Específica y detección precisa de los Citrus Greening patógeno Candidatus liberibacter spp mediante PCR convencional en muestras de tejido de hoja de Citrus

El objetivo general de este procedimiento es detectar con precisión el patógeno del enverdecimiento de los cítricos Candidatus liberibacter spp. en el tejido de las hojas de los cítricos. Este método permite a los productores e investigadores de cítricos identificar de forma rápida y precisa la presencia del patógeno responsable de causar el enverdecimiento de los cítricos.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Ian Palmer, un estudiante graduado de mi laboratorio. Este método es eficiente, rentable y adaptable para el análisis cuantitativo. Además, se puede realizar con un nivel mínimo de experiencia y equipo de laboratorio.

Primero use unas tijeras limpias para cortar una hoja fresca entera de un árbol de cítricos y colóquela en una bolsa de plástico limpia para sándwiches. A continuación, enfríe un mortero, añadiendo una pequeña cantidad de nitrógeno líquido. A continuación, use las tijeras para cortar pequeños trozos de tejido de la hoja, de aproximadamente una pulgada cuadrada de tamaño.

Coloca los trozos de hoja en el mortero para congelarlos inmediatamente. Comience rápidamente a moler el tejido de la hoja con el mortero, hasta que el nitrógeno líquido se evapore y quede un polvo verde fino. A continuación, enfríe una espátula de metal en nitrógeno líquido, durante 10 a 15 segundos.

A continuación, utilice la espátula fría para recoger el tejido molido del mortero en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Utilice una pipeta de 1000 ml para añadir 600 ml de solución de lisis de núcleos a la muestra. A continuación, agite la muestra durante uno a tres segundos.

Incubar el tubo a 65 grados centígrados, en un baño de agua durante 15 minutos. Una vez finalizado el período de incubación, use una pipeta de 10 ml para agregar 3 ml de solución de ARN al licato para eliminar el ARN. A continuación, mezcle el contenido del tubo invirtiéndolo de dos a cinco veces.

Incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos en una incubadora de armario. Después de 15 minutos, agregue 200 ml de solución de precipitación de proteínas a la muestra. Agita el tubo a alta velocidad durante 20 segundos.

A continuación, centrifugar la muestra a 13000 G durante tres minutos. Durante el curso de la centrifugación, agregue 600 ML de isopropanol mantenido a temperatura ambiente, a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ML. Una vez finalizada la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante del tubo de centrífuga y colóquelo en el tubo que contiene isopropanol.

Deseche la bolita. Invierte el tubo para que el ADN sea visible como una hebra similar a un hilo. A continuación, centrifugar la muestra a 13000 g durante un minuto a temperatura ambiente.

Decantar el sobrenadante después de la centrifugación. A continuación, añada 600 ml de etanol al 70% al pellet. Invierta el tubo varias veces para lavar el pellet.

Centrifugar el tubo a 13000 g durante un minuto. Una vez finalizada la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, invierta el tubo con la tapa abierta sobre un papel absorbente para que se seque al aire durante 15 minutos.

Una vez seco, agregue 100 ML de solución de rehidratación de ADN al pellet. Incubar la suspensión de ADN a 65 grados centígrados en un baño de agua durante una hora. Golpee el tubo periódicamente mientras mezcla.

Añadir 1 ml de agua purificada en una microcubeta. Lea el agua como en blanco en el espectrofotómetro. A continuación, añada 1 ml de la muestra en la microcubeta.

Coloque la microcubeta en el espectrofotómetro y obtenga la concentración de ADN. Constituir la reacción de PCR añadiendo todos los reactivos, y 100 nanogramos de ADN genómico en un tubo de PCR de 50ML. Mezcle los reactivos agitando suavemente el tubo, seguido de una centrifugación rápida.

Coloque el tubo de PCR en el termociclador y ejecute el programa. Para preparar el gel de agarosa, pese 0,4 gramos de polvo de agarosa. A continuación, añada el polvo de agarosa a un matraz Erlenmeyer de 200 ML, ajustando el volumen a 50 ML con tampón TAE 1X.

Calienta la mezcla de agarosa en el microondas a temperatura alta durante aproximadamente 1,5 minutos. Agitar cada 30 segundos hasta que la agarosa se disuelva por completo. A continuación, agregue 2,5 ml de 10 miligramos por mililitro de bromuro de etidio a la agarosa líquida.

Luego agite el matraz para mezclar el bromuro de etidio y vierta rápidamente el gel de agarosa líquido en un molde de gel nivelado. Inserte inmediatamente un peine de gel estándar de 12 dientes. Deje que el gel se enfríe durante unos 20 minutos a temperatura ambiente y luego retire el peine de gel.

Ahora coloque el gel solidificado en la unidad de electroforesis llena con tampón TAE 1X. Cargue la muestra total de ADN amplificada y 5 ml de ADN más tarde en pocillos separados en el gel. Ponga en marcha la unidad de electroforesis, a una velocidad constante de 90 voltios durante 35 minutos.

A continuación, retire el gel de la unidad de electroforesis. A continuación, coloque el gel en un transiluminador UV. Capture las fotografías de los patrones de bandas de gel en el transiluminador a 302 nanómetros.

Para identificar la bacteria verde, se electroforizan los ADN genómicos amplificados por PCR obtenidos de muestras infectadas y no infectadas. En el gel, estas bandas correspondientes a 500 pares de bases indican la presencia de una región específica del ADN ribosómico Las16S en la bacteria CL asiaticas. Estas bandas correspondientes a 700 pares de bases indican la presencia de LAA2/LAJ5, y se insertan presentes en la secuencia de ADN del operón beta ribosómico 16S en la bacteria.

Estas bandas distintivas a 400 pares de bases indican la amplificación de solo el gen F-box de los cítricos, que se refiere al control de amplificación interna. Para considerar válidos nuestros resultados, se requiere la presencia de esta banda. Por el contrario, la presencia de solo una banda a 400 pares de bases, pero la ausencia de las otras bandas a 500 y 700 pares de bases indica un tejido cítrico saludable.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en unas cuatro horas si se realiza correctamente. Este procedimiento puede adaptarse para permitir la realización de métodos más cuantitativos, como la RTQPCR, para detectar la cantidad de patógeno presente.