Artículo de método

Específica y detección precisa de los Citrus Greening patógeno Candidatus liberibacter spp mediante PCR convencional en muestras de tejido de hoja de Citrus

DOI:

10.3791/57240

⸱

29 de junio de 2018

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1Department of Biological Sciences, University of South Carolina, 2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, 3Department of Instructions and Teacher Education, University of South Carolina

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Enverdecimiento de los cítricos es una enfermedad particularmente destructiva que afecta a cultivos de cítricos a nivel mundial. Presentado aquí es un método simple usando PCR y extracción de ADN genómica de tejido foliar cítricos para la identificación exacta y precisa de lo patógeno de enverdecimiento de los cítricos Candidatus liberibacter spp.

Resumen

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Enverdecimiento de los cítricos, también conocida como huanglongbing, es una enfermedad destructiva de cítricos causando estragos en granjas de cítricos a nivel mundial. Esta enfermedad causa moteado asimétrica hoja amarilla, vena amarillamiento, defoliación, caries de la raíz y en última instancia, la muerte de la planta de cítricos. Cuando infectados, las plantas de cítricos con retraso en el crecimiento y producen flores fuera de temporada. Estas flores raramente rendir fruto, y aquellos que producen cítricos pequeñas, amargas y de forma irregular no son deseables. Esta enfermedad se transmite por el psílido asiático de los cítricos, Diaphorina citri y por el injerto de tejido infectado de cítricos. El patógeno tiene un período de incubación largo y variable dentro de la planta cítricos, a veces años, antes de que aparezcan los síntomas. Los intentos de cultivar este agente patógeno en vitro han tenido éxito, posiblemente debido a la baja y desigual concentración del patógeno dentro de infectados tejido cítricos, o porque es difícil replicar el medio ambiente las condiciones propicia para el crecimiento de el patógeno. Es muy difícil identificar la enfermedad antes de que se ha propagado, debido a su período de incubación largo y la incapacidad de los investigadores para el patógeno de la cultura. Como resultado, la enfermedad sólo se hace evidente después de repente destruir toda producción de un agricultor cítricos. Presentado aquí es un método para la detección precisa y específica del patógeno de enverdecimiento de los cítricos, Candidatus liberibacter spp. usando un kit de extracción de DNA genómico y PCR. Este método es simple, eficiente, rentable y adaptable para el análisis cuantitativo. Este método puede adaptarse para su uso en cualquier tejido cítricos; sin embargo, potencialmente está limitada por la cantidad de patógenos presentes en el tejido. Sin embargo, este método permitirá cítricos agricultores identificar plantas cítricas infectadas antes y frenar la propagación de esta enfermedad destructiva antes de que se propaguen aún más.

Introducción

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Enverdecimiento de los cítricos, también conocida como huanglongbing, ha causado una pérdida significativa de árboles de cítricos. Un caso representativo es la Florida, donde pronostican la enfermedad causa una reducción del 70% en la producción de cajas de naranja de Florida de 244 millones de cajas en la temporada 1997-1998 a 70 millones de cajas a partir de la temporada 2016-20171. Más del 90% de los árboles de cítricos en Florida son infectados2, y se estima que la industria cítrica de Florida pierde alrededor de 1 billón de dólares cada año debido a enfermedades de cítricos, en donde enverdecimiento de los cítricos ....

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Protocolo

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1. aislar el ADN genómico de tejidos vegetales utilizando un Kit de extracción genómica

  1. Obtener tejido foliar cítricos cortando un fresco entero de la hoja de un árbol cítrico con unas tijeras limpias y coloque la hoja en una bolsa de plástico limpia sandwich.
    Nota: La bolsa que contiene el tejido de la hoja debe colocarse en un refrigerador de 4 ° C o en hielo en un contenedor aislado tan pronto como sea posible después de la colección para evitar deterioro.
  2. Agregue una pequeña cantidad de nitrógeno líquido para enfriar un mortero y una maja. Mientras que son escalofriantes, use tijeras para cortar un pedazo pequeño de tejido foliar, aproximada....

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Resultados

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Un resultado positivo produce una banda distinta correspondiente a 500 bp para Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, o una banda distinta correspondiente a 700 bp para Laa2/Laj5, un inserto en el β ribosomal 16S operón9. La banda de control de amplificación interno debe aparecer también en 400 bp. Esta banda corresponde a la amplificación de los cítricos FBOX gen10.......

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Discusión

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Es fundamental que se sigan todos los pasos exactamente para lograr condiciones experimentales óptimas. Tejido de hoja entera fue utilizado durante esta demostración; sin embargo, el protocolo puede ser modificado para incluir teóricamente cualquier tipo de tejido vegetal. Previamente, investigadores han extraído ADN genómico de tejido de la vena de la hoja, en lugar de tejido de hoja entera y consigue similares resultados11. Si la banda correspondiente al gen FBOX cítricos no comparecier.......

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Divulgaciones

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Huan Chen Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Chang Ming, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu y Zheng Qing Fu no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

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Conceptualización, H.C. y Z. p. F.; Investigación, H. C., J. C y Z. p. F; Recursos, Z. p. F.; Escritura - proyecto Original, I. A. P.; Redacción, revisión y edición, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. y F. de p. Z.; Visualización, H. C.; Supervisión, Z. p. F.; Financiación de adquisición, Z. p. F y F. p. L.

Proyecto apoyado por Carolina del sur mejorar maestro calidad educación superior estado becado titulado, conocimiento de procesos de la planta mejorar medio grados ciencia docentes, estructuras y funciones a través de la participación en investigación en Ciencias de planta (planta Ciencia)

Fondos otorga....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Wizard Kit de purificación de ADN genómicoPromegaA1120Fuente de soluciones de lisis de núcleos, RNasa, precipitación de proteínas y rehidratación de ADN
Nitrógeno líquidoProductos de aireN/A
Mastercycler pro con panel de controlMicroondas Eppendorf6321000019
1250 W CentrífugaPanasonicN/A
5424Eppendorf05-403-93
Isotemp 215 baño de agua digitalFisher scientific15-462-15Q
Espátula metálicaSigma-AldrichZ283274
MorteroSigma-AldrichZ247464
LSE Mezclador de vórticeCorning6775
2-propanolSigma-AldrichI9516
Estéril 10 μ L puntasTipOne1161-3730
Estéril 200 μ L puntasTipOne1163-1730
Estéril 1250 μ Puntas en LTipOne1161-1750
Kit de pipetas de volumen variableVWR75788-460
Bromuro de etidioSigma-AldrichE1510
AgarosaIBI ScientificIB70041
EDTAThermo Fisher Scientific17892
Ácido acéticoFisher ChemicalA38-212
Tris baseSigma-Aldrich10708976001
μ cubetaEppendorf6138000018
Bandeja de fundición apilable y peines Carolina213655
PowerPac Basic Fuente de alimentaciónBio-Rad1645050
Mini-Sub Cell GT SystemBio-Rad1704487EDU
Bioespectrómetro básicoEppendorf6135000009
tubos de PCR de 0,2 mLFisher scientificAB-0620
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLThermo Fisher Scientific3439
2X Taq Green PCR Master MixPromegaM7122
Imprimación Forward ThermoFisher ScientificN/A
Imprimación InversaThermo Fisher ScientificN/A
, grado PCRSigma-Aldrich3315953001
Gel Doc XR+Bio-Rad1708195
1 KB+ escalera de ADNThermo Fisher Scientific10787018
de sobremesa Agua

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
  2. Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
  3. Spreen, T. H., Hodges, A. The economic....

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