Fabricación de la matriz extracelular de la lengua y reconstitución de células escamosas de lengua In Vitro

Resumen

Aquí se muestra un método para la preparación de la matriz extracelular de la lengua (TEM) con descelularización eficiente. La temperatura puede utilizarse como andamios funcionales para la reconstrucción de un modelo de carcinoma de células escamosas (TSCC) lengua bajo condiciones de cultivo estático o agitada.

Resumen

Con el fin de construir un modelo eficaz y realista para lengua squamous cell carcinoma (TSCC) en vitro, los métodos fueron creados para producir decellularized lengua matriz extracelular (TEM) que proporciona funciones andamios para la construcción de TSCC. TEM proporciona un nicho en vitro para el crecimiento celular, diferenciación y migración celular. Las microestructuras de nativo matriz extracelular (ECM) y composiciones bioquímicas retenidos en la matriz de decellularized proporcionan nichos de tejidos específicos para el anclaje de las células. La fabricación de TEM puede ser realizada por digestión de desoxirribonucleasa (DNasa) acompañada de una seria de tratamiento orgánico o inorgánico. Este protocolo es fácil de operar y asegura alta eficiencia para la descelularización. El TEM demostró cytocompatibility favorable para las células TSCC bajo condiciones de cultivo estático o agitada, que permite la construcción del modelo TSCC. Un biorreactor hecho a sí mismo también fue utilizado para la persistente condición agitada para el cultivo celular. TSCC reconstruido usando TEM demostraron las características y propiedades que se asemejan a la histopatología clínica de TSCC, sugiriendo el potencial en investigación TSCC.

Introducción

La lengua tiene varias funciones importantes, tales como deglución, articulación y degustación. Así, el deterioro de la función de la lengua tiene gran impacto en la calidad de vida de pacientes¹. La neoplasia más frecuente en la cavidad bucal es lengüeta carcinoma de célula squamous (TSCC), que generalmente ocurre en personas que beben alcohol o fuman tabaco².

En los últimos años, se ha logrado poco progreso en la investigación fundamental de TSCC. La falta de investigación eficiente en vitro modelos restos para ser uno de los mayores problemas. Por lo tanto, la matriz extracelular (....

Protocolo

Animal todo el trabajo fue realizado de acuerdo con la ley de bienestar animal, las pautas y aprobado por institucional Animal cuidado y uso, Universidad de Yat-sensor del sol.

1. preparación de TEM

1. Ejecutar ratones por dislocación cervical y retire las lenguas utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas estériles.
2. Sumerja las lenguas en etanol al 75% durante 3 minutos, luego poner cada lengua en 1,5 mL tubo Eppendorf (EP) con 1 mL de fosfato estéril de 10 mM de solución amortiguadora (SSAF).
   Nota: La concentración de PBS en los siguientes pasos es igual a la concentración en este paso.
3. Lisis de la célula por hi....

Resultados

Este protocolo para la preparación de TEM resulta para ser eficiente y apropiado. El TEM demostró descelularización perfecto en comparación con los tejidos de la lengua materna. La eficacia de la descelularización fue confirmada por hematoxilina-eosina (HE) tinción (figura 1A-B). LO resultados de tinción desaparición completa reveladora de tinción nuclear en TEM (figura 1B). Por otra parte, la cu.......

Discusión

Un protocolo bien establecido para la fabricación de ECM decellularized debe conservar la composición nativa de ECM al eliminar componentes celulares en los tejidos casi totalmente²¹. A pesar de los protocolos actualmente divulgado de la descelularización que requieren de la perfusión a través de la vasculatura para quitar materiales celulares por transporte convectivo, agitación mecánica fue adoptada aquí, conocido como un método sencillo y barato tradicional^{22 ,}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones C57-BL/6J	Yat-sen Centro de Animales de Laboratorio de Etanol
	Guangzhou Fábrica de reactivos químicos	HB15-GR-2.5L
Cloruro de sodio	Sangon Biotech	A501218
Cloruro de potasio	de Sangon Biotech A100395
Fosfato de sodio dibásico	Fábrica	de reactivos químicos de GuangzhouBE14-GR-500G
Fosfato de potasio Monobásico	Sangon Biotech	A501211
tubo EP de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-A
Congelador de temperatura ultrabaja	Thermo Fisher Scientific
plato de cultivo celular de 3,5 cm	Thermo Fisher Scientific	153066
plato de cultivo celular de 6 cm	Greiner	628160
Triton X-100	Sigma-Aldrich	V900502
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	746495
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	449164
DNasa	Sigma-Aldrich	D5025
Sulfato de magnesio	Sangon Biotech	A601988
Glucosa	Sigma-Aldrich	158968
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S5761
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A9393
Kanamicina	Sigma-Aldrich	PHR1487
Sutura quirúrgica	Shanghai Jinhuan
Frasco de boca ancha de 250 mL	SHUNIU	1407
Agitador magnético	AS ONE	1-4602-32
Incubadora < CO>2	SHEL LAB	SCO5A Jeringa de
10 mL	Hunan Pingan
50 mL tubo de centrífuga	Greiner	227270
Células Cal27	Academia China de Ciencias, Banco		Lengua Línea celular de carcinoma de células escamosas
Célula U2OS	Academia China de Ciencias, Banco		Línea celular de osteosarcoma humano
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Piruvato de sodio	Sigma-Aldrich	P5280
Hepes ácido libre	BBI
FBS	Hyclone	SH30084.03
4 ° C nevera	Haier
Purificador de agua	ELGA
Hemocitómetro	BLAU	717805

Sun de de de Células de Shanghái de Células de Shanghái A600264