Artículo de método

Usando humanos inducida por células de hepatocito-como derivado de células madre pluripotentes de descubrimiento de fármacos

DOI:

10.3791/57194

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19 de mayo de 2018

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo que presentamos describe una plataforma para la identificación de pequeñas moléculas para el tratamiento de la enfermedad hepática. Se presenta una descripción paso a paso detallando cómo iPSCs se diferencian en células con características de hepatocitos en placas de 96 pocillos y utilizar las células para detectar pequeñas moléculas con potencial actividad terapéutica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacidad de las células madre humanas pluripotentes inducidas (iPSCs) se diferencian en células similares a hepatocitos (HLCs) proporciona nuevas oportunidades para el estudio de errores innatos en el metabolismo hepático. Sin embargo, para proporcionar una plataforma que apoya la identificación de pequeñas moléculas que potencialmente pueden utilizarse para tratar la enfermedad hepática, el procedimiento requiere un formato de cultura que es compatible con la proyección de miles de compuestos. Aquí, describimos un protocolo usando las condiciones de cultivo totalmente definidos, que permiten la diferenciación reproducible de iPSCs humano a hepatocitos como las células en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. También ofrecemos un ejemplo del uso de la plataforma a los compuestos de la pantalla por su capacidad para bajar la apolipoproteína B (APOB) producido a partir de derivados de iPSC hepatocitos generados a partir de un paciente de hipercolesterolemia familiar. La disponibilidad de una plataforma que sea compatible con el descubrimiento de medicamentos debería permitir a los investigadores identificar nuevas terapias para enfermedades que afectan el hígado.

Introducción

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Éxito en la identificación de los medicamentos que pueden usarse para atacar una enfermedad rara se basa en el desarrollo de los análisis que pueden utilizarse para la investigación. Hipótesis o pantallas basado en destino (farmacología inversa) son útiles, pero requieren una comprensión detallada de la base molecular de la enfermedad. Pantallas fenotípicas (farmacología clásica) evitar la necesidad de una comprensión detallada de las vías bioquímicas, pero en lugar de otro confían en el desarrollo de modelos que reflejan con exactitud la fisiopatología de la enfermedad. A pesar del entusiasmo de los enfoques basados en el objetivo, análisis de drogas de primera clase aprobado por la FDA revelan que pantallas fenotípicos han sido mucho más exitosa1. El objetivo general de este método es establecer una plataforma de alto rendimiento de detección pueden utilizarse para identificar pequeñas moléculas para el tratamiento de la enfermedad hepática metabólica. Se han descrito varios modelos en vitro incluyendo primarias hepatocitos, células de hepatoma y de células progenitoras hepáticas2. Sin embargo, la mayoría de estos modelos tienen limitaciones, y hay una necesidad de nuevos modelos que pueden recapitular con exactitud la fisiopatología metabólica hepática deficiencias en la cultura. Recientemente, las células de vástago pluripotent humanas combinadas con la edición de genes han ofrecido una oportunidad para modelar las más raras de las enfermedades raras en la cultura sin la necesidad de acceso a pacientes directamente3. Mientras que el uso de iPSCs específico para cada paciente como una herramienta para descubrir pequeñas moléculas para el tratamiento de las enfermedades hepáticas raras es razonable conceptualmente, hay solamente algunos informes demostrando la factibilidad de este enfoque4. Sin embargo, recientemente hemos establecido una plataforma que utiliza hepatocitos derivados de iPSC para identificar con éxito fármacos que pueden reutilizar para el tratamiento de las deficiencias en el metabolismo del hígado5.

Este protocolo explica el proceso de diferenciación humana iPSCs a hepatocitos como las células en placas de 96 pocillos y usarlos para una biblioteca de moléculas pequeñas de la pantalla. También describe el análisis de punto final con hipercolesterolemia como un ejemplo de enfermedad hepática metabólica. Este enfoque puede ser útil para estudiar el papel y la aplicación de moléculas pequeñas en el contexto de enfermedad infecciosa del hígado, enfermedades hepáticas metabólicas, toxicidad de la droga y otros trastornos del hígado.

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Protocolo

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1. cultura de humanos inducida por las células de vástago Pluripotent

  1. Capa recombinante proteína de fusión Fc E-Cadherin humana (E-cad-Fc) u otras matrices adecuados para hPSC cultura 6
    1. Diluya en E-cad-Fc a 15 μg/mL Phosphate-Buffered solución salina de Dulbecco que contiene calcio y magnesio (DPBS (+)).
    2. Platos de cultivo de tejidos de suspensión de 100 mm con 5 mL de diluido E-cad-Fc la capa, incubar a 37 ° c por al menos 1 h. Retire sustrato y reemplazar con 5 mL de medio (por ejemplo, mTeSR1 denominado M-medio en adelante)7.
      Nota: El medio de cultivo utilizado en este protocolo se prepara siguiendo los protocolos publicados7. Sin embargo, varias otras preparaciones de medios de comunicación se han descrito, o están disponibles comercialmente, que son probablemente compatibles con el procedimiento.
    3. Recuperar un frasco de iPSCs criopreservados en nitrógeno líquido. Descongelarse a 37 ° c hasta que quede de un cristal de hielo. Suavemente pipetear las células en un tubo cónico de 15 mL estéril que contiene 4 mL de medio M.
    4. Centrifugar a 300 x g por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender suavemente las células con 5 mL de medio suplementado con 10 μm de Y-27632, un inhibidor selectivo de la Rho-associated, bobina en espiral que contiene proteína quinasa (ROCK).
    5. Retire el medio de M de paso 1.1.2 y transferir 5 mL de células de paso 1.1.4 a platos de cultivo de tejidos de suspensión de 100 mm E-cad-Fc-revestida.
  2. Mantenimiento de iPSCs humano en la cultura
    1. Una vez iPSCs llegar a alrededor de 80% de confluencia, eliminar el medio de cultivo y lavado una vez con el calcio y magnesio libres DPBS (-). Aspire la DPBS (-) y añadir una cantidad suficiente de solución de EDTA 0,02% a cubrir las placas e incubar hasta 3 min a temperatura ambiente.
      Nota: En el 80% de confluencia, la placa debe contener alrededor de 2 x 107 células. Es importante no cubran las células y para asegurar que las células mantienen una morfología indiferenciada. La pluripotencia de las células puede determinarse mediante tinción con marcador Tra-1-60 de la célula de vástago o equivalente8.
    2. Tan pronto como las células comienzan a liberar, quitar la solución de EDTA 0,02% y el plato con 10 mL de medio M para liberar las células de la inundación. Ayudar a la separación de iPSCs mediante pipeteo suave.
      Nota: El tiempo medio de incubación para las células separar es alrededor de 3 minutos, pero esto debe ser determinado empíricamente para cada línea de iPSC. Las células deben ser liberadas como pequeños racimos que contienen alrededor de 5-10 iPSCs por cluster.
    3. Transferencia de 1/10 de las células suspendidas por fresco plato de cultivo de tejidos E-cad-Fc revestido 100 mm suspensión conteniendo 5 mL de medio M. Incubar los cultivos a 37 ° c debajo del 4% O25% CO2 y cambio el medio día.
      Nota: Aunque iPSCs habitualmente se cultivan bajo condiciones de oxígeno fisiológica para promover la pluripotencia, iPSCs puede también cultivarse utilizando oxígeno ambiente.

2. diferenciación de iPSCs humano a hepatocitos como células en placas de 96 pocillos

Nota: Esta sección describe la diferenciación de iPSCs en un formato que es compatible con la investigación. Utilizando este enfoque, es posible inducir iPSCs humana para distinguir y formar hepatocitos como las células en 20 días. Mientras que esto es conveniente para la mayoría de los ensayos, la longitud de la cultura puede ampliarse para mejorar la madurez de las células.

  1. Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con la matriz de la membrana basal reducido factor de crecimiento de la capa
    1. Preparar el Caldo diluyendo la matriz a 2 mg/mL con medio de cultivo tisular DMEM/F12 estéril helada. La matriz se dividen en alícuotas μL 250 y almacenar a-80 ° c hasta que la necesite. Enfriar 10 mL de DMEM/F12 en hielo durante 30 minutos recuperar un 250 μL alícuota de acción matriz de 2 mg/mL y deshielo en hielo.
    2. La matriz se combinan con 10 mL de DMEM/F12 frío mezclando suavemente con una pipeta previamente enfriada para hacer la concentración final de 0.05 mg/mL.
    3. Transferir 100 μL de matriz diluido en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Incubar a 37 ° c, 4% O25% CO2 para por lo menos 1 h. Deseche la matriz y sustituir con 50 μL de medio de M por pozo. Mantenga a 37 ° C, 4% O25% CO2 hasta que se necesite.
  2. Células de la placa para la diferenciación
    1. La cultura iPSCs en placas de 100 mm hasta las células acercan a 80% de confluencia. Asegúrese de que la placa contiene alrededor de 2 x 107 células. Determinar el número de células por citometría de flujo de células o hemocitómetro.
      Nota: Con experiencia, se puede juzgar la calidad de las células iPSCs por microscopía; sin embargo, cerca del 98% de las células debe expresar marcadores de pluripotencia como el epitopo TRA-1-60 cuando se mide por FACS o immunostaining. Es importante que las células siguen siendo activamente dividir y no están cubiertas.
    2. Para cosechar las iPSCs de cada placa de 100 mm, aspirar el medio de cultivo y lavar con 5 mL de DPBS (-). Sustituir el lavado con 3 mL de solución de la separación de la célula (e.g., accutase) e incubar durante unos 2 minutos a 37 ° C, 4% O25% CO2.
      Nota: Es importante seguir el desprendimiento de las células por microscopía. No digerir con accutase. El objetivo es liberar las células como pequeños grupos con un mínimo tratamiento.
    3. Tan pronto como las células empiezan a separar, la cosecha añadiendo 7 mL de medio M. Pipeta varias veces para disociar las colonias celulares en pequeños grupos de alrededor de 3-6 células (figura 1A).
    4. Recoger las iPSCs en un tubo de centrífuga estériles de 15 mL y centrifugar a 300 x g por 5 minutos quite el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 5 mL de medio M.
    5. Distribuir uniformemente las células en placas de 96 pocillos recubiertos de matriz por Pipetear 50 μL de las células de suspensión en cada pozo. Para configurar cada placa de 96 pocillos, utilice una placa de 100 mm de iPSCs con células en aproximadamente 80% confluencia que contiene alrededor de 5 x 106 células para la diferenciación. Utilice una pipeta multicanal para acelerar este proceso. Cultura de las células durante la noche a 37 ° c, 4% O25% CO2.
      Nota: Es importante que un número igual de células se deposita en cada pozo para diferenciaciones reproducibles.
  3. Inducir la diferenciación de las células
    1. Examinar las placas de 96 pocillos por microscopia para asegurarse de que las células cubren bien al menos el 70% de la superficie de cada individuo. Si la cobertura es inferior al 70%, sustituir el medio por medio fresco e incubar durante 24 h a 37 ° c, 4% O25% CO2adicional.
      Nota: Células durante más de 48 h de incubación después de la galjanoplastia sin inducir diferenciación comúnmente reduce la eficacia de la diferenciación. Diferenciación también ocurrirá con oxígeno ambiente, aunque la eficacia puede ser afectada.
    2. Día 1 a día 2 de diferenciación, sustituir el medio de cultivo con RPMI suplementado con 2% B27 (sin insulina), Activin A de 100 ng/mL y 10 ng/mL BMP4 FGF2 de 20 ng/mL. Añada 100 μL de medio por pozo e incubar a 37 ° c, en ambiente O25% CO2 con un cambio medio diario por 2 días.
      Nota: Tratar con un gran número de placas de 96 pocillos requieren el uso de una pipeta asistida o robot. pipetas de 12 canales y 96 canales son ideales para el cambio medio diario.
    3. Para el día 3 a 5 días de diferenciación, reemplace el medio de cultivo con RPMI había suplementado con 2% B27 (sin insulina) y 100 ng/mL Activin A. Culture las células a 37 ° c, en ambiente O25% CO2 con cambio medio diario durante 3 días.
    4. En día 5, de la diferenciación antes de reemplazar con medio de cultivo fresco, tratar cada pozo con solución de EDTA de 0.02% μL 100 por 30 s, luego retire y reemplace con medio de cultivo fresco.
      Nota: Si la diferenciación al endodermo es eficiente, la monocapa de diferenciar las células es propensa a la peladura de la placa. Un breve tratamiento con solución de EDTA 0.02% ayuda a aliviar la separación de la célula. Este tratamiento no afecta la diferenciación a hepatocitos.
    5. Para la diferenciación entre los días 6 a 10, sustituir el medio de cultivo RPMI / 2% B27 (con insulina) suplementado con BMP4 de 20 ng/mL y 10 ng/mL FGF2 e incubar a 37 ° c, 4% O25% CO2 para 5 días con cambio diario de media. Esta etapa induce a las células a diferenciarse en células progenitoras hepáticas.
    6. Para la diferenciación entre los días 11 a 15, sustituir el medio de cultivo RPMI / 2% B27 (con insulina) complementado con HGF de 20 ng/mL. Incubar a 37 ° c, 4% O25% CO2 para 5 días con cambio diario de media.
    7. Para la diferenciación entre los días 16 a 20, sustituir el medio de cultivo con un medio de cultivo de la célula de hepatocitos (HCM) suplementado con 20 ng/mL de Oncostatina M (OSM). Incube las células a 37 ° c, en ambiente O25% CO2 con cambio medio diario por 5 días.
      Nota: La reproducibilidad de la diferenciación entre pocillos individuales eficientemente puede ser determinada midiendo el nivel relativo de albúmina, AFP o APOB secretada al medio por ELISA (véase 3.2).

3. pequeña molécula proyección

Nota: A continuación describe el procedimiento utilizado para identificar compuestos que pueden utilizarse para bajar el nivel de APOB en el medio del hepatocito-como las células derivadas de la hipercolesterolemia familiar iPSCs. Una descripción del modelo y su uso en la identificación de medicamentos para reducir el colesterol ha sido descrita en detalle previamente5,9. En el ejemplo actual, se revisaron 1.000 compuestos de la biblioteca de la colección compuesto de Carolina del Sur (SC3). Cada uno de ellos fue probado en una concentración de 2 μg/mL.

  1. Tratamiento de iPSC - hepatocitos derivados con moléculas pequeñas
    1. Diluir la biblioteca compuesta principal para generar placas de acción de trabajo con los compuestos en una concentración de 20 μg/mL en 2% DMSO y almacenar a-20 ° c.
    2. Preparar suficientes placas de 96 pocillos de hepatocitos derivados de iPSC para permitir que cada compuesto a probar.
      Nota: El número de compuestos que se proyectarán dictará el número de placas de 96 pocillos que se requieren. En general, un solo bien debería estar preparado para cada compuesto, además de más pozos para las muestras de control. Los pozos más externos de la placa se evitan comúnmente para reducir la posibilidad de efectos de borde que puede corromper la interpretación. Éxitos pueden identificarse utilizando el método z-score sin necesidad de utilizar repeticiones. Si se incluyen las repeticiones, es más apropiado utilizar la prueba t.
    3. Al final de la diferenciación (véase 20, día 2.3.7), sustituir el medio de cultivo con 100 μL de HCM fresco20 ng/ml de Oncostatina M. Incubar a 37 ° c, 4% O25% CO2 para exactamente 24 h. recuperar el medio de cultivo en una placa de 96 pocillos fresca y almacenar a-20 ° c. Utilice este ejemplo para calcular el nivel de APOB en el medio antes de la adición de drogas.
    4. Agregar 90 μL de HCM fresco 20 ng/ml de Oncostatina M en cada pozo. Añadir 10 μL de cada compuesto de la bolsa de trabajo después de mezclar por pipeteo. Agregar DMSO al 0,2% para el control de pozos para coincidir con la concentración final en las muestras tratadas e incubar a 37 ° c, ambiente O25% CO2 para exactamente 24 h. recoge el medio de cultivo y almacenar a-20 ° c. Utilice este ejemplo para determinar el nivel de APOB después del tratamiento con compuestos.
    5. Opcional - las células restantes pueden procesarse para la inmunotinción, viabilidad celular y análisis de niveles de mRNA utilizando métodos estándar.
      Nota: Esta pantalla fue diseñada para identificar fármacos que tuvo un rápido efecto sobre los niveles APOB. Sin embargo, dependiendo del modelo de la enfermedad, análisis aguas abajo o mecanismo de acción de los fármacos, puede ser beneficioso tratar la muestra por varios días.
  2. Determinar los niveles APOB por ELISA
    1. Determinar la concentración de apolipoproteína B (APOB) de ambos las pre- y post-drogas tratadas muestras usando un kit de desarrollo humano de APOB ELISA siguiendo los protocolos del fabricante.
    2. Preparar las siguientes soluciones
      1. Tampón de lavado, compuesto por un 0,05% Tween 20 en PBS, pH 7,4. Almacenar a 4 ° c hasta su uso.
      2. Tampón de incubación, conformada por 0,05% Tween 20 y 0.1% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS, pH 7,4. Almacenar a 4 ° c hasta su uso.
    3. Preparar anticuerpos APOB (mAB 20/17) diluyendo 2 μg/ml en PBS, pH 7,4. Añada 100 μL del anticuerpo diluido por pozo e incubar a 4 ° c durante la noche.
    4. Quitar el anticuerpo de las placas de ensayo y lavar bien dos veces con 200 μL de PBS, pH 7,4.
    5. Agregar 200 μL/pocillo del 0,05% Tween 20, 0.1% albúmina sérica bovina (BSA) en PBS, pH 7,4 y se incuba en una plataforma de agitación durante 1 hora a temperatura ambiente.
    6. Preparar una curva estándar de 8 puntos con 0,05% Tween 20 y 0.1% de BSA en PBS, pH 7,4 con las siguientes concentraciones de APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, ng/mL 175, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL y 50 ng/mL.
    7. Diluir las muestras prueba 1:4 con 0,05% Tween 20 y 0.1% de BSA en PBS, pH 7,4.
    8. Después de 1 h de bloqueo con tampón de incubación, deseche el búfer y lavar las placas de ensayo cinco veces con 200 μL de 0.05% Tween 20 en PBS, pH 7,4.
    9. Totalmente elimine cualquier tampón de lavado residual y transferencia 90 μL de las muestras diluidas y de los niveles APOB con las placas de ensayo. Incubar a temperatura ambiente en un agitador durante 1 hora.
    10. Descartar la muestra y lave con 200 μL 0,05% Tween 20 en PBS, pH 7,4 por pozo. Repita los lavados un total de 5 veces. Añada 100 μL por pozo de mAB LDL 11-biotina 1:1,000 diluido en 0,05% Tween 20 y 0.1% de BSA en PBS, pH 7,4. Incubar a temperatura ambiente en una plataforma de agitación durante 1 hora.
    11. Desechar el reactivo y lavado con 200 μL por pozo lavado Tampón 5 veces. Añada 100 μL por pocillo del anticuerpo de estreptavidina-HRP (1:1, 000 dilución con tampón de incubación), luego incubar a temperatura ambiente en una plataforma de agitación durante 1 hora.
    12. Desechar el reactivo y lavado con 200 μL 0.05% Tween 20 en PBS, pH 7,4 por pozo. Repita los lavados un total de 5 veces. Completamente eliminar el tampón de lavado residual de las placas de ensayo añada 100 μL por pocillo de la solución de tetrametilbenzidina (TMB) e incube a temperatura ambiente durante 8 minutos.
    13. Sin remover el Substrato TMB, directamente añadir 100 μL por pocillo de solución (HCl 1N).
    14. Determinar la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placas.
    15. Se puede establecer una curva estándar utilizando el método de regresión logística de cuatro parámetros, a continuación, utiliza para definir la concentración de APOB en cada muestra10.
    16. Examinar la droga previo: cociente de la droga después de APOB en cada muestra para identificar compuestos con potencial para bajar APOB los niveles en el medio.

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Resultados

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Generación de hepatocitos - como células: La figura 1 describe el calendario de los cambios que ocurren durante la diferenciación de iPSCs humano a hepatocitos como las células. La cultura de iPSCs E-Cad-FC proporciona aproximadamente 2 mm colonias de diámetro que expresan el marcador de pluripotent OCT4 (figura 1A-B). La morfología de las células en una matriz d...

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Discusión

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Objetivo basado en el descubrimiento de medicamentos, donde se identifican pequeñas moléculas que influyen en la actividad de una proteína específica, ha sido el foco de muchos esfuerzos de investigación existentes. Aunque este enfoque ha proporcionado numerosos productos farmacéuticos, pantallas basados en revertir un fenotipo, la farmacología clásica, han tenido más éxito en la identificación de compuestos de primera clase que han sido clínicamente eficaz1. Una desventaja para el descubrimiento ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (DK55743, DK087377, DK102716 y HG006398 a S.A.D). Nos gustaría agradecer al Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop y Jing Ran sus contribuciones.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de cultivo de tejidos estériles de 100 mm x 20 mm Placas deCorning 430167
de 100 mm x 20 mmPlaca de430591
de 96 pocillos Corning3595
Albúmina antihumanaDako A0001
Antihumano FOXA2(6C12)Novus BiológicoH00003170-M12
Antihumano HNF4 alfaSanta CruzSC-6556
Antihumano Oct-3/4anticuerpo Santa CruzSC-9081
Antihumano SOX17R& DAF1924
Anti-humano TRA-1-60 FITC conjugadoMilliporeFCMAB115F
Activina A Proteína Humana Recombinante InvitrogenPHC9563
B-27 Suplemento, sin insulina Invitrogen0050129SA
B-27 Suplemento, sin suero Invitrogen17504044
BMP4 Proteína humana recombinante PHC9533Invitrogen
StemPro  Accutase InvitrogenA1110501
CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad celular luminiscente Promega7572
DPBS+(calcio, magnesio)Invitrogen14040-133
DPBS-(sin calcio, sin magnesio)Invitrogen14190-144
DMEM/F-12, HEPES Invitrogen11330057
ELISA humano APOB ELISA kit de desarrolloMabtech3715-1H-20
Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2)InvitrogenPHG0023
medio de cultivo de hepatocitos (HCM Bullet Kit) LonzaCC-3198
Factor de crecimiento de hepatocitos  (HGF)InvitrogenPHC0321
L-Glutamina  Invitrogen25030081
MEM Solución de aminoácidos no esencialesInvitrogen11140076
Oncostatina M (OSM) Proteína humana recombinante InvitrogenPHC5015
Penicilina-Estreptomicina Invitrogen15140163
Alimentador medio de células madre pluripotentes libres: mTesR1 Tecnologías STEMCELL5850
Matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido InvitrogenA1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES Invitrogen22400105
StemMatriz definida adherente para hPSC (E-cad-Fc)Primorigen BiosciencesS2071
TMB-ELISA Substrate SolutionThermo Scientific 34022
Milliporeconjugado anti-TRA-1-60 FITCFCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02% Lonza17-711E
Y-27632 Inhibidor de ROCKSTEMCELL Technologies72302
cultivo en suspensión estériles cultivo de tejidos Corning Reactivo de disociación celular

Referencias

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