La identificación precisa de las células satélite es fundamental para el estudio de sus funciones bajo varias condiciones fisiológicas y patológicas. Este artículo presenta un protocolo para identificar las células satélite en secciones del músculo esquelético adulto por tinción de inmunofluorescencia.
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Artículo de método
Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La inmunofluorescencia es un método eficaz que ayuda a identificar los diferentes tipos de células en cortes de tejidos. Para estudiar la población de células deseada, anticuerpos para marcadores de células específicas se aplican en secciones de tejidos. En el músculo esquelético adulto, las células satélites (SCs) son células que contribuyen a la regeneración y reparación del músculo. Por lo tanto, es importante visualizar y localizar la población de células satélite en diferentes condiciones fisiológicas. En músculo esquelético en reposo, SCs residen entre la lámina basal y la membrana del plasma del myofiber. Un marcador utilizado para la identificación de SCs en la myofibers o en cultivo celular es la caja apareados proteína Pax7. En este artículo, se presenta un protocolo optimizado de inmunofluorescencia Pax7 en secciones del músculo esquelético que minimiza la tinción inespecífica y fondo. Otro anticuerpo que reconoce una proteína (laminina) de la lámina basal también se agregó ayudar a identificar protocolos SCs. Similar puede emplearse para realizar doble o triple de etiquetado con Pax7 y anticuerpos para proteínas adicionales de interés.
Introducción
Músculo esquelético está compuesto por células multinucleadas musculares, llamado miotubos, organizado en myofibers, que generan fuerza y movimientos a través de la contracción. Más los músculos esqueléticos, excepto algunos músculos craneofaciales, se derivan de una estructura embrionaria temporal llamada un somite1. Células precursoras miógenas delaminate de la somite epitelial para convertirse en mioblastos. Mioblastos: más se diferencia en miocitos que se fusionan para convertirse en miotubos para formar myofibers multi-nucleated. El proceso anterior se llama miogénesis y se caracteriza por el control temporal regulado de la expresión génic....
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Protocolo
En el presente Protocolo, los músculos de extremidades anteriores de ratones adultos (2-6 meses), tibial anterior (TA) y extensor digitorum longus (EDL), fueron empleados como ejemplo para realizar la inmunofluorescencia que manchaba en las SCs. Todos los pasos manejo de ratones y músculo disecciones de tejidos han sido aprobadas por el cuidado Animal y uso Comité (ACUC) de NIAMS/NIH.
1. disecar el músculo EDL/TA de la extremidades del ratón
- Eutanasia el ratón en una cámara de llenado eutanasia CO2 bajo los lineamientos de la ACUC del NIH. Si es necesario, llevar a cabo la dislocación cervical.
- Ponga el ratón ....
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Resultados
Siguiendo los pasos anteriores, se pueden visualizar con éxito SCs en adultos secciones musculares descanso bajo un microscopio de fluorescencia (figura 1). Aunque el tejido muscular adulto tiene auto-fluorescencia fuerte en cierto tipo de fibras, los tintes brillantes de serie Alexa pueden superar el ruido de fondo y la señal está parado hacia fuera (figura 1A, B, flecha). La microscopía confocal de dos fotones .......
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Discusión
El protocolo anterior se basó en un método de tinción MF20/Pax7 en pez cebra músculo esquelético12. Las soluciones utilizan y el bloqueo de pasos son idénticos o similares. Los anticuerpos utilizados son idénticos. Los pasos ajustados se basaron en las características del tejido de músculo de ratón y SCs. En primer lugar, laminina anticuerpo fue agregado en la mezcla para ayudar a visualizar y confirmar la posición del SCs. Fue especialmente útil contar el número de CS al microscopio cuando se uti.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a la sección de proyección de imagen de luz de NIAMS para proporcionar la ayuda técnica y microscopios. Los anticuerpos MF20 y Pax7 se obtuvieron de estudios hibridoma Banco desarrollo desarrollado bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por el Departamento de ciencias biológicas, la Universidad de Iowa, Iowa City. Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación intramuros de NIAMS de los institutos nacionales de salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| metilbutano | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Temperatura óptima de corte (O.C.T.) compuesto | Ciencias de la microscopía electrónica | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Suero de cabra normal | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment de cabra Anti-Ratón IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Tampón de citrato | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 anticuerpo monoclonal de ratón (IgG1) (sobrenadante) | Estudio de desarrollo Banco de hibridomas | N/A | |
| Anticuerpo policlonal de conejo laminín | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 anticuerpo monoclonal de ratón (IgG2b) (sobrenadante) | Estudio del desarrollo Hibridoma Banco | N/A | |
| Anticuerpo secundario de absorción cruzada IgG1 anti-Cabra anti-Ratón, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Anticuerpo secundario de absorción cruzada b, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Anticuerpo secundario de IgG (H+L) anti-Conejo de cabra altamente adsorbido, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 | |||
| fluorescente de campo amplio Leica DM6000 | |||
| fluorescente de campo amplio Leica DMR | |||
| Microscopio | |||
| Microscopio | |||
| Olla | a presión electrónica Cuisinart |
Referencias
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell D....
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Reimpresiones y permisos
