-GFP (gfp / +) ratones de9 a 8-12 semanas de edad fueron utilizados para la proyección de imagen de intravital. Todas las herramientas quirúrgicas fueron esterilizado y desinfectado con alcohol al 70%.

1. diseñado ratón hígado de cámara con el apoyo de herramientas de imagen

  1. Hígado de ratón de diseño de la cámara
    1. Hacer una cámara del siguiente tamaño de hígado de ratón (figura 1) la proyección de imagen: cámara interior (120 mm longitud × anchura 160 mm × 30 mm de altura), cámara exterior (100 mm longitud × anchura 100 mm × 24 mm de altura), pernos (Ф 3 mm × 30 mm de altura), tuercas (Ф 4 mm) y las tuercas en forma de ala (Ф 4 mm).
    2. Medir el agente de curado y elastómero base en proporción de 1:9 para hacer un total de 120 g de silicona.
    3. Ponga la mezcla de la silicona líquida en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y mezclar bien. A continuación poner el matraz en un desecador y eliminar burbujas de aire de aproximadamente 1 h bajo vacío por la bomba.
    4. Vierta la mezcla de la silicona en una cámara de ratón personalizados hasta 10 mm de altura y dejar curar durante un par de días (figura 1A).
  2. Preparación de la cubierta y el hígado fijación cama
    1. En el marco del metal, coloque el vidrio de cubierta usando pegamento de silicona. Déjelo secar por 1 día (figura 1B).
    2. Para llevar a cabo con eficacia el agua destilada para el lente de inmersión de agua, una estructura de bloqueo del agua semipermanente es esencial. Hacer 1 mm redondeo pegamento de silicona y endurecen durante la noche.
    3. Mezclar el agente de curado y el elastómero base y luego verterlo en una placa de 6 pozos a una altura de unos 8-10 mm. realizar el proceso de endurecimiento descrito en 1.1.2-1.1.4.

2. preparación de LPS

  1. Preparar 1 × tampón fosfato salina (PBS) para diluir el polvo de LPS de Salmonella enterica serotipo enteritidis. (1 x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4).
  2. Precalentar PBS en baño María a 37 ° C y abrir con cuidado el frasco de polvo de LPS (25 mg).
  3. Con la ayuda de una pipeta, verter el PBS estéril (5 mL) en el frasco de polvo de LPS y revuelva suavemente o suspender la solución para preparar la solución madre.
    Nota: Después de polvo LPS es licuado, Vortex áspero puede causar burbujas. Evitar hacer burbujas para minimizar la pérdida al hacer alícuotas en tubos de 1,5 mL.
  4. Almacenar la solución LPS a −20 ° C y diluir en una solución de LPS de 1 mg/mL para inyección.
  5. Inyecte la solución 1 mg/mL de LPS (20 mg/kg) en el peritoneo de un ratón no anestesiados con una jeringa de 1 mL. Para el animal de control, inyectar el mismo volumen de PBS.
  6. Espere durante 2 h suficiente respuesta inflamatoria.

3. preparación de Texas-Red dextrano a los vasos sanguíneos de la mancha

  1. Preparar dos tubos cónicos de 15 mL y 10 mL de PBS estéril.
  2. Diluir el polvo rojo Texas dextrano (25 mg) en 3 mL de PBS y se mezcla bien. Transferir la mezcla a un tubo cónico de 15 mL vacío.
  3. Transferencia del PBS restantes (7 mL) para el tubo cónico de 15 mL que contiene la mezcla de dextrano (3 mL).
  4. Conectar un filtro de 0.45 μm la jeringuilla para la punta de una jeringa de 10 mL. El filtro de la jeringuilla debe reemplazar la aguja.
  5. Filtrar la mezcla de dextrano (10 mL). Presione uniformemente la jeringa para evitar derrames.
  6. Dispensar 500 μl de solución de dextrano de 2,5 mg/mL en el tubo de 1,5 mL de luz bloqueada y almacenar a −20 ° C. Una vez descongelado, almacenarla a 4° C.

4. proceso quirúrgico

  1. Desinfectar la mesa de cirugía y todos los instrumentos con alcohol al 70% antes de la cirugía. Luego, los instrumentos para la cirugía hepática y ajuste la placa de calentamiento a 37 ° C (figura 2A, B).
  2. Para la anestesia, inyectar por vía intraperitoneal los ratones con 30 mg/kg de tiletamina/zolazepam y 10 mg/kg de xilacina. Estas soluciones pueden ser mezcladas y diluidas en PBS para la inyección simultánea. Confirmar anestesia presionando suavemente el dedo del ratón.  Continuar siguiente paso cuando no hay ningún reflejo.
  3. Aplicar pequeña cantidad de ungüento oftálmico para prevenir la sequedad de la retina del ratón.
  4. Eliminar el vello corporal en el área del abdomen con crema depilatoria (figura 2).
  5. Inyecte 200 μL de solución de dextrano de Texas-rojo (concentración de 2,5 mg/mL) a través de la vena de la cola o retro-orbital inyección con una jeringa de insulina (Figura 2D).
  6. Marque el área subcostal derecha con un marcador. La línea debe extraerse desde el proceso xifoides hasta el final de la costilla. Corte de la epidermis con pinzas y tijeras (Figura 2E, F).
  7. Abrir la cavidad abdominal utilizando micro-tijeras y pinzas y exponer el hígado cuidadosamente. El lóbulo lateral izquierdo debe desplegado utilizando hisopos de algodón (figura 2, H).
  8. Vierta 500 μl de PBS estéril en la cavidad abdominal para evitar la sequedad del hígado.
  9. Coloque el ratón en la posición de decúbito derecho en una cámara de diseño personalizado y aplique una pequeña cantidad de pegamento de tejido a la cama de silicio. Luego, con cuidado coloque el hígado utilizando hisopos de algodón (figura 2I).
    Nota: Debido a que el tejido del hígado es muy friable, no mecánicamente extraer el hígado. Gire el cartucho suavemente hacia fuera con bastoncillos de algodón.
  10. Unos segundos después, moje el hígado nuevo con 500 μl de PBS estéril para evitar que se sequen fuera del hígado. Coloque el marco de metal en el hígado y fijarla firmemente con las tuercas (figura 2J).

5. intravital imágenes del hígado con microscopía de dos fotones

  1. Ejecutar software de ZEN (Carl Zeiss) para encender el láser, ajuste la longitud de onda de 880 nm y el conjunto verde y rojo. Ajustar la potencia del láser según la intensidad de fluorescencia (Figura 3A). Información de filtro de emisión es el siguiente: verde/Alexa488, 500-550 nm y rojo/Alexa 555, 575-610 nm.
  2. Colocar la cámara en el escenario de proyección de imagen y 20 X objetivo de inmersión en agua cerca del cubierta de vidrio.
  3. Fijar el calentador de caucho de silicona debajo del cuerpo del ratón para mantener su temperatura corporal (figura 3B).
  4. Dejar caer 500 μl de agua destilada en el marco del metal y luego tire de la lente del objetivo cerca del hígado (figura 3).
  5. Ajustar el enfoque y determinar la profundidad y el tiempo de la zona de proyección de imagen.
  6. Realizar la proyección de imagen.
  7. Para la proyección de imagen a largo plazo, inyecte media dosis de mezcla tiletamina/zolazepam y xilacina cada hora durante proyección de imagen. Mantener la temperatura corporal de los ratones a 37 ° C es esencial en esta etapa. Mantener siempre en el ojo el ratón, ya que el tiempo de anestesia difiere de cada ratón.
    Nota: Este método no es conveniente para la recuperación después de cirugía y la proyección de imagen. Éticamente sacrificamos el ratón inmediatamente después de la cirugía.
  8. Revise los reflejos pedal para cada 30 minutos de anestesia estable.

6. Análisis de datos

  1. Abra el software de análisis de datos Volocity y luego importar los datos en bruto en la biblioteca en el software.
  2. Eliminar ruido de la imagen para adaptarse a la situación y tomar una instantánea.
    Nota: Para obtener imágenes nítidas, utilice el filtro 'Finos' o 'Mediana'. Además, utilice la función 'Realce de contraste' a oscuras o borrosas imágenes más claras.
  3. Ajustarse los elementos editados al 100% y exportación como archivos JPEG o TIFF para imágenes y archivos AVI para peliculas.

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Resultados

Se creó una cámara de proyección de imagen sencilla y muy estable. La parte inferior de la cámara estaba cubierta con silicona, que impidió el deslizamiento del ratón cuerpo y órganos. Además, porque el silicio tiene la cantidad apropiada de la elasticidad, podría prevenir daño esperado inducido por la presión de la corredera de cubierta (figura 1A, C). Segundo, el tejido de seguridad pegamento (enlace de veterinario) se aplicó con el fin de ...

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Discusión

El hígado se ha estudiado activamente por muchos grupos3,10, debido a la importancia de su función. Por ejemplo, Heymann et al. sugirió un método delicado utilizando agarosa. Aunque este método fue encontrado para ser muy preciso, el ajuste de agarosa toma tiempo. Sin embargo, con nuestra metodología, todos los procedimientos pueden llevarse a cabo dentro de 30 minutos, reduciendo al mínimo otros factores de confusión. En segundo lugar, estabilizar el hígado es m...

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Divulgaciones

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por una subvención de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea (MSIP; subvención n ° 2016R1A2B4008199 Y m. H.) y el Ministerio de salud y bienestar, República de Corea (número: HI14C1324).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cámara diseñada a medidade célula vivaTamaño a medida
Corredera de cubierta metálicaInstrumentos de célulaviva Tamaño
Cubierta de vidrioCiencias de la microscopía electrónica#72204-03
Sylgard 184 Kit de elastómero de siliconaDow Corning
Matraz ErlenmeyerDURAN21 216 36
Placa de cultivo celular (tipo plano)HYUNDAI Micro Co.H31006
DesecadorADARSH55204
High Q BOND SE 5 mLBJM LABPara hacer dique semipermanente
Calentadores de caucho de silicona flexibleOmega SERIESRFR/SRFG, M1250/0800
Fuente de alimentación DCToyotechDP30-03A
Solución salinaHecho en casa
Lipopolisacáridos (LPS) de Salmonella enteria serotipo enteritidisSigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 mL Tubo cónico de polipropileno
de alta claridad		FALCON14-959-49B
0.45 μ Filtro m (Filtro de jeringa Minisart)Sartorius16555k
Micro tubo de 1,5 ml, ámbarAxygenMCT-150-XPara bloquear la luz
Jeringa de 1 mL Vacunade CoreaKV-S01
Jeringa de 3 mLVacuna de CoreaKV-S03
Jeringa de 10 mLVacuna de CoreaKV-S10
Jeringa de insulina de 0,3 mLBecton Dickinson324900
Crema depilatoria 100 mLBody natur
Bastoncillo de algodónABDI
Zoletil 50 5 mLVirbac
Rompun 10 mL
Live CellInstrumentsPH-S-10Controlador de CC de tamaño personalizado
Live Cell InstrumentsCU-301
Tijeras de MicrodessecciónAparato Harvard72-5418
TijerasRobozRS-5882
PinzasRobozRS-5137
Vet bond3M1469SB
ZEN software (Black Edition)Carl ZeissPrograma para LSM 7 MP
LSM 7 MPCarl Zeiss
VolocityPerkinPrograma de análisis de Elmer
Instrumentos diseñado a medida tamponada con fosfato Placa calefactora Bayer

Referencias

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
  2. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  3. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303(2015).
  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
  5. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109(2011).
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  8. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
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