Establecimos un protocolo quirúrgico novedoso para la proyección de imagen de dos fotones de hígado en ratones con la invasión mínima. Con esta técnica identificamos la estructura detallada del hígado durante la endotoxemia inducida por lipopolisacáridos. Esperamos que este método puede utilizarse para determinar la efectividad del tratamiento de reactivos diferentes a la migración de leucocitos hepáticos.
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Artículo de método
Dos fotones Intravital proyección de imagen de leucocitos durante la respuesta inmunitaria en hígado de ratón tratados con lipopolisacárido
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La sepsis es un tipo de infección grave que puede causar falta del órgano y tejido daños. Aunque las tasas de morbilidad y mortalidad asociada a sepsis son tratamiento muy alto, no directo o mecanismo relacionado con el órgano se ha examinado en detalle en tiempo real. El hígado es el órgano clave que administra las toxinas e infecciones en el cuerpo humano. En este documento, se intentó realizar intravital la proyección de imagen del hígado del ratón después de la inducción de endotoxemia para rastrear la motilidad de las células inmunes, tales como neutrófilos y macrófagos capsulares hepáticos (LCMs). Por consiguiente, hemos diseñado un nuevo método quirúrgico para la exposición del hígado con cirugía mínimamente invasiva. Ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con lipopolisacárido (LPS), una endotoxina común. Con nuestro nuevo enfoque quirúrgico para la exposición y la proyección de imagen intravital de la contratación de ratón, hígado, que encontramos del neutrófilo en proteína tratados con LPS LysM-verde fluorescente (GFP) hígado de ratón fue aumentada en comparación con los en tampón fosfato hígado tratados con solución salina. Después del tratamiento de LPS, el número de neutrófilos aumentó significativamente con el tiempo. Además, utilizando ratones CX3Cr1-GFP, con éxito visualizado hígados macrófagos residentes llamados LCMs. Por lo tanto, para investigar la eficacia de nuevos reactivos para el control inmune movilidad en vivo, determinar la motilidad y la morfología de los neutrófilos y LCMs en el hígado puede permitirnos identificar efecto terapéutico en órgano falla y tejidos daños causados por activación de leucocitos en la sepsis.
Introducción
El hígado es el órgano metabólico importante en mamíferos; actúa como una torre de control de energía, hormonas y la desintoxicación1. Debido a su importancia, los investigadores han llevado a cabo muchos experimentos in vitro e in vivo para aclarar los cambios en el hígado durante la inflamación. La microscopia intravital ha sido utilizada para capturar imágenes en vivo del hígado2 . De hecho, hígado varios métodos de proyección de imagen han sido introducido2,3,4,5,
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Protocolo
Todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo las directrices de la atención institucional del Animal y uso Comité de Yonsei University College of Medicine, Corea. Proteína LysM verde fluorescente (GFP; gfp / +) ratones8 y CX3Cr1-GFP (gfp / +) ratones de9 a 8-12 semanas de edad fueron utilizados para la proyección de imagen de intravital. Todas las herramientas quirúrgicas fueron esterilizado y desinfectado con alcohol al 70%.
1. diseñado ratón hígado de cámara con el apoyo de herramientas de imagen
- Hígado de ratón de diseño de la cámara
- Hacer una cámara del siguiente....
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Resultados
Se creó una cámara de proyección de imagen sencilla y muy estable. La parte inferior de la cámara estaba cubierta con silicona, que impidió el deslizamiento del ratón cuerpo y órganos. Además, porque el silicio tiene la cantidad apropiada de la elasticidad, podría prevenir daño esperado inducido por la presión de la corredera de cubierta (figura 1A, C). Segundo, el tejido de seguridad pegamento (enlace de veterinario) se aplicó con el fin de .......
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Discusión
El hígado se ha estudiado activamente por muchos grupos3,10, debido a la importancia de su función. Por ejemplo, Heymann et al. sugirió un método delicado utilizando agarosa. Aunque este método fue encontrado para ser muy preciso, el ajuste de agarosa toma tiempo. Sin embargo, con nuestra metodología, todos los procedimientos pueden llevarse a cabo dentro de 30 minutos, reduciendo al mínimo otros factores de confusión. En segundo lugar, estabilizar el hígado es m.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por una subvención de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea (MSIP; subvención n ° 2016R1A2B4008199 Y m. H.) y el Ministerio de salud y bienestar, República de Corea (número: HI14C1324).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cámara diseñada a medida | de célula viva | Tamaño a medida | |
| Corredera de cubierta metálica | Instrumentos de célula | viva Tamaño | |
| Cubierta de vidrio | Ciencias de la microscopía electrónica | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona | Dow Corning | ||
| Matraz Erlenmeyer | DURAN | 21 216 36 | |
| Placa de cultivo celular (tipo plano) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desecador | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | Para hacer dique semipermanente | |
| Calentadores de caucho de silicona flexible | Omega SERIE | SRFR/SRFG, M1250/0800 | |
| Fuente de alimentación DC | Toyotech | DP30-03A | |
| Solución salina | Hecho en casa | ||
| Lipopolisacáridos (LPS) de Salmonella enteria serotipo enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL Tubo cónico de polipropileno de alta claridad | FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μ Filtro m (Filtro de jeringa Minisart) | Sartorius | 16555k | |
| Micro tubo de 1,5 ml, ámbar | Axygen | MCT-150-X | Para bloquear la luz |
| Jeringa de 1 mL Vacuna | de Corea | KV-S01 | |
| Jeringa de 3 mL | Vacuna de Corea | KV-S03 | |
| Jeringa de 10 mL | Vacuna de Corea | KV-S10 | |
| Jeringa de insulina de 0,3 mL | Becton Dickinson | 324900 | |
| Crema depilatoria 100 mL | Body natur | ||
| Bastoncillo de algodón | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | |||
| Live Cell | Instruments | PH-S-10 | Controlador de CC de tamaño personalizado |
| Live Cell Instruments | CU-301 | ||
| Tijeras de Microdessección | Aparato Harvard | 72-5418 | |
| Tijeras | Roboz | RS-5882 | |
| Pinzas | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Programa para LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinPrograma de análisis de Elmer |
Referencias
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional co....
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Reimpresiones y permisos
