Cuantificación de proteína específica lisina acetilación y Succinylation estequiometría usando Spectrometry total de la adquisición de datos-independiente

Resumen

Aquí, presentamos imparcial cuantificación de proteína específica acetilación o succinylation ocupación (estequiometría) de un proteoma completo mediante un análisis radiométrica de modificaciones endógenas a modificaciones introducidas después de cuantitativo química acilación con anhídridos marcado con el isótopo estables. En combinación con la espectrometría de masas adquisición independiente de los datos sensibles, se obtienen mediciones de ocupación del sitio exacto.

Resumen

Modificación poste-de translación (PTM) de residuos de lisina de la proteína por_ƐN - acilación induce cambios estructurales que dinámicamente pueden regular las funciones de la proteína, por ejemplo, por cambio de actividad enzimática o por mediación de las interacciones. Cuantificación precisa de la ocupación de Acilación de proteína específica o la estequiometría, es esencial para la comprensión de las consecuencias funcionales de la estequiometría global de bajo nivel y acilación alto nivel individual de estequiometría de lisina específico residuos. Otros grupos han informado de medición de la estequiometría de lisina acetilación mediante la comparación de la proporción de isótopos de péptido precursor de la acilación de la abundancia natural, endógena y exógena, pesado isótopo-etiquetada acilación introducido después cuantitativa química acetilación de proteínas utilizando anhídrido acético marcado con el isótopo estable. Este protocolo describe un enfoque optimizado con varias mejoras, incluyendo: (1) aumento de la acilación química eficiencia, (2) la capacidad de medir la succinylation de la proteína además de acetilación y (3) mejoró la exactitud cuantitativa debido a interferencias reducidas mediante cuantificación de iones fragmento de adquisición de datos-independiente (DIA) en lugar de la señal de ion precursor de adquisición de datos dependientes (DDA). El uso extraídos de zonas de pico de iones fragmento para la cuantificación permite también una diferenciación de nivel de sitio acilación estequiometría de proteolíticas péptidos que contienen más de un residuo de lisina, que no es posible usar ion precursor señales para la cuantificación. Visualización de datos en el horizonte, un entorno de proteómica cuantitativa de código abierto, permite la revisión y la inspección de datos conveniente. Juntos, este flujo de trabajo ofrece cuantificación imparcial, exacta y precisa de site-specific lisina acetilación y succinylation de ocupación de un proteoma completo, que puede revelar y dar prioridad a sitios de acilación biológicamente relevantes.

Introducción

_ƐN - Acilación de restos de lisina de la proteína es un importante regulador de la función de la proteína. Acetilación de la lisina y otros acylations, como succinylation, malonylation y glutarylation, se cree que regulan el metabolismo, señalización celular y otros procesos celulares^1,2,3,4 , y tienen implicaciones en trastornos metabólicos⁵. Numerosos estudios han encontrado que lisina acil modificaciones someterse a grandes cambios de fold bajo diferentes condiciones en tejidos mamíferos y líneas^5,6,7,8 de la célula, así como las bacterias^9,10,11, sin embargo, estos cambios de doblez relativa no proporcionar penetraciones en la proporción de la proteína total modificada. Los estudios que informaron las medidas de ocupación del sitio de acilación son escasos^12,13,14, a pesar de la importancia y necesitan de tales estudios ya que proporcionan más detalles que pliegue relativo el cambio. Por ejemplo, un cambio 10 veces podría representar un aumento de ocupación del sitio de 0.01 a 0.1%, 1 a 10% o incluso 10 a 100%. Mediciones de estequiometría exacta se requiere interpretar el significado biológico de la acilación y predecir el impacto sobre la magnitud de la proteína estructural y, posiblemente, cambios funcionales.

Uno de los métodos anterior para cuantificar la ocupación del sitio utiliza pesado isótopos estables química de etiquetado de los residuos de lisina seguidas de espectrometría de masas para medir la relación entre endógeno acetilación "light" en comparación con los exógenos, etiquetado químicamente "pesada" acetil-lisina con precursor ion intensidades¹². Otro reciente estudio realizado por Zhou et al. ¹³ describe un enfoque similar para determinar la estequiometría de la acetilación de la lisina que también empleó una acetilación química completa de todos los residuos de lisina sin modificaciones en las proteínas con isótopos estables de etiquetado, pero utilizado intensidades de iones fragmento según lo medido por PDD. Nakayasu et al. ¹⁴ utiliza un enfoque similar de la PDD, pero en su lugar utiliza el cociente de iones immonium de acetil-lisina ligera y pesada para la cuantificación. Cuantificación basada en iones del fragmento, immonium o secuencia de iones (MS2), en la mayoría de casos de resultados en menos interferencias de señal en comparación con el proceso los iones intactas péptido precursor (MS1). Sin embargo, la cuantificación de iones fragmento de espectros MS/MS DDA genera puede padecer deficiencias de muestreo estocástico, donde son más propensos a ser seleccionado para MS/MS y por lo tanto, conducir a una muestra sesgada e incompleta de los iones precursores de alta abundancia iones precursores.

Este nuevo flujo de trabajo⁴ (figura 1) expresiones utiliza un isótopo estable químico etiquetado enfoque desarrollado originalmente por Baeza et al. ¹², sin embargo el flujo de trabajo es posteriormente junto con el DIA a recoger ambos precursores y múltiples abundancias de iones fragmento sobre la masa perceptible gama^15,16 proporcionar cálculos de estequiometría exacta.

Áreas de pico de fragmentan los iones que contienen el sitio de Acilación de interés o 'diferenciar los iones fragmento', se utilizan para cuantificar la ocupación del sitio de acilación (figura 2). Los iones fragmento que contiene la modificación tienen valores idénticos ligeras y pesadas m/z y se utilizan para la identificación de péptidos pero no para la cuantificación. Skyline software¹⁷ se utiliza para extraer áreas de picos precursor y fragmento. La presencia de varios iones fragmento que contiene un sitio de acilación dado proporciona flexibilidad si se detectan interferencias en algunos de los iones del fragmento. Visualización de datos en el horizonte permite inspección crítica de la relación de iones fragmento de ligero a pesado. Además de análisis de datos manual, un paquete de R de código abierto escrito en el local, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), fue desarrollado, que utiliza el precursor ion y fragmento ion datos recogidos a través de DIA y cuantifica estequiometría de acilación específica de péptidos que contienen varios residuos de lisina, una característica que no es posible con precursor ion sólo intensidad medidas⁴.

Este protocolo también muestra el uso de endoproteinasas Glu-C, que es específica para el escote de la terminal C en los residuos de ácido aspártico y glutámico, en lugar de utilizar la tripsina o la proteasa Arg-C, como el último a menudo genera muy grande y potencialmente se multiplican acilada proteolítica péptidos resultantes bloquean escote de tripsina en los residuos de lisina acilados. El químico procedimiento de etiquetado también se amplió para incluir uso de anhídrido succínico (figura 1), permitiendo la cuantificación de succinylation succinylation de estequiometría. Además de mejoras en la preparación de la muestra, la aplicación del fraccionamiento de péptido de pH básico, sin conexión, separación de fase inversa (bRP) de péptidos más disminución de interferencias de cuantificación, lo que permite mejor la convolución de estequiometría de acilación en muestras de proteoma conjunto. Juntos, este método incluye y destaca varias ventajas: (1) aumentar la eficiencia de acilación química; (2) medición de la estequiometría de succinylation de proteína además de acetilación; y (3) cuantificación mayor precisión. La cuantificación de la mejora es debido a disminución interferencias en las señales de iones fragmento de diámetro comparado con señal de precursor del PDD, así como la implementación de fraccionamiento anterior péptido fuera de línea por bRP.

Protocolo

1. cuantitativamente Acetylate o Succinylate las proteínas con isótopos marcados acético o anhídrido succínico

1. Preparar 3 repeticiones de 100 μg de muestra de la proteína de albúmina de suero bovino (BSA) en paralelo, en una concentración de 1 μg/μl (un total de 100 μL), con solución de bicarbonato (TEAB) urea y Trietilamonio (8 M urea, 200 mM TEAB, pH 8).
   Nota: Es importante utilizar tampón libre de Amina. Las muestras de proteína utilizadas aquí en la sección de resultados representativos son BSA, cuantitativamente succinylated BSA, y su rendimiento BSA muestras con mezclas definición ocupación succinylation en 0%, 1%, 10%, 50% y 100%, respectivamente (cada muestra se prepararán en 3 repeticiones). Este protocolo también se ha realizado utilizando lisados de proteínas de Escherichia coli y ratón hígado⁴. El protocolo puede aplicarse también a otros lysates de la célula o tejido.
2. Reducir 100 μl de muestra de BSA (100 μg) con 8 μl de 250 mM Ditiotreitol (DTT) para alcanzar una concentración final de 20 mM TDT e incubar la muestra a 37 ° C por 30 min con agitación a 1.400 rpm.
3. Alkylate la reducida muestra de BSA con 21,6 μl de 200 mM Yodoacetamida para alcanzar una concentración final de 40 mM Yodoacetamida e incubar la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos.
   Nota: Es importante que la concentración de Yodoacetamida levemente más de 2 x de la concentración de TDT para asegurar que todo reducido tioles de proteína son alquilados.
4. Proceder con la preparación de anhídrido acético -d₆ (paso 1.4.1) o succínico anhídrido -d₄ (paso 1.4.2) para química acetilación (cuantitativa) o el succinylation de las muestras.
   1. Determinar la molaridad (M) de la alícuota de 1 g de anhídrido acético acuosa -d₆ solución del peso molecular (108.13 g/mol) y densidad (1,143 g/mL a 25 ° C).
      Nota: El paquete de 1 g contiene 9.248 μmol de anhídrido acético -d₆ 875 Volumen μl, produciendo una solución de M 10,57 destinada por acetilación de las muestras.
   2. Preparar una solución de 5 M de succínico anhídrido -d₄ disolviendo el polvo en DMSO anhidro inmediatamente antes de la reacción para evitar la hidrólisis del reactivo. Disolver 0,24 g de succínico anhídrido -d₄ en 461 μl de DMSO anhidro para obtener una solución de 5 M.
5. Realizar la acetilación química cuantitativa o succinylation mediante la adición de 60 μmol de anhídrido acético -d₆ (6 μl de la solución M 10,57) o succínico anhídrido -d₄ (12 μl de la solución de 5 M) respectivamente e incubar las muestra a 4 ° C por 20 min en un mezclador de tipo vórtex.
   Nota: Debido a la acidez de anhídridos, pueden precipitar las proteínas. Toma nota y ajuste como se describe en el paso 1.6.
6. Añadir 10 μl de 7.25 M NaOH después de la incubación para aumentar el pH a 8 para eliminar cualquier producto de lado O acilación. Mezclar brevemente y cheque el pH de la muestra por 1 μl de spotting en el papel de pH.
   Nota: Puede ser necesario añadir más de 10 μl de 7.25 M NaOH hasta pH 8. Además, las proteínas potencialmente precipitadas deben volver a disolver.
7. Repita los pasos de ajuste por acilación y pH 1.5 y 1.6 para un total de tres veces. Compruebe los valores de pH y anote el volumen de solución básica añadido por repetición. Trabajo con rapidez durante la acilación química pasos porque los anhídridos se hidroliza y pierde reactividad.
8. Después del etiquetado y ajuste final, añadir 10 μl de solución de hidroxilamina de 50% para revertir reacciones de acilación O secundarias.

2. digerir reaccionó muestras de proteína usando endoproteinasas Glu-C

1. Diluir la concentración de urea a 0,8 M con 50 mM TEAB, pH 8 y normalizar los volúmenes de muestra.
2. Digerir las muestras de proteínas mediante la adición de endoproteinasas Glu-C en un 1:50 proteasa al cociente de la proteína sustrato (w/w) e incubar las muestras durante la noche a 37 ° C con agitación a 1.400 rpm.
3. Acidifica y saciar las muestras de la digestión de proteínas mediante la adición de ácido fórmico al 1% en volumen.
4. Desalar las muestras usando cartuchos de extracción en fase sólida de balance hidrofílico-lipofílico. Utilice un cartucho de 30 mg de sorbente por material de la muestra, máximo 5 mg por cartucho^4,18.
   Nota: Es importante mantener el absorbente dentro del cartucho mojado a lo largo de este proceso de desalación. Cuando es necesario, apague la bomba de vacío para frenar el paso del solvente o la muestra a través del cartucho.
   1. Inserte el cartucho (s) en los puertos de la succionadora de bloque de vidrio de 24 puertos y encienda la bomba de vacío. Deje sin usar puertos capsulados. Dejar uno o dos puertos sin tapón para mantener la presión más baja en el manómetro de vacío si es necesario.
   2. Moje cada cartucho dos veces con 800 μl de 80% acetonitrilo (ACN)/0.2% fórmico acid/19.8% agua. Asegúrese de que solvente sigue siendo 2-3 mm sobre el nivel del solvente. Asegúrese de que el manómetro de vacío en el múltiple Lee 16.9 – 67.7 kPa (5 – 20 en Hg).
   3. Equilibrar cada cartucho tres veces con 800 μl de ácido fórmico de 0.2% en agua. Asegúrese de que el manómetro de vacío en el múltiple Lee 16.9 – 67.7 kPa (5 – 20 en Hg).
   4. Cargar las muestras de péptido en el cartucho. Asegúrese de que el manómetro de vacío en el múltiple Lee 6,77 – 8.47 kPa (2 – 2.5 en Hg), y tasa de flujo no exceda 1 mL/min.
   5. Lave cada cartucho tres veces con 800 μl 0.2% el ácido fórmico en agua. Asegúrese de que el manómetro de vacío en el múltiple Lee 16.9 – 67.7 kPa (5 – 20 en Hg).
   6. Extraiga el cartucho de la Unidad succionadora y Acomódese en un microtubo de 1.5 mL.
   7. Eluir péptidos una vez con 800 μl de agua ACN/0.2% acid/19.8% fórmico al 80% y permitir que el disolvente se incuban con absorbente de 2 a 3 minutos.
   8. Utilice una pipeta al solvente de empuje a través de la capa absorbente dentro del cartucho. Repetir para la segunda elución de 400 μL 80% ACN/0.2% fórmico acid/19.8% agua en el mismo microtubo de 1.5 mL.
5. Seque el efluente por centrifugación vacío (fijada centrifugación a 268 x g), típicamente para 3 h.
   Nota: Si es necesario, las muestras de efluente seco pueden conservarse congeladas a-20 ° C hasta que esté listo para proceder con el fraccionamiento.

3. fraccionar péptidos usando fuera de línea Basic-pH fase invertida HPLC

1. Resuspenda el por-acilados y Glu-digerido muestras (preparadas como se describe en las secciones 1 y 2) en 200 μL de tampón A (formiato de amonio de 10 mM en agua, pH 10), mezcle la muestra durante 10 min en un mezclador de tipo vórtex a 4 ° C y centrifugar a 17.500 x g durante 10 minutos en la sala de te mperature.
   Nota: La muestra de péptido resultante está lista para ser offline fraccionado por pH alto separación^19,20.
2. Programa el método de fraccionamiento de HPLC sin conexión según el instrumento y el software utilizado. El siguiente método es específico para un sistema binario de bomba HPLC incluyendo un detector UV de longitud de onda dual, un muestreador, un colector de fracciones y una columna C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm tamaño de partícula) que tolera pH 10.
3. Recoger 40 fracciones min 2,1 por fracción y combinar cada fracción cuarta, resultando en cuatro fracciones combinado final⁴. Un mayor número de fracciones los puede utilizar para reducir aún más la complejidad de la muestra a expensas de tiempo de colección de datos de espectrometría de masas.
4. Secar las fracciones agrupadas en un liofilizador, vuelva a suspender las muestras de secado péptido en 1 mL de 50% ACN y 1% de ácido fórmico en agua y transferir a un recipiente de muestra más pequeño. Secar la muestra transferida mediante centrifugación vacío (fijada centrifugación a 268 x g), típicamente para 1 h.
   Nota: La presión de vapor baja de formiato de amonio puede dificultar completar el secado. Si cantidades significativas de sal de amonio formiato permanecen como precipitado de sal después de secar, repetir la extracción en fase sólida.
5. Resuspenda las muestras en 20 μl de ácido fórmico de 0.2% en agua con la mezcla estándar de retención indexadas tiempo (iRT) péptido.
   Nota: Las muestras ahora están listas para el análisis por espectrometría de masas.

4. diámetro análisis de muestras de péptido fraccionado

1. Analizar las muestras mediante un método DIA LC-MS/MS, que puede ser ajustado según los instrumentos de espectrometría de masa disponibles. El análisis se realizan mediante un sistema HPLC 2D nano-LC, conectado en línea con un espectrómetro de masas cuadrupolo ortogonal tiempo de vuelo (QqTOF).
   1. Programa LEADER para que mezclas de péptidos se transfieren en un chip de precolumna C18 (200 μm x chip de C18-CL de 6 mm, 3 μm, 300 Å) y lavar de 2 μl/min por 10 min con el solvente de la carga (H₂O/0.1% fórmico ácido) para la desalación.
   2. Separar los péptidos por cromatografía en un chip de cm C18-CL 75 μm x 15 (3 μm, 300 Å) con un caudal de 300 nL/min con un uso degradado de 2 h típica (y específicos del sistema LC) acuosa y solvente ACN buffers⁴.
   3. Generar un método de diámetro variable de la ventana, donde las ventanas de la gama total de ancho variable (5 a 90 m/z) pasan desde el cuadrupolo Q1 a la celda de colisión en pasos incrementales sobre la gama completa de masa (m/z 400-1.250).
      Nota: El tiempo de ciclo de 3.2 s incluye una exploración de ion precursor de 250 ms seguida del tiempo de acumulación de 45 ms para cada uno de los 64 franja segmentos^21,22.
2. Identificar péptidos usando un análisis paralelo de muestras por MS DDA y el edificio de bibliotecas espectrales, o alternativamente, se pueden identificar péptidos directamente datos DIA con PIQED software²³, que se encarga de todas las medidas técnicas de procesamiento de datos, identificación y la importación en el horizonte para la cuantificación posterior.

5. Tutorial de análisis de datos de ejemplo

1. Descargar el software de horizonte (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) y crear una cuenta de PanoramaWeb (https://panoramaweb.org).
   Nota: Los tutoriales detallados que describe uso de horizonte con datos, consulte (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Otros algoritmos de software pueden usarse para extraer áreas de pico iones fragmento liviano y pesado de las adquisiciones de DIA, como franja abierta²⁴, franja 2.0 plugin en PeakView²⁵y²⁶de Spectronaut.
   1. Descargar el archivo de datos de horizonte para los resultados representativos succinylated BSA (figura 3) del Panorama público: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. En la Página Web de Panorama, vaya a la tabla de "Orientados MS funciona" y descargar el archivo sky.zip elegir el link de descarga en el lado derecho. Extraer la carpeta .zip descargado y haga doble clic en el archivo skyline.sky para abrirlo en el horizonte. Revise el árbol de destino péptido fragmento iónico (panel izquierdo) y los cuatro cromatogramas de porcentajes definidos de luz succinylation (paneles de la derecha).
   2. Seleccione el menú "Ver", vaya a "áreas de pico | Replicar la comparación". El panel de "Pico zonas – replicar la comparación" con gráficos de barra aparecerá a la derecha de la ventana. En el panel de las áreas de pico, con el botón derecho y seleccione "transiciones | Solo", que muestra el área de pico de iones fragmento para el ion del fragmento seleccionado. Por último, haga clic derecho en el panel de "Áreas de pico" y seleccione "orden | Documento".
   3. En el panel de árbol de Diana en el lado izquierdo de la ventana, haga clic derecho en el péptido "E.LCKVASLRE. T | Cocientes a | Oneheavy", que calcula el cociente de la señal de luz ion sobre la señal de ion pesado, pesado.
      Nota: Esto no es lo mismo que la relación de estequiometría de ocupación de sitio de Light/(Heavy+Light).
   4. Observe que el árbol de destino informa ahora las relaciones L/H a la derecha de los iones fragmento de luz.
2. Determinar los "iones del fragmento diferenciación" que contienen el sitio de Acilación de interés.
   Nota: Como se muestra en la figura 3, con este ejemplo exacto, los iones diferenciadoras se determinaron y₇ (mejor puesto), y₈, b₃y b₄. Tenga en cuenta que los iones del fragmento no diferenciar muestran una proporción de 1 en el árbol de destino.
   1. En el árbol de destino del panel de la izquierda, bajo el 588.30 ++ subnodo del péptido E.LCKVASLRE. T, haga clic en el y7 diferenciar iones fragmento
      K [y₇ ]-902.49 + (rank1) [5]
      Tenga en cuenta el aumento de pico de altura y el área.
   2. En el árbol de destino del panel de la izquierda, bajo el 588.30 ++ subnodo del péptido E.LCKVASLRE. T, haga clic en el ion del fragmento no diferenciar y₅ [y₅ ]-575.31 + (fila 6) [1]. Observar que las áreas de pico y cromatogramas de iones y₅ fragmento permanecen en el mismo intervalo para todas las muestras.
   3. En el panel de árbol blanco, navegar a través de otro diferenciar (cociente distinto de 1) y no distinguir (proporción de 1) iones del fragmento y observa los cambios y patrones en el área de pico de la barra gráfica y cromatogramas.
   4. Determinar las zonas de pico exacto para los pares ligeros y pesados de los iones diferenciadores para el cálculo de la estequiometría (para más detalles véase también Meyer et al. ⁴). Haga clic en la "vista | Cuadrícula de documento"y la cuadrícula del documento aparecerá. En la parte superior izquierda de la cuadrícula de documento, haga clic en "puntos de vista | Resultados de la transición"para ver una tabla de varias columna con información de iones fragmento, como secuencia de péptido Precursor mz, nombre de replicar, etc.
   5. Cambiar el formato de informe "pivotear" otra vez clic en "Vistas" en la cuadrícula del documento y seleccionando "Edit View" para abrir la ventana Personalizar vista. En la parte inferior izquierda de la ventana de "Personalizar vista", compruebe el nombre de"replicar de pivote" y seleccione "Ok" para cerrar la ventana Personalizar vista. Observe que ahora la ventana de tabla "Documento red: transición resultados" ha dispuesto volver a agrupar el nombre replicar, tiempo de retención, área, Fondo, columnas de máximo rango a replican (1%, 10%, 50%, 100% succinylation).
   6. Para el péptido "E.LCKVASLRE. "En la tabla"Documento red: transición resultado", encontrar la columna de"Precursores Mz", la columna"Fragmento Ion"y la columna de (succinylation de 1%) del área de 1pct_light_sw1. Observar que hay iones de dos precursores de este péptido, luz (Precursor Mz de 588.30 en las primeras 8 filas) y pesados (Precursor Mz de 590.32 en las último 8 filas).
   7. En la columna "Fragmento Ion", encontrar las dos hileras para el ion de y8 fragmento correspondiente a la luz y los iones pesados del precursor. Desde las mismas filas en la columna de la zona de 1pct_light_sw1, grabar las áreas y8 de la luz (15.820) y pesados (1.426.461).
3. Utilizando estos valores de área máxima, calcular la estequiometría de la succinylation, o la proporción modificada, según la siguiente fórmula y obtener una relación de estequiometría de 0.01, o 1% succinylation, que coincide con la proporción de luz succinylation en esto definido mezcla:
   
4. Calcular la relación de estequiometría para succinylation 10% usando el y8 diferenciador fragmento ion área valores máximos de la columna de área 10pct_light_sw1, 144.953 (luz) y 1.188.041 (pesado), para obtener una relación de 0.10 o 10% succinylation.
5. Calcular la relación de estequiometría para succinylation 100% usando el y8 diferenciador fragmento ion área valores máximos de la columna de área de 100pct_light_sw1, 954.513 (luz) y 16.407 (pesado), para obtener un promedio de 0,98, 98% succinylation.
6. Del mismo modo, calcular la relación de estequiometría para 1% succinylation usando los b3 diferenciador fragmento ion área valores máximos de la columna de área 1pct_light_sw1, 55.697 (luz) y 3.149.119 (pesado), para obtener una proporción de 0,01 o succinylation 1%.
7. Continuar con los cálculos de la relación de estequiometría utilizando la fórmula para todos los iones fragmento diferenciador, iones y y b, para obtener el succinylation de lisina valores de estequiometría para 1, 10, 50 y 100% mezclas de succinylation.

Resultados

Después de la adquisición de datos, distinguiendo los iones fragmento de MS2 se determinaron de los péptidos acilados proteolítica, ion posteriormente extraído cromatogramas (XIC) fueron procesados en el horizonte y la luz correspondiente y áreas de pico pesado que se exportaron Finalmente permite calcular la ocupación del sitio. Figura 2A muestra una ilustración conceptual de cómo puede el XIC ion precursor aparecen ofreciendo ambas señales ligeras y pesadas de péptido, y 2B de la figura presenta un ejemplo del fragmento correspondiente ion XICs con codificación de color (rojo = ligera, azul = pesado ) para diferenciar los iones fragmento que contiene las modificaciones de la acilación de lisina.

Figura 3 muestra los datos resultantes de un experimento de ocupación, tal como se describe anteriormente analizar ratios predefinidos de pesado succinylated BSA generado en la empresa en 1, 10, 50, o 100% y la determinación de la ocupación de succinylation mismo. Importar datos de ocupación DIA en horizonte permite fácil visualización del árbol de destino, mostrando secuencias de péptidos y fragmento de iones tanto para los iones precursores ligeras y pesadas (Figura 3A). Datos del DIA-MS de cada relación succinylated definida BSA immanently revelaron las diferencias relativas en proporción de ligero a pesado y₇ ion, el ion de fragmento diferenciador más alto del ranking de partido identificado péptidos-espectros (indicados en rojo, Figura 3B). La figura 4 muestra un resumen de los resultados procesados desde el cálculo de ocupación de MS2 que confirmó la ocupación de porcentajes de succinylation de proteína entrada, consisten aquí en el BSA de pre-succinylated. Medida lisina succinylation ocupación de 20 péptidos succinylated proteolítica obtenida de BSA comerciales pre-succinylated, succinylated en porcentajes definidos (p. ej., 0, 1, 10, 50 y 100%) se muestran en la tabla 2. Para cada uno de los 20 péptidos proteolíticos de BSA, el más alto ranking, diferenciando MS2 iones fragmento se utilizaron para calcular la ocupación de succinylation (Ksucc) de lisina, como L/(L+H) en %. En general, la cuantificación basada en MS2 demostró muy buena precisión en la determinación de la ocupación de acilación en stoichiometries baja.

Figura 1: flujo de trabajo de Stoichiometry. (A) las proteínas se someten tres veces con anhídrido acético -d₆ a acetylate residuos lisina sin modificar. Siguiente, acetiladas proteínas son digeridas con endoproteinasas Glu-C, seguido por el fraccionamiento de HPLC de los péptidos proteolíticos usando la cromatografía de fase inversa basic-pH. Por último, los péptidos son analizados por LC-MS con diámetro de anchos de ventana variable precursor. (B) el mismo flujo de trabajo se utiliza para determinar la estequiometría de la succinylation como se describe en (A), excepto el reactivo de acilación pesado se cambia a succínico anhídrido -d₄. Figura adaptada de Meyer et al. ⁴ (j AM SOC. Misa Spectrom., libre elección). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: ejemplo de datos obtenidos y los cálculos de estequiometría. (A) luz (L) y pesadas (H) MS1 precursor los iones que contengan lisina acetilado difieren en 3 unidades de masa. XICs se generan para sobres isótopos ligeros y pesados indicados en rojo y azul, respectivamente. (B) cuantificación de MS2 iones fragmento XICs de adquisiciones de diámetro se pueden realizar 'diferenciar' iones fragmento liviano y pesado que contienen el sitio de acetilación indicado en rojo y azul. Iones fragmento común se muestran en negro punteado y que contienen el sitio de modificación. Figura adaptada de Meyer et al. ⁴ (j AM SOC. Misa Spectrom., libre elección). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: visualización del horizonte de succinylated péptido proteolítico de BSA en niveles de ocupación diferentes. (A) Skyline blanco árbol mostrando el péptido proteolítico iones del fragmento de la LCKsuccVASLRE y su resultado. Horizonte (B) extrajeron los cromatogramas de iones fragmento en diferentes niveles de ocupación succinylation. El ión diferenciador ordenado más alta, y₇, aumenta en área de pico de 1, 10, 50 y 100% de correlación con el porcentaje de entrada de BSA pre-succinylated (generado en la empresa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: evaluación de estequiometría de Acilación de BSA de BSA de pre-succinylated. Cinco diferentes muestras de BSA en porcentajes definidos de modificación pesado (por ej., 0, 1, 10, 50 y 100%) fueron sometidos a determinación de la ocupación de MS2. Ocupación de sitio para 20 succinylated péptidos de BSA se determinaron de los ordenada más alta diferenciador iones fragmento para cinco diferentes muestras de BSA en porcentajes definidos de ligera modificación (por ejemplo, 0, 1, 10, 50 y 100%). La trama de la barba de cuadro muestra la distribución de los péptidos de succinyl 20 valores del 50% de los péptidos se encuentran en la 'caja' (percentil 25% a 75% percentil), la barba superior indica los valores del percentil 75% máximo (100%) y el bigote inferior indica los valores del percentil 25% mínimo (0% percentil). (J. am. soc. Misa Spectrom., opción abierta). Cuantificación de las medidas puede encontrarse en la tabla 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tiempo (minutos)	% A	% B
0.00	100	0
7,27	92	8
45.27	73	27
49.27	69	31
65,27	61	39
72.27	40	60
80.00	10	90
85.00	10	90
86.00	100	0
120.00	100	0
Flujo: 0,7 mL/min
Tampón A: formiato de amonio de 10 mM en agua, pH 10
Tampón B: formiato de amonio de 10 mM en 90% de ACN y 10% agua, pH 10
Nota: Ajusta el pH de ambas fases móviles a 10 con amoníaco limpio

Tabla 1: gradiente para offline fraccionamiento de HPLC de fase inversa basic-pH. Longitud gradiente: formiato de amonio 120 min tampón A: 10 mM en agua, pH 10. Tampón B: formiato de amonio de 10 mM en 90% de ACN y 10% agua, pH 10.

L / L + H en %	L / L + H en %	L / L + H en %	L / L + H en %	L / L + H en %
Ksucc 0%	Ksucc 1%	Ksucc 10%	Ksucc 50%	Ksucc 100%
0.2	1.7	11.1	50.9	99.2
1.2	2.3	12.3	49.4	97.6
2.9	3.8	14	48.6	99.5
0.5	1.8	11.7	50.8	99.5
0.2	1.7	11.1	48.3	98.2
0.2	1.2	11	47.5	96.1
0.3	1.6	12.8	51	99.2
3.7	5.2	14.7	51.9	89.5
1.5	1.8	12.5	47.2	91.1
0,8	1.5	11.3	48.4	96,8
0.2	1.6	13.9	49,7	98.9
0.1	1.1	10.7	48.2	98.6
0.2	0,9	10.3	49.4	99.4
0.5	2.5	17.2	52.3	97.5
0.1	3.5	20.8	51	99
0.3	1.9	10.7	49.6	98.2
2	1.7	10.9	47.7	96.3
0.3	1.2	10	53	98
1.1	1.8	12.9	57.9	94.1
0.2	1.4	11.6	48.6	98.8

Tabla 2: cuantificación de la ocupación de succinylation BSA medida de la lisina para péptidos proteolíticos succinylated 20. Succinylated péptidos obtenidos de BSA comerciales pre-succinylated, succinylated en porcentajes definidos (p. ej., 0, 1, 10, 50 y 100%). Para cada uno de los 20 péptidos proteolíticos de BSA, el más alto ranking, diferenciando MS2 iones fragmento se utilizaron para calcular la ocupación de succinylation (Ksucc) de lisina, como L/(L+H) en %.

Discusión

Este protocolo proporciona un novedoso y preciso método para cuantificar la acetilación de la lisina específica y ocupación succinylation que puede aplicarse a un proteoma completo. Este método se basa en la medición de péptidos luz endógenas y exógenas péptidos pesados, el último de los cuales es generados en vitro con acilación química cuantitativa de proteínas deuterados anhídrido acético -d₆ o succínico anhídrido -d₄ (figura 1). Métodos similares han utilizado etiquetado isotópico estable de residuos de lisina nativos y realiza la cuantificación de la ocupación de sitio basada en ya sea precursor ion sólo¹² o fragmento iones del PDD adquisiciones^13,14. Este protocolo aplica varios pasos durante la preparación de la muestra para mejorar la eficiencia de la acilación y extiende el etiquetado de productos químicos a succinylation. Colección de datos mediante adquisiciones DIA obtiene ion precursor y fragmento de MS2 intensidades de iones sobre la gama entera de masa detectable, reduciendo así las interferencias de iones fragmento. Análisis y cuantificación via horizonte y scripts personalizados desarrollados permiten el cálculo de ocupación de sitio para péptidos que contienen más de un residuo de lisina y acilación más de uno en uno.

Hay varios pasos críticos durante la etapa de preparación de muestra de este protocolo que debe seguirse de cerca. Puesto que el conjunto del Protocolo se basa en la modificación química eficiente de todos los residuos de lisina, este paso es de suma importancia. Anhídridos reaccionan con aminas libres, así que contiene amina buffer o contaminante las moléculas en el lisado de proteínas se deben evitar. También durante la etapa química por acilación, asegúrese de que el pH de la mezcla de reacción se ajusta a pH 8 después de cada una de las tres incubaciones con reactivo de anhídrido como esta reacción acidifica la mezcla, y acilación O reacciones secundarias pueden formar. Además, la dilución de la 8 M urea que contiene mezcla de reacción a alrededor de 0,8 M de urea antes de la digestión y comprobar que el pH esté dentro del rango óptimo es importante para la actividad óptima de endoproteinasas Glu-C. Otro componente clave de nuestro protocolo es el paso de la colección de datos y la introducción de un flujo de trabajo DIA, que supera cualquier inconsistencia de muestreo de datos DDA y que permite la cuantificación en el nivel de iones fragmento de MS2. Una de las ventajas principales de la metodología DIA es la disminución de interferencias que suelen ser mucho más problemático y propenso al cuantificar la señal de ion precursor de MS1 (como han sugerido algunos de las publicaciones anteriores).

Pueden hacerse varias modificaciones al flujo de trabajo durante la preparación de muestras altamente complejas. El número de fracciones agrupados después de que el fraccionamiento de HPLC de fase inversa basic-pH sin conexión puede reducirse para disminuir la complejidad de las muestras agrupadas que será adquirida por LC/MS. Adicionalmente, ya cromatográfico gradientes puede también ser utilizado durante adquisición para permitir la mejor separación del péptido. Como alternativa, pueden usarse varias proteasas para digerir muestras para producir una mayor variedad de péptidos exfoliados y aumentar la cobertura de los residuos de lisina de la proteína. Pistas de ensayo y optimización pueden realizarse utilizando BSA comercial que contengan porcentajes específicos de acetilación o succinylation.

Una limitación en el presente Protocolo es sobreestimación de ocupación del sitio potencialmente leve debido a otras modificaciones de la lisina, como la metilación o ubiquitinación, etc., en el mismo sitio⁴cuyo paradero se desconoce. Calculada a partir de las áreas pico de modificaciones ligeras y pesadas acil, L/(L+H), la ocupación del sitio se basa en la suposición de que el nivel total de modificación en un sitio de lisina consiste en sólo endógeno acilación 'light' (L) y químicamente con la etiqueta 'pesada' acilación (H). Sin embargo, la ocupación de acilación total real en un sitio en vivo puede incluir otras modificaciones más allá de la acetilación o succinylation. Además, la pureza isotópica divulgada de los reactivos comprados anhídrido acético -d₆ (99%) y el succínico anhídrido -d₄ (> 98%) puede contribuir a una pequeña sobrestimación de hasta el 2% (succinyl) o 1% (acetilo) de la nivel⁴de acilación endógena. Juntos, estas sobrestimaciones ligeras añadir a la dificultad en la cuantificación de sitios con menos del 1% ocupación. Gran abundancia diferencias la completa químicamente péptidos acilados y los péptidos acilados nativo también contribuyen a posibles errores de cuantificación de ocupación del sitio, especialmente para los de péptidos acilados endógena baja²⁷. Un estudio reciente de Weinert et al. ²⁷ halló que abundancia disminuida diferencias entre péptidos acetilado por completo pueden reducir el error de cuantificación²⁷.

Cuantificaciones de la estequiometría se reunieron mediante este protocolo pueden señalar puntos importantes acilación en una hipótesis particular de proteína y forma para experimentos biológicos de seguimiento, tales como mutagénesis sitio-dirigida de algunos sitios de interés. Este protocolo también podría revelar efectos combinados de la acilación baja sitios de estequiometría que podrían ejercer influencias indirectas o sutiles en la estabilidad estructural de proteínas y localizan entornos celulares. Además, aplicación del presente Protocolo para medir la acetilación y succinylation y otras modificaciones de la acilación de lisina posible más allá de acetilación únicamente ofrece conocimientos sobre los efectos de la dinámica de la acilación en proteínas en diferentes condiciones biológicas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
anhídrido acético acuoso-d6	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	175641-1G	1% de pureza isotópica
anhídrido succínico-d4	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU	. 293741	2% de pureza isotópica
endoproteinasa de grado de secuenciación Glu-C Roche	, Indianápolis, IN, EE. UU. (a través de Sigma)	10791156001	Proporción de proteasa a proteína de sustrato 1:50 (wt:wt)
Cartuchos de extracción en fase sólida (SPE) de Oasis HLB	Waters Corp., Milford, MA, EE. UU	WAT
acetonitrilo HPLC	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, EE. UU	. BJAH015-4
agua de grado HPLC	Burdick y Jackson, Muskegon, MI, EE. UU	. BJAH365-4
yodoacetamida	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	I1149-25G
ditiotreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	D9779-5G
FLUKA ácido fórmico (FA) para espectrometría de masas	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, EE. UU	. C988C27	~98%
urea	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU	PI29700
albúmina sérica bovina (BSA)	Pierce, Rockford, Illinois, EE. UU.	88341
bicarbonato de trietilamonio (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	T7408-100ML
dimetilsulfóxido anhidro (DMSO)	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, EE. UU	43998
hidróxido de sodio (NaOH)	EMDMillipore, Burlington, MA, EE. UU	SX0590
Solución de hidroxilamina al 50% en agua	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	438227-50 ml
Agua de grado LC-MS	Burdick y Jackson, Muskegon, MI, EE. UU.	BJLC365-4
LC-MS acetonitrilo	Burdick y Jackson, Muskegon, MI, EE. UU.	BJLC015-4
Eppendorf Themomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania	T1317-1EA
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Concentrador SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	SPD131DDA-115
Sistema de bomba de HPLC binario Waters 1525	Waters Corp., Milford, MA, EE. UU	. WAT022939
Detector UV de doble longitud de onda Waters 2487	Waters Corp., Milford, MA, EE. UU	. WAT081110
Muestreador automático Waters 717plus	Waters Corp., Milford, MA, EE. UU	Colector
Waters III	Waters Corp., Milford, MA, 186001878 de EE. UU.
Sistema de HPLC Ultra Plus nano-LC 2D	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, EE. UU	MODELO# 845
de vuelo cuadrupolar ortogonal (QqTOF) espectrómetro de masas TripleTOF 5600	Sciex LLC, Framingham, MA, EE. UU	por cotización
de vuelo cuadrupolo ortogonal (QqTOF) Espectrómetro de masas TripleTOF 6600	Sciex LLC, Framingham, MA, EE. UU	. por cotización
Chip de precolumna C18 (200 μ m × Chip ChromXP C18-CL de 6 mm, 3 μ m, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, EE. UU.	804-00006
SWATH 2.0 complemento en PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, EE. UU	. descarga de software Sciex
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zúrich, Suiza	Sw-3001
C18-CL chip (75 y micro; m x 15 cm ChromXP, 3 y micro; m, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, EE. UU	. 804-00001