Summary
En mikroflödessystem kanal med deformerbar sidoväggarna erbjuder flödeskontroll, partikel hantering, kanal dimension anpassning och andra omkonfigurationer under användning. Vi beskriver en metod för att tillverka en mikroflödessystem kanal med sidoväggarna av en matris med pins som tillåter sin form för att ändra.
Abstract
Mikroflödessystem komponenter behöver ha olika former att förverkliga olika viktiga mikroflödessystem funktioner såsom blandning, separation, partikel svällning eller reaktioner. En mikroflödessystem kanal som deformerar även efter tillverkning samtidigt behålla kanalformen möjliggör hög spatiotemporal omkonfigurerbarheten. Denna omkonfigurerbarheten krävs i sådana viktiga mikroflödessystem funktioner som är svåra att uppnå i befintliga system för ”omkonfigurerbara” eller ”integrerade” mikrofabricerade. Vi beskriver en metod för tillverkning av en mikroflödessystem kanal med en deformerbar sidovägg bestående av ett sido anpassat utbud av ändarna av rektangulära stift. Ansättes stiften i deras längsgående riktningar ändrar stiften ändlägena, och därmed formen på discretized kanal sidoväggarna. PIN-luckor kan orsaka oönskat läckage eller vidhäftning till angränsande stift orsakas av menisken krafter. För att stänga pin luckorna, har vi infört kolväte-fluorpolymer suspension-baserade luckutfyllare åtföljs av en elastomer barriär. Omkonfigurerbara mikroflödessystem enheten kan generera starka tidsmässiga in-kanal förskjutning flöde, eller kan stoppa flödet i någon region i kanalen. Denna funktion underlättar, på begäran, hantering av celler, viskösa vätskor, gasbubblor och icke-vätskor, även om deras existens eller beteende är okänd vid tidpunkten för tillverkning.
Introduction
Mikroflödessystem enheter - micro-storlek som styr små mängder vätska och deras flöden - erbjuda miniatyrisering av biomedicinska förfaranden till ett ”chip” format med ökad bärbarhet och, ofta, överkomliga priser. Enligt en senaste granskning1, har olika mikroflödessystem komponenter bestående av utrymmen och positiva egenskaper utvecklats för att förverkliga grundläggande och viktiga fluidic funktioner såsom blandning, separation, partikel svällning eller reaktioner.
Medan beteendet hos många mikroflödessystem enheter bestäms på projekteringsstadiet, tillåta vissa typer av mikrofabricerade enheter efter tillverkning ändringar av deras struktur eller beteende. Här hänvisar vi till denna funktion som ”omkonfigurerbarheten”. Omkonfigurerbarheten av mikrofabricerade system generellt minskar tiden och kostnaden som krävs för att utforma en enhet eller möjliggör anpassning av mikrofabricerade layout eller funktioner med tiden.
Tidigare beskrivits omkonfigurerbara mikroflödessystem enheter delas in i följande tre kategorier. Första tillåter deformation av elastomer kanaler flöde och riktningar ändras under användning. För att få omkonfigurerbarheten, är elastomer kanaler deformerade av olika externa och kontrollerbar styrkor såsom pneumatisk press källor2, Braille manöverdon3eller tätning4-komprimering. I andra, omkonfigurerbara enheter lita på modulära konstruktioner, såsom multi-layer fluidic kretsar, modulära kanaler med magnetiska interconnects, och slangar-baserade mikrofluidik5. I tredje, själva enheten är inte omkonfigurerbara, men microdroplet transport på elektroden matriser (ofta kallad digital mikrofluidik)6,7 och hängande droppe-baserade mikroflödessystem enheter8 aktivera på begäran växling av flödet eller rutten av vätska.
Många av dessa omkonfigurationer är ändå begränsad på topologiska och makroskopisk nivå. Exempelvis många integrerade mikroflödessystem enheter stoppa flödet eller ändra flödesriktningen genom kollapsa mikrokanaler i fördefinierade regioner. Position och antal regioner att vara kollapsade är dock inte omkonfigurerbara. Även om den digitala mikrofluidik har en mängd vätskehantering förmågor, bör möjliga flöden begränsas till stor del av volymen av varje droppe. När celler odlas i sådana droppar av cell kultur media, behövs dessutom extra ansträngning att hindra avdunstning och gas försvinnande från droppar och undvika osmolalitet chock och plötsliga pH förändring.
För att förverkliga kanal funktionen-nivå omkonfigurerbarheten, föreslog vi en mikroflödessystem enhet med lös sidoväggar som bestod av matriser av maskinelement dynamiskt konfigurera om dem när du är i användning9. För att bilda en deformerbar sidovägg, var små rektangulära stift uppradade så att varje ände av stiften definieras ett segment av däcksidan. Glidande stiften tillåtna deformation av däcksidan som tillät transport eller mallning av celler, bubblor och partiklar inuti kanalen. För att minimera död volym och maximera omkonfigurerbarheten, hade avståndet mellan intilliggande stiften minimeras. Dock stark kapillärkraften som agerar på små luckor mellan stift ansluter insidan och utanför microchannel orsakar läckage av vätska in pin klyftan, orsakar media avdunstning, bakteriell eller cytotoxisk kontaminering, och så småningom cellen döden. Därför har vi utvecklat läckfria discretized sidovägg-typ omkonfigurerbara mikroflödessystem kanaler att motstår cykliska pin åtgärder och långsiktiga cell kultur10.
I denna artikel ger vi ett protokoll för att bygga mikroflödessystem cell kultur enhet med en discretized sidovägg som kan konfigureras efter den gradvisa ökningen området cell kultur. Täthet av diskret kanal sidoväggarna testas med hjälp av fluorescens imaging. Cellkultur förenlighet och möjligheten för cellen mallning utvärderas med hjälp på chip cellodling.
Detta mikroflödessystem system är lämpligt när lämplig kanal design kan inte vara förutbestämt och måste ändras på begäran. Till exempel detta system skulle kunna användas att justera kanal bredd och flöde baserat på celltillväxt eller migration, flöde eller fälla aktiva nematoder eller andra små föremål som beter sig oväntat i kanalen, eller att acceptera olika raw-prover eller bioproducts som tänktes inte ännu vid tiden för design.
Protocol
1. etsning av Pins (figur 2A)
- Avfetta rektangulära stift genom nedsänkning i aceton.
- Passiverande stiften genom nedsänkning i 4 mL 10% salpetersyra och sedan värma lösningen vid 65 ° C i 30 min i ugn.
- Sonikera stiften i avjoniserat vatten för 5 min att ta bort kvarvarande syra och torka med hushållspapper. Sänk ner stiften i 0,5 mL av mögel släppmedel för 2 h.Sonicate stiften i avjoniserat vatten i 5 min.
- Tillverka en etsning maträtt (figur 2C).
- Rita eller inskriva två parallella linjer med ett 4 mm mellanrum på en glasskiva som använder en linjal.
- Tillämpas ett kemiskt resistenta och låg viskositet lim på en yta av två rektangulära skära täckglas.
- Bond de två skär täckglas i glas bilden på en 4 mm gap. Använd den parallella linjen som en guide.
- Dosera två rader av silikon lim på etsning skålen (se figur 2C position och storlek av kontur).
Obs: En 3D-tryckt mall (en STL modellfil ingår som ett kompletterande material) hjälper rita linjer enkelt och exakt. - Sätt stiften på etsning skålen så att den 2 mm långa tipsen om deras raka ändar är nedsänkt i självhäftande linjemönster. Fördela limmet igen för att säkerställa att stiften täcks helt och rita en kontur. Överföra etsning skålen till en befuktade fermenteren värms upp till 38 ° C. Vänta över natten för att bota limmet.
- Tillsätt 0,2 mL 0,5 M salpetersyra till 0,2 mL 5.0 M saltsyra långsamt i en injektionsflaska av glas.
Varning: Blandningen, även känd som kungsvatten, som är mycket frätande och explosiva. Bära syrafasta gummihandskar och skyddsglasögon och vara mycket försiktig när du hanterar syror. Förvara aldrig lösningen. Minska salpetersyra som möjligt för att minska sin aggressivitet. - Sätta etsning skålen på en värmeplatta värms upp till 65 ° C. Häll 0,4 mL syra blandningen över regionen avtäckta av stiften. Vänta 10 min och överföra syran till en bägare.
- Neutralisera alla återstående syran inklusive regionen etsade stift med 5 mL natriumbikarbonatlösning 0.8 M i avjoniserat vatten.
- Ta bort stiften från etsning skålen genom att dra stiften longitudinellt med pincett. Sonikera stiften i avjoniserat vatten för 5 min följt av ultraljudsbehandling i aceton i 5 min.
- Passiverande etsade regionen av stiften som i steg 1.2.
- Kontrollera bredden på etsade stiften med en shop Mikroskop med riktmedel. Justera etsning tiden beskrivs i 1.7 så att bredden på den etsade regionen är 0,2 ± 0,02 mm.
- Överföra stiften till en injektionsflaska av glas innehållande 5 ml 70% etanol. Låt injektionsflaskan till en laminär huva. Plocka upp stiften ur injektionsflaskan och låt dem torka.
2. tillverkning av silikon platta med reservoarer och en plats för Pins.
- Tillverka en mögel för ett utrymme för pins och en fast sidovägg av typiska litografiska processer.
- Coat en avfettade glasskiva med 1 mL av negativa epoxi fotoresist använder en spin coater vid 1000 rpm. Torka fotoresist på 95 ° C varma ytor för 15 min. Upprepa detta steg en gång.
- Spin rock det tredje lagret av den samma fotoresist vid 2.000 rpm i glas-bilden med belagda fotoresist. Torka fotoresist på en 95 ° C värmeplatta för 30 min.
- Exponera fotoresist lagret till 450 mJ/cm2 av 365-nm ultraviolett ljus från en UV spot ljuskälla genom en photoplotted film. Baka den exponerade fotoresist på en 95 ° C värmeplatta för 15 min. utveckla fotoresist genom sprutning lösningsmedel (2-metoxi-1-metyletylacetat) använder en hand spruta och föna med kvävgas.
- Placera glasskiva med mönstrade fotoresist längst ned i en plast skål.
- Häll prepolymer av Polydimetylsiloxan (PDMS) på formen till en tjocklek av 3 mm. Debubble PDMS prepolymer i vakuum exsickator-800 kPa i 10 min.
- Bota PDMS prepolymer i en ugn vid 65 ° C under 1 h. Demold delvis härdade PDMS plattan med en skalpell. Helt bota PDMS i en ugn vid 120° C i 1 h.
- Längs den riktlinje mönstret, trimma bort ojämna kanter från PDMS plattan med den samma skalpell. Göra så exakt och ren ett snitt som möjligt, särskilt vid ytan som definierar den insättning kortplatsen (se figur 1A) för stiften.
- Perforate 2 mm diameter hål för inlopp/utlopp i ändarna på den viktigaste kanalen för PDMS plattan med hjälp av biopsi stämplingar. Likaså perforate 1 mm-dimeter hål i ändarna på vent luftkanalen. Se figur 1 för layouten kanal och placeringen av dessa hål.
3. montering av enheten med på plats tillverkning av slavsändaren och barriär.
- Tillverka en microchannel församling.
- Fördjupa en 10 × 20 mm nr 4 täckglas i en rengöringslösning som värms upp till 60 ° C i 10 min.
- Skölj täckglas med avjoniserat vatten två gånger och torka vid 120 ° C i 10 min.
- Plasma-bond PDMS plattan till ett täckglas:
- Placera PDMS plattan (kanal funktionen sidan uppåt) och de rengjorda 10 × 20 mm nr 4 täckglas i en fräsande bestrykare vakuum kammare.
- Börjar pumpa ner kammaren till 60 Pa. generera luft vakuum plasma (20 mA) för 30 s.
- Omedelbart vädra kammaren. Bond kanal funktionen sidan av PDMS slab till täckglas med sina kanter linje.
- Placera de bundna lagrarna i en 65 ° C ugn i 10 min.
- Föra de bundna lagrarna till en laminär huva med hjälp av en steril behållare. Sterilisera dem med UV-ljus för 30 min.
- I den laminar huvan, in stiften i facket så att deras ändar bilda andra sidoväggen av microchannel. Angränsande stift bör vara olika i längd för att undvika kontakt med både vertikal ändarna (se figur 1B). Stora avstånd mellan de vertikala ändarna är att föredra. Ett utrymme av (N-1) × (pin bredd) är möjligt när N typer av stift med olika pin längder (L i figur 2A) är förberedda.
- Tillverka en bas ( figur 2B).
- Göra eller läsa en delfil av basen och göra två numerisk styrning (NC) filer (innehållande verktygsbanor; ingår som kompletterande material) med CAD/CAM programvara. Den första kompletterande NC filen använder en 4 mm diameter pinnfräs och den andra en 1 mm diameter slut mill.
- Klämma en 3 mm tjock klar polymetylmetakrylat (PMMA) ombord på en CNC-fräs.
- Öppna den första NC på handkontrollen på en dator NC (CNC) kvarn. Installera en 4 mm pinnfräs till CNC mill och leta upp en del noll genom att trycka på pinnfräsen till PMMA styrelsen. Kör NC kod för att skära skivan.
Obs: Blåsa ibland slutet mill spetsen med komprimerad luft för kylning och chip borttagning. - Upprepa 3.2.3 använda den andra NC filen och en 1 mm pinnfräs.
- Avfetta de maskinbearbetade delarna med rengöringsmedel och torka med hushållspapper. Spraya delar med 70% etanol och föra dem till en laminär huva.
- Tillverka en pin slavsändaren och elastomeriska barriär:
Obs: Steg 3.3.1 - 3.3.7 bör utföras aseptiskt i en laminär huva.- Förbered luckutfyllare genom att blanda vit petrolatum och polytetrafluoreten pulver i förhållandet 2:1 viktprocent. Homogenisera blandningen med hjälp av ett ultraljud Homogenisatorer.
- Häll slavsändaren i en dispenser spruta. Infoga en kolv och skjut att fylla spetsen av sprutan. Sätt fast en nål och tryck in kolven igen tills nålens spets är fylld. Jämväl, förbereda en dispenser spruta med kolv och en nål, och fyll med silikon lim.
- Anslut varje spruta till en pneumatisk automat med hjälp av en adapter röret. Justera dispensering trycket för silikon lim och spackel till 250 kPa och 280 kPa.
- Dosera silikon lim till kanten av en ficka av basen. Placera en 10 × 20 mm No.4 täckglas på fickan och tryck fast att bond.
- Dosera silikon lim till ett djup av cirka 1 mm Rita två segment längs två yttre platser av basen. Dosera luckutfyllare till ett djup av cirka 1 mm, för att rita segment längs det andra uttaget.
- Dosera silikon lim till kanten av en annan pocket. Placera en microchannel församling (3.1) på fickan och tryck fast att bond.
- Upprepa 3.3.5 för att säkerställa att både slavsändaren och silikon lim fullt bädda in stiften och det finns ingen öppning på slots.
- Försätta enheten i en steril behållare såsom en rostfri låda med lock. Överföra behållaren till en befuktade fermenteren värms upp till 38 ° C. I laminar huven, bota elastomeriska barriären för en dag.
- Flytta varje fästa upp till 1 mm längs angränsande stift att släppa stiften från härdade elastomeriska barriären.
- Sterilisera enheten med UV-ljus för 30 min.
4. utvärdering av enhetens mikrofabricerade
- Upptäcka läckage med hjälp av fluorescens
- Öppna den microchannel använder ett bra verktyg eller en stationär robot. Gör kanalbredd som konsekvent genom hela kanalen som möjligt.
- Späd en grön fluorescerande färg med avjoniserat vatten vid 10 µM att göra fluorescens lösning.
- Lägga till fluorescens lösning till ett slutet hamnar i microchannel med en micropipettor. Detta steg kommer att fylla kanalen med lösningen.
- Sätta mikroflödessystem enheten och två bitar av absorberande papper vått med avjoniserat vatten i en stor plast maträtt. Inkubera skålen vid 37 ° C och 5% CO2 under minst 24 h.
- Spela in grön fluorescens bilder av microchannel med en inverterad fluorescerande Mikroskop med en Mikroskop kamera.
- Öppna de fluorescerande bilderna med en lämplig bild analys programvara och bekräfta det finns inget läckage (grön fluorescens) på gränssnittet för slavsändaren och stiften.
- Utsäde celler till microchannel.
- Förbereda en cell kultur fartyg som innehåller 70-80% konfluenta celler (beroende på celltyper). Lossa och avbryta cellerna i odlingsmedium.
- Centrifugera cellerna (hastighet och tid beror på celltyper) och aspirera medium.
- Att resuspendera cellerna med en liten mängd av medium. Räkna cellerna med en cell räknare och justera cell densiteten från 1,5 × 10-6 till 1,5 × 107 celler/mL.
- Öppna den microchannel använder ett bra verktyg eller en stationär robot (figur 1B) för att göra en rak 400 µm-hela kanal. Justera pin positioner för att göra däcksidan som platt hela kanalen som möjligt. Lägg till cellsuspension slutet porten av microchannel och fyll kanalen.
- Leta upp ett av stiften som definierar däcksidan i regionen att starta kultur. Under en inverterade Mikroskop, nära de två angränsande stift för att innesluta cellerna i regionen cell kultur.
- Stäng alla pins från i ordning från inre till yttre att utvisa alla celler från kanalen. Försiktigt aspirera suspension från slutet hamnar, och lägga till medel till dem.
- Inkubera enheten enligt beskrivningen i 4.1.4. När cellerna är ca 70-80% konfluenta, öppna långsamt en PIN-kod för att vidga kulturområdet.
Representative Results
Byggandet av den omkonfigurerbara microchannel visas i figur 1. Flera rektangulära stift placerades på en glass substrate och var uppradade så att långsidan av stiften var i kontakt. Ett PDMS blad med stansade hål och en ta paus av samma djup som pin höjden omfattas ändarna av stiften bilda kanal inlopp/utlopp reservoarerna, kanal tak, och en annan sidovägg motsatt kanal väggen som bestod av stiften. Den region som omges av pins, en vägg (en av ansiktena bladet PDMS) och glassubstrat bildar en mikroflödessystem kanal.
Som tidigare beskrivits uppnås omkonfigurerbarheten av föreslagna mikroflödessystem systemet genom många små stift placeras parallellt med mycket liten men noll luckor. Problemet i tidigare rapporter var det starka flödet som genereras genom luckorna av kapillär effekten. För att lösa detta problem, fylldes först luckorna med en luckutfyllare. I detta protokoll användes en skingra blandning av trögflytande kolväte och fluorpolymer pulver som en luckutfyllare. Dock slavsändaren i sig är också föremål för kapillär effekten. Som visas i figur 1, har därför den resulterande omkonfigurerbara microchannel både kolväte/fluorpolymer slavsändaren och en elastomer barriär bildas runt den yttre omkretsen av slavsändaren. Gallring i mitten av stiften som behövs för att rymma en tillräcklig mängd luckutfyllare att säkerställa tjocklek och styrka av elastomer barriären mellan två stift.
Figur 2 A visar en teckning av en pin som bildar en sidovägg segment. Rostfritt stål klass 316L valdes som materialet på grund av dess korrosionsbeständiga och låg urlakning boenden. Dock krävdes en extra passivering process att göra pins cellkultur kompatibla. En PIN-kod måste ha ett exakt rektangulära tips utan grader att framgångsrikt bilda en sidovägg segment. Dessutom måste en PIN-kod ha ett ”handtag” så att PIN-koden kan enkelt flyttas genom att trycka handtaget. Eftersom varje pin har en smal mitten, var tjockleken av elastomer mellan stift nog att motstå skjuvning orsakad av PIN-rörelse. Till skillnad från andra delar bestående av enheten, bör tillverkning av pins, utom mellersta gallring, beställas från ett företag som specialiserat sig på elektrisk urladdning bearbetning (EDM) eftersom det är en av de mest exakta och kostnadseffektiva metoderna för bearbetning av små delar av hårda metaller. Utför mellersta gallring av etsning själv minskar kostnaden för maskinbearbetning och risken för att böja eller bryta under bearbetning.
För att bekräfta att slavsändaren elastomeriska barriären och så småningom vattentäthet av den omkonfigurerbara microchannel fungera, användes läcksökning av fluorescens. Figur 3 visar en fluorescens bild av området nära kanten av elastomer barriären 3 dagar efter microchannel fylldes med vatten innehållande fluorescerande spårämne färgämne. Fluorescens bilden visar att vätskan fylla kanalen nådde ett djup av ca 200 µm från den synliga kanten av elastomer barriären. Men nådde vätskan inte gapet filler. Dessutom observerades inga läckage av luckutfyllare igenom elastomeriska barriär. Denna observation indikerar att tight passform mellan smala mitten av pins och elastomeriska barriär förhindras migration av vätska genom luckorna.
Slutligen, vi utfört långsiktiga cellodling med kulturområdet anpassad genom att gradvis utvidga sidoväggen av omkonfigurerbara mikroflödessystem enheten som visas i figur 4A. På 0 d, var ett litet antal celler begränsade inom ett utrymme som är lika med ett pin-bredd och andra celler var aspirerade. Vid 2 d, cellerna fästes vid bottenyta och började frodas. Två stift var indragen så att alla celler var tydligt, trots konfluens var fortfarande låg. På 5 d, cellerna fortsatte att föröka sig och konfluens ökade. På 6 och 9 d, var två andra stift tillbakadragen för att hålla de celler underconfluent. Effekten av etappvis utbyggnad av kulturområdet visas i figur 4B. Den dagen omkopplarinställning var tillbakadragen fanns det plötsliga förändringar i cell densiteten. Dock hölls ökningstakt i celltal konstant, medan som ses i typiska cellodling är exponentiell.
Figur 1 : Omkonfigurerbara mikroflödessystem enhet med en pin-discretized däcksidan. (A) delar och byggandet av en omkonfigurerbara mikroflödessystem enhet. Enheten har en rak kanal med en sidovägg bildas av ändarna av 10 rostfritt stål stift infogas i PDMS/glas microchannel funktioner. Slavsändaren och en elastomer barriär hindrar vätska från att läcka igenom pin luckorna. Täckglas, luckutfyllare och elastomer barriären är fasta till en polymetylmetakrylat (PMMA) bas. (B) automatiserad pin manipulator. Ett slutet effektor gjort från ett blad av metall är fast en 3-axlig stationära robot. Om du vill flytta en pin, skjuter den slutet effektor dess vertikala slut. Pins med olika längder placeras på ett intervall tre gånger pin bredd. Intervallet säkerställer att slutet effektor kompisar ena stiftet på en gång med tillräckligt clearance. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Mekanisk ritning av maskinbearbetade delar används i protokollet. Enheter är i millimeter; R visar en radie dimension; fyrkantiga symbolen (□) anger kvadratiska funktioner; t anger tjocklek. (A) ett 316 L rostfritt stål stift som en del av däcksidan. Pins kan beställas och maskinbearbetade vilket beskrivs. Gallring av pin mitten göra hund ben-liknande former återspeglas inte i den här ritningen eftersom detta beställdes inte som en del av bearbetningen men utfördes som en del av protokollet. (B) en polymetylmetakrylat (PMMA) bas som håller den täckglas, slavsändaren och elastomeriska barriär på plats mot pin rörelse. (C) en etsning maträtt som används till etch mitten av pins. För att bygga en etsning maträtt, limmas fyra bitar av glas med silikon lim. En kontur mönster av silikon lim ritas på skålen följt av placering av stiften på skålen som visas i ritningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Fluorescens upptäckt av läckage från en omkonfigurerbara microchannel genom pin luckor. Fluorescens bild av grön fluorescerande färg fylla den omkonfigurerbara microchannel är överlagrade på en fas kontrast bild av seal struktur, som består av en luckutfyllare (ogenomskinlig) och elastomeriska barriär (genomskinlig). En kant av elastomer barriären är synlig som menisk-liknande funktioner och betecknas med en övre streckade linjen; gränssnittet mellan elastomer barriär och gap filler visas som menisk-liknande funktioner som kontaktar det svarta området och indikeras av den lägsta prickade linjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Progressiva och kontinuerlig celltillväxt med rörlig cell kulturområde i en omkonfigurerbara microchannel. (A) COS-7 celltillväxt i en cell kulturområde begränsas genom att flytta sidoväggarna. (B) tillväxt kurva och tid utvecklingen av tätheten av COS-7 celler begränsas i varierande storlek kulturområden i den omkonfigurerbara microchannel visas i A). Tre lodräta pilar betecknar expansion av området cell kultur på 2, 5 och 6 d, respektive. Förutom antal blodkroppar visas cell tätheter för samma kulturområden, monteras individuellt på varje exponentiell kurva, och används för att uppskatta den lokala fördubbling tid (td [h]) som visas i bildrutorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den pin-discretized microchannel är en fullfjädrad mikroflödessystem kanal, och vi tror att det har uppenbarligen hög omkonfigurerbarheten i kanal form jämfört med alla befintliga mikroflödessystem kanaler. I protokollet som vi gett här kommer aktivera mikroflödessystem enheter kan cellodling med gradvis expanderande cell kultur yta för att hålla kulturerna under konfluens för en lång varaktighet. Enheten kommer också att ge in-kanal mallning av celler utan mönstring proteiner på substratet i förväg eller varje annat övervägande vid tidpunkten av design eller tillverkning. Dessutom genererar omkonfigurerbara mikroflödessystem enheten enkelt stark in-kanal förskjutning flöde, som skulle bidra till att genomföra hantering av sådana svårt-att-flow material som mycket få befintliga mikroflödessystem enheter kan hantera. Detta innebär att samspelet mellan cellerna och andra mikroorganismer, gaser och andra icke-vätskor kan utvärderas med hjälp av denna enhet utan stora ändringar i enheten design.
Vi har övervägt att tillämpa Laplace trycket eller hydrostatiska trycket till ett inlopp av kanalen som metoder för kontroll av externa flöde. Vi rekommenderar inte att trycka vätska vid en återvändsgränd eftersom det kommer att generera flöde mot luft vent kanal genom luckorna mellan stift och taket/golvet i kanalen. Många flytande operationer kräver inte sådana PIN-operationer. Blandning kan exempelvis uppnås genom mosa vätska med en PIN kod (dvs flytta enda stift fram och tillbaka flera gånger).
De mest kritiska delarna av enheten är stiften. Precision i längd, parallellitet, vinkling och ytkvalitet krävs för stiften, som de måste bilda en microchannel, måste röra sig smidigt, och måste styra rörelsen av angränsande stift. Därför rekommenderar vi att stiften bör beställas från ett företag som specialiserar sig på precisionsbearbetning genom att skicka in en ritning som liknar figur 2A. Det kan finnas företag som kräver ytterligare geometrisk måttsättning och explicit ytjämnhet riktningar. Stiften kan dock återanvändas om de hanteras med omsorg och ibland passiviseras med salpetersyra.
Elastomeriska barriären är en annan viktig funktion, och dess bildande är det mest kritiska steget i fabrication processerna för enheten. En exakt maskinbearbetade bas behövs för att erhålla repeterbara och pålitliga resultat. Placera stiften på ohärdat barriären är också ett viktigt steg. Stiften bör hållas väl anpassade och inbäddade i slavsändaren och barriären utan luftbubblor. Dessa steg förhindra läckage genom stift, vilket är ett vanligt problem med denna mikroflödessystem enhet.
Andra vanliga frågor i använder denna enhet är en) frictionally återhållsamma stift, och b) celldöd, och låga tillväxttakt. Möjliga orsaker till dessa i en) inkluderar ojämn (koniska eller vågig) etsning av den etsade ytan och dimensionell missanpassad mellan pin tip höjden och höjden av fotoresist skikt på en mögel för silikon plattor pin mellersta, dålig kvalitet. Justering av etsmedlet formulering, temperatur och agitation kan bidra till att förbättra den PIN-rörelsen. Dessutom kommer rättegången montering utan att använda vax eller lim ger tips för att lösa problemet. Möjliga faktorer i b) är otillräcklig passivering av stiften, fel i urval av lim för elastomeriska hinder och ofullständig härdning av lim. Vissa celler kan kräva beläggning på insidan av microchannel med Fibronektin, proteiner eller andra polymerer som främjar celladhesion. Dessutom minskar optimering i cell kultur praktiken såsom trypsinization och centrifugering döda celler i microchannel.
En av begränsningarna av protokollet presenterade fabrication är att endast en av sidoväggarna är discretized. Omkonfigurerbarheten kanalen kommer att öka ytterligare om båda sidoväggarna är byggda av PIN-matriser. Även om det kräver dubbla mängden pins och längre fabrikation steg, är detta ett tekniskt genomförbart alternativ.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av KAKENHI (20800048, 23700543).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oven | Yonezawa | MI-100 | |
| 10% Nitric Acid | Wako Chemicals | 149-06845 | |
| Stainless steel pins | Micro Giken | N/A | 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM |
| Mold release agent | Fluoro Technology | FG-5093SH | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Shin-Etsu Chemicals | KE-106 | |
| Negative epoxy photoresist | Nippon Kayaku | SU-8 3050 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 26 x 60mm No.4 | |
| Acetone | Kanto Chemicals | 01060-79 | |
| Glass slides (Large) | Matsunami Glass | 76 x 52mm No.1 | |
| Silicone adhesive | Shin-Etsu Chemicals | KE-41 | |
| White petrolatum | Nikko Rica | Sun White P-1 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder | Power House Accele | Microfluon II | |
| Clear acrylic plate (3 mm-thick) | Various | N/A | |
| Pneumatic dispenser | Musashi Engineering | ML-5000XII | |
| Hydrochloric acid | Kanto Chemicals | 180768-00 | |
| Computer numerical control (CNC) mill | Pro Spec Tools | PSF240-CNC | |
| End mill (4 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0400 | |
| End mill (1 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0100 | |
| Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) | Cotronics | Duralco 4460 | |
| Borisilicate glass vials | Various | To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass. | |
| Sodium bicarbonate | Kanto Chemicals | 37116-00 | |
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | AS12GTU | |
| Ultrasonic drill | Shinoda Tools | SOM-121 | Used as a ultrasonic homogenizer. |
| Spin coater | Active | ACT-220DII | |
| Hotplate | AS ONE | ND-1 | |
| Photoplotted film (12,700 dpi) | Unno Giken | N/A | Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted. |
| 2-methoxy-1-methylethyl acetate | Wako Chemicals | 130-10505 | |
| UV spot light source | Hamamatsu | L8327 | Ultraviolet source |
| Nitrogen | Various | N/A | |
| Vacuum desiccator and pump | AS ONE | MVD-100, GM-20S | |
| Scalpels | Various | No.11 | |
| Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) | Kai Medical | BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm) | |
| Glass engraving pen | Various | N/A | |
| Cleaning solution | Tama Chemicals | TMSC | Dilute 1:100 with deionized water |
| Sputter coater | San-yu Electron | SC-708 | For plasma bonding. |
| Dispenser syringe (5 ml) | Musashi Engineering | PSY-5E | |
| Plunger | Musashi Engineering | FLP-5E | |
| Blunt needle (21G) | Musashi Engineering | PN-21G-B | |
| Adapter tube | Musashi Engineering | AT-5E | |
| Fermenter | Japan Kneader | PF100 | |
| Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) | Thermo Fisher | A33077 | |
| Large plastic dish | Greiner bio-one | 688161 | |
| Absorbent paper | Asahi Kasei | BEMCOT M-1 | |
| Inverted microscope | Leica | DMi8 | |
| Microscope camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) | GE Health Care | SH30021.01 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher | 25200-056 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | GE Health Care | SH30256.01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1820 | |
| Cell counter | FPI | OC-C-S02 | |
| Cell culture vessel | VIOLAMO | VTC-D100 | |
| 15 ml conical tube | Corning | 352095 | |
| Shop microscope | PEAK | 2034-20 | |
| Hand sprayer | FURUPLA | No.3530 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 10 x 20mm No.4 | |
| CAD/CAM software | Autodesk | Inventor HSM | |
| Nitrogen gas pressure regulator | AS ONE | GF1-2506-RN-V | Set to 0.1 MPa |
References
- Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
- Araci, I. E., Brisk, P. Recent developments in microfluidic large scale integration. Curr Opin Biotechnol. 25, 60-68 (2014).
- Gu, W., Chen, H., Tung, Y. -C., Meiners, J. -C., Takayama, S. Multiplexed hydraulic valve actuation using ionic liquid filled soft channels and Braille displays. Appl Phys Lett. 90 (3), 033505 (2007).
- Konda, A., Taylor, J. M., Stoller, M. A., Morin, S. A. Reconfigurable microfluidic systems with reversible seals compatible with 2D and 3D surfaces of arbitrary chemical composition. Lab Chip. 15 (9), 2009-2017 (2015).
- Hahn, Y., Hong, D., Kang, J., Choi, S. A Reconfigurable microfluidics platform for microparticle separation and fluid mixing. Micromachines. 7 (8), 139 (2016).
- Kintses, B., van Vliet, L. D., Devenish, S. R. A., Hollfelder, F. Microfluidic droplets: new integrated workflows for biological experiments. Curr Opin Chem Biol. 14 (5), 548-555 (2010).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology and medicine. Lab Chip. 12 (14), 2452-2463 (2012).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat Commun. 5, 4250 (2014).
- Futai, N. Reconfigurable microchannels with discretized moving sidewalls. Chem Micro-Nano Syst. 10 (1), 24-25 (2011).
- Oono, M., et al. Reconfigurable microfluidic device with discretized sidewall. Biomicrofluidics. 11 (3), 034103 (2017).
