Específica y detección precisa de los Citrus Greening patógeno Candidatus liberibacter spp mediante PCR convencional en muestras de tejido de hoja de Citrus

Resumen

Enverdecimiento de los cítricos es una enfermedad particularmente destructiva que afecta a cultivos de cítricos a nivel mundial. Presentado aquí es un método simple usando PCR y extracción de ADN genómica de tejido foliar cítricos para la identificación exacta y precisa de lo patógeno de enverdecimiento de los cítricos Candidatus liberibacter spp.

Resumen

Enverdecimiento de los cítricos, también conocida como huanglongbing, es una enfermedad destructiva de cítricos causando estragos en granjas de cítricos a nivel mundial. Esta enfermedad causa moteado asimétrica hoja amarilla, vena amarillamiento, defoliación, caries de la raíz y en última instancia, la muerte de la planta de cítricos. Cuando infectados, las plantas de cítricos con retraso en el crecimiento y producen flores fuera de temporada. Estas flores raramente rendir fruto, y aquellos que producen cítricos pequeñas, amargas y de forma irregular no son deseables. Esta enfermedad se transmite por el psílido asiático de los cítricos, Diaphorina citri y por el injerto de tejido infectado de cítricos. El patógeno tiene un período de incubación largo y variable dentro de la planta cítricos, a veces años, antes de que aparezcan los síntomas. Los intentos de cultivar este agente patógeno en vitro han tenido éxito, posiblemente debido a la baja y desigual concentración del patógeno dentro de infectados tejido cítricos, o porque es difícil replicar el medio ambiente las condiciones propicia para el crecimiento de el patógeno. Es muy difícil identificar la enfermedad antes de que se ha propagado, debido a su período de incubación largo y la incapacidad de los investigadores para el patógeno de la cultura. Como resultado, la enfermedad sólo se hace evidente después de repente destruir toda producción de un agricultor cítricos. Presentado aquí es un método para la detección precisa y específica del patógeno de enverdecimiento de los cítricos, Candidatus liberibacter spp. usando un kit de extracción de DNA genómico y PCR. Este método es simple, eficiente, rentable y adaptable para el análisis cuantitativo. Este método puede adaptarse para su uso en cualquier tejido cítricos; sin embargo, potencialmente está limitada por la cantidad de patógenos presentes en el tejido. Sin embargo, este método permitirá cítricos agricultores identificar plantas cítricas infectadas antes y frenar la propagación de esta enfermedad destructiva antes de que se propaguen aún más.

Introducción

Enverdecimiento de los cítricos, también conocida como huanglongbing, ha causado una pérdida significativa de árboles de cítricos. Un caso representativo es la Florida, donde pronostican la enfermedad causa una reducción del 70% en la producción de cajas de naranja de Florida de 244 millones de cajas en la temporada 1997-1998 a 70 millones de cajas a partir de la temporada 2016-2017¹. Más del 90% de los árboles de cítricos en Florida son infectados², y se estima que la industria cítrica de Florida pierde alrededor de 1 billón de dólares cada año debido a enfermedades de cítricos, en donde enverdecimiento de los cítricos juega un papel importante³. Enverdecimiento de los cítricos se extiende principalmente por el invasor psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri, pero también puede propagarse por injerto de tejido infectado. La enfermedad causa amarillamiento de las venas, moteado de la hoja amarilla asimétrica, defoliación prematura, muerte regresiva de ramas, caries de raíz y muerte de la planta. Lo importante, la enfermedad causa la planta de cítricos producir flores fuera de temporada, que rara vez producen fruta. El fruto que es producido por las plantas cítricas infectadas es inmaduros, verdes y amargo sabor⁴.

El propósito de este método es exactamente e identificar con precisión el móvil de la bacteria Candidatus liberibacter spp., el agente causativo del enverdecimiento de los cítricos, en el líber de árboles cítricos infectados⁵. ADN genómico se extrae tejido de la hoja entera, que contiene bacterias vivas. Este ADN genómico extraído se utiliza como plantilla para PCR convencional, donde se utilizan oligonucleótidos complementarios a la secuencia de ADNr 16S de la bacteria para amplificar esta secuencia. Oligonucleótidos complementarios a un gen FBOX cítricos se utilizan como un control de amplificación interno. Optamos por utilizar este método, porque se ha demostrado para tener éxito en la investigación anterior⁶.

Este método tiene la clara ventaja de ser simple, relativamente barato y puede realizarse en cualquier laboratorio de bioquímica normalmente equipada. Además, la PCR sigue siendo el método más preciso y exacto para la detección de este patógeno, debido a la dificultad de cultivo este patógeno⁷y capacidad del patógeno de sobrevivir y reproducirse durante años dentro de un anfitrión asintomático⁸. Muchos análisis PCR de diferentes especialidades se han utilizado para detectar con éxito este patógeno; sin embargo, la PCR convencional sigue siendo el ensayo más simple para la detección exacta y específica, especialmente en huéspedes asintomáticos⁸.

Protocolo

1. aislar el ADN genómico de tejidos vegetales utilizando un Kit de extracción genómica

1. Obtener tejido foliar cítricos cortando un fresco entero de la hoja de un árbol cítrico con unas tijeras limpias y coloque la hoja en una bolsa de plástico limpia sandwich.
   Nota: La bolsa que contiene el tejido de la hoja debe colocarse en un refrigerador de 4 ° C o en hielo en un contenedor aislado tan pronto como sea posible después de la colección para evitar deterioro.
2. Agregue una pequeña cantidad de nitrógeno líquido para enfriar un mortero y una maja. Mientras que son escalofriantes, use tijeras para cortar un pedazo pequeño de tejido foliar, aproximadamente 1 pulgada cuadrada de tamaño. Lugar el corte del tejido en el mortero para congelarlo inmediatamente. Añadir más nitrógeno líquido, si es necesario.
   Nota: Siempre deben usar guantes aislantes al manipular nitrógeno líquido.
3. Rápidamente moler el tejido de la planta en un polvo fino usando el mortero. Continuar moliendo hasta que el nitrógeno líquido se evapora completamente, y sigue siendo un polvo fino verde.
4. Brevemente chill una espátula de metal en nitrógeno líquido de 10-15 s, luego sacar el tejido de la planta dentro del mortero en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, utilizando la espátula.
5. Añadir 600 μl de solución de lisis de núcleos (véase Tabla de materiales) usando un 1000 μl de pipeta y agitar la muestra para 1-3 s, entonces Incube en un baño de agua de 65 ° C durante 15 minutos.
6. Agregar 3 μl de Rnasa solución al lisado utilizando una pipeta de 10 μl, invertir el tubo 2 - 5 veces y mezclar, incubar a 37 ° C en una incubadora de gabinete durante 15 minutos.
   Nota: Deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente antes de proceder.
7. Añadir 200 μL de solución de precipitación de proteína, vortex en alta velocidad por 20 s, luego centrifugar por 3 min a 13.000 x g para formar un pellet firme. Mientras que se se centrifuga la muestra, añadir 600 μl de isopropanol de temperatura ambiente a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco.
8. Con una pipeta de 1000 μl, retire con cuidado el sobrenadante de la muestra centrifugada, transferir al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco que contiene isopropanol. Ahora puede descartarse la pelotilla.
   Nota: Evite contaminar el sobrenadante con la proteína dejando una cantidad minúscula de sobrenadante por encima de la pelotilla.
9. Invertir el tubo hasta que el ADN se hace visible como una masa de filamentos filiformes, luego centrifugar a 13.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.
10. Decantar el sobrenadante, añadir 600 μl de etanol al 70% para el pellet, invertir el tubo varias veces para lavar el DNA y centrifugar a 13.000 x g durante 1 minuto.
11. Cuidadosamente aspirar el etanol, dejando el pellet de ADN suelto, luego abrir e invertir el tubo sobre papel absorbente. Aire seco a temperatura ambiente durante 15 minutos.
12. Añadir 100 μl de solución de rehidratación de la DNA para el pellet de ADN seco, luego incubar el ADN en un baño de agua de 65 ° C durante 1 h, mientras se mezcla periódicamente golpeando suavemente el tubo.
13. Coloque 1 μl de agua purificada en una microcubeta y colóquelo en un espectrofotómetro para ser utilizado como un espacio en blanco. Calcular la concentración de ADN presente colocar 1 μl de la muestra sobre la microcubeta, e insertando en el espectrofotómetro. Concentración de ADN (ng/μL) puede ser calculado como (un₂₆₀- un₃₂₀) × dilución factor × 50 ng/μl.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí. La muestra puede conservarse a 4 ° C.

2. realizar PCR en muestras de ADN genómico

1. Combinar 10 μl 2 x PCR Master Mix (véase tabla de materiales), primer avance de 1 μl (10 pM/μL), 1 μl de invierte cartilla (10 pM/μL) (ver tabla 2 para las secuencias de la cartilla), 100 ng de ADN genómico extraído de la muestra y purificado de agua (volumen final de hasta 20 μl) en una 50 μl PCR tubo, flick para mezclar y brevemente centrífuga.
2. Inserte el tubo PCR en el termociclador y funcionar en consecuencia (véase tabla 1).
   Nota: El protocolo se puede detener aquí. Si es necesario, guarde la muestra a 4 ° C después de la reacción es completa.

3. electrophorese el ADN amplificado en un Gel de agarosa

1. Peso 0,4 g de agarosa en polvo y añadir junto con 1 x TAE buffer a una limpia 200 mL matraz Erlenmeyer, 50 mL de relleno.
2. Microondas en alto por 1,5 min, agitando cada 30 s, hasta que la agarosa se disuelva completamente.
   Nota: Se deben usar guantes aislantes durante la manipulación de agarosa líquida para evitar quemaduras.
3. Añadir 2,5 μl de bromuro de etidio 10 mg/mL a la agarosa líquida y agitar para mezclar y verter el gel de agarosa líquida en un molde de gel nivel. Inserte rápidamente el estándar 12-tooth gel peines después de verter.
4. Permita que el gel se enfríe por 20 min a temperatura ambiente y luego quitar gel de peines y coloque el gel en una caja de gel nivel llenada de tampón de x TAE 1.
5. Usando una micropipeta, cargar las muestras de ADN amplificadas total en pozos. Añadir 5 μl de DNA ladder (véase Tabla de materiales) en un pozo aparte de sus muestras.
6. Electrophorese las muestras durante 35 minutos a una constante 90 V, luego retirar el gel y colocar en un transiluminador UV.
7. Fotografiar y analizar el gel de patrón de bandas durante el uso de la transiluminación UV 302 nm.

Resultados

Un resultado positivo produce una banda distinta correspondiente a 500 bp para Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss⁶, o una banda distinta correspondiente a 700 bp para Laa2/Laj5, un inserto en el β ribosomal 16S operón⁹. La banda de control de amplificación interno debe aparecer también en 400 bp. Esta banda corresponde a la amplificación de los cítricos FBOX gen¹⁰...

Discusión

Es fundamental que se sigan todos los pasos exactamente para lograr condiciones experimentales óptimas. Tejido de hoja entera fue utilizado durante esta demostración; sin embargo, el protocolo puede ser modificado para incluir teóricamente cualquier tipo de tejido vegetal. Previamente, investigadores han extraído ADN genómico de tejido de la vena de la hoja, en lugar de tejido de hoja entera y consigue similares resultados¹¹. Si la banda correspondiente al gen FBOX cítricos no comparecier...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Wizard Kit de purificación de ADN genómico	Promega	A1120	Fuente de soluciones de lisis de núcleos, RNasa, precipitación de proteínas y rehidratación de ADN
Nitrógeno líquido	Productos de aire	N/A
Mastercycler pro con panel de control	Microondas Eppendorf	6321000019
1250 W Centrífuga	Panasonic	N/A
5424	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 baño de agua digital	Fisher scientific	15-462-15Q
Espátula metálica	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortero	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Mezclador de vórtice	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Estéril 10 μ L puntas	TipOne	1161-3730
Estéril 200 μ L puntas	TipOne	1163-1730
Estéril 1250 μ Puntas en L	TipOne	1161-1750
Kit de pipetas de volumen variable	VWR	75788-460
Bromuro de etidio	Sigma-Aldrich	E1510
Agarosa	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Ácido acético	Fisher Chemical	A38-212
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001
μ cubeta	Eppendorf	6138000018
Bandeja de fundición apilable y peines Carolina	213655
PowerPac Basic Fuente de alimentación	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Bioespectrómetro básico	Eppendorf	6135000009
tubos de PCR de 0,2 mL	Fisher scientific	AB-0620
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Imprimación Forward Thermo	Fisher Scientific	N/A
Imprimación Inversa	Thermo Fisher Scientific	N/A
, grado PCR	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ escalera de ADN	Thermo Fisher Scientific	10787018