Name: Específica y detección precisa de los Citrus Greening patógeno Candidatus liberibacter spp mediante PCR convencional en muestras de tejido de hoja de Citrus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprende a detectar Candidatus liberibacter spp. en tejido foliar de cítricos mediante PCR convencional y extracción de ADN. Este método eficiente permite identificar rápidamente el patógeno causante del greening.

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Conceptualización, H.C. y Z. p. F.; Investigación, H. C., J. C y Z. p. F; Recursos, Z. p. F.; Escritura - proyecto Original, I. A. P.; Redacción, revisión y edición, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. y F. de p. Z.; Visualización, H. C.; Supervisión, Z. p. F.; Financiación de adquisición, Z. p. F y F. p. L.
Proyecto apoyado por Carolina del sur mejorar maestro calidad educación superior estado becado titulado, conocimiento de procesos de la planta mejorar medio grados ciencia docentes, estructuras y funciones a través de la participación en investigación en Ciencias de planta (planta Ciencia)
Fondos otorgados por el Reino Estados Departamento de Educación (CFDA número 84.367B)
Los autores desean dar las gracias a Dr. Nian Wang de la Universidad de Florida para proporcionar muestras de ADN genómicas de infectados Valencia Citrus sinensis .

1. aislar el ADN genómico de tejidos vegetales utilizando un Kit de extracción genómica
<ol><li>Obtener tejido foliar cítricos cortando un fresco entero de la hoja de un árbol cítrico con unas tijeras limpias y coloque la hoja en una bolsa de plástico limpia sandwich. Nota: La bolsa que contiene el tejido de la hoja debe colocarse en un refrigerador de 4 ° C o en hielo en un contenedor aislado tan pronto como sea posible después de la colección para evitar deterioro.</li>
	<li>Agregue una pequeña cantidad de nitrógeno líquido para enfriar un mortero y una maja. Mientras que son escalofriantes, use tijeras para cortar un pedazo pequeño de tejido foliar, aproximadamente 1 pulgada cuadrada de tamaño. Lugar el corte del tejido en el mortero para congelarlo inmediatamente. Añadir más nitrógeno líquido, si es necesario. Nota: Siempre deben usar guantes aislantes al manipular nitrógeno líquido.</li>
	<li>Rápidamente moler el tejido de la planta en un polvo fino usando el mortero. Continuar moliendo hasta que el nitrógeno líquido se evapora completamente, y sigue siendo un polvo fino verde.</li>
	<li>Brevemente chill una espátula de metal en nitrógeno líquido de 10-15 s, luego sacar el tejido de la planta dentro del mortero en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, utilizando la espátula.</li>
	<li>Añadir 600 μl de solución de lisis de núcleos (véase Tabla de materiales) usando un 1000 μl de pipeta y agitar la muestra para 1-3 s, entonces Incube en un baño de agua de 65 ° C durante 15 minutos.</li>
	<li>Agregar 3 μl de Rnasa solución al lisado utilizando una pipeta de 10 μl, invertir el tubo 2 - 5 veces y mezclar, incubar a 37 ° C en una incubadora de gabinete durante 15 minutos. Nota: Deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente antes de proceder.</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución de precipitación de proteína, vortex en alta velocidad por 20 s, luego centrifugar por 3 min a 13.000 x g para formar un pellet firme. Mientras que se se centrifuga la muestra, añadir 600 μl de isopropanol de temperatura ambiente a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco.</li>
	<li>Con una pipeta de 1000 μl, retire con cuidado el sobrenadante de la muestra centrifugada, transferir al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco que contiene isopropanol. Ahora puede descartarse la pelotilla. Nota: Evite contaminar el sobrenadante con la proteína dejando una cantidad minúscula de sobrenadante por encima de la pelotilla.</li>
	<li>Invertir el tubo hasta que el ADN se hace visible como una masa de filamentos filiformes, luego centrifugar a 13.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Decantar el sobrenadante, añadir 600 μl de etanol al 70% para el pellet, invertir el tubo varias veces para lavar el DNA y centrifugar a 13.000 x g durante 1 minuto.</li>
	<li>Cuidadosamente aspirar el etanol, dejando el pellet de ADN suelto, luego abrir e invertir el tubo sobre papel absorbente. Aire seco a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
	<li>Añadir 100 μl de solución de rehidratación de la DNA para el pellet de ADN seco, luego incubar el ADN en un baño de agua de 65 ° C durante 1 h, mientras se mezcla periódicamente golpeando suavemente el tubo.</li>
	<li>Coloque 1 μl de agua purificada en una microcubeta y colóquelo en un espectrofotómetro para ser utilizado como un espacio en blanco. Calcular la concentración de ADN presente colocar 1 μl de la muestra sobre la microcubeta, e insertando en el espectrofotómetro. Concentración de ADN (ng/μL) puede ser calculado como (un260- un320) × dilución factor × 50 ng/μl. Nota: El protocolo se puede detener aquí. La muestra puede conservarse a 4 ° C.</li>
</ol>2. realizar PCR en muestras de ADN genómico
<ol><li>Combinar 10 μl 2 x PCR Master Mix (véase tabla de materiales), primer avance de 1 μl (10 pM/μL), 1 μl de invierte cartilla (10 pM/μL) (ver tabla 2 para las secuencias de la cartilla), 100 ng de ADN genómico extraído de la muestra y purificado de agua (volumen final de hasta 20 μl) en una 50 μl PCR tubo, flick para mezclar y brevemente centrífuga.</li>
	<li>Inserte el tubo PCR en el termociclador y funcionar en consecuencia (véase tabla 1). Nota: El protocolo se puede detener aquí. Si es necesario, guarde la muestra a 4 ° C después de la reacción es completa.</li>
</ol>3. electrophorese el ADN amplificado en un Gel de agarosa
<ol><li>Peso 0,4 g de agarosa en polvo y añadir junto con 1 x TAE buffer a una limpia 200 mL matraz Erlenmeyer, 50 mL de relleno.</li>
	<li>Microondas en alto por 1,5 min, agitando cada 30 s, hasta que la agarosa se disuelva completamente. Nota: Se deben usar guantes aislantes durante la manipulación de agarosa líquida para evitar quemaduras.</li>
	<li>Añadir 2,5 μl de bromuro de etidio 10 mg/mL a la agarosa líquida y agitar para mezclar y verter el gel de agarosa líquida en un molde de gel nivel. Inserte rápidamente el estándar 12-tooth gel peines después de verter.</li>
	<li>Permita que el gel se enfríe por 20 min a temperatura ambiente y luego quitar gel de peines y coloque el gel en una caja de gel nivel llenada de tampón de x TAE 1.</li>
	<li>Usando una micropipeta, cargar las muestras de ADN amplificadas total en pozos. Añadir 5 μl de DNA ladder (véase Tabla de materiales) en un pozo aparte de sus muestras.</li>
	<li>Electrophorese las muestras durante 35 minutos a una constante 90 V, luego retirar el gel y colocar en un transiluminador UV.</li>
	<li>Fotografiar y analizar el gel de patrón de bandas durante el uso de la transiluminación UV 302 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

Huan Chen Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Chang Ming, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu y Zheng Qing Fu no declaran conflictos de interés.

Es fundamental que se sigan todos los pasos exactamente para lograr condiciones experimentales óptimas. Tejido de hoja entera fue utilizado durante esta demostración; sin embargo, el protocolo puede ser modificado para incluir teóricamente cualquier tipo de tejido vegetal. Previamente, investigadores han extraído ADN genómico de tejido de la vena de la hoja, en lugar de tejido de hoja entera y consigue similares resultados11. Si la banda correspondiente al gen FBOX cítricos no comparecier...

Enverdecimiento de los cítricos, también conocida como huanglongbing, ha causado una pérdida significativa de árboles de cítricos. Un caso representativo es la Florida, donde pronostican la enfermedad causa una reducción del 70% en la producción de cajas de naranja de Florida de 244 millones de cajas en la temporada 1997-1998 a 70 millones de cajas a partir de la temporada 2016-20171. Más del 90% de los árboles de cítricos en Florida son infectados2, y se estima que la industria cítrica de Florida pierde alrededor de 1 billón de dólares cada año debido a enfermedades de cítricos, en donde enverdecimiento de los cítricos juega un papel importante3. Enverdecimiento de los cítricos se extiende principalmente por el invasor psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri, pero también puede propagarse por injerto de tejido infectado. La enfermedad causa amarillamiento de las venas, moteado de la hoja amarilla asimétrica, defoliación prematura, muerte regresiva de ramas, caries de raíz y muerte de la planta. Lo importante, la enfermedad causa la planta de cítricos producir flores fuera de temporada, que rara vez producen fruta. El fruto que es producido por las plantas cítricas infectadas es inmaduros, verdes y amargo sabor4.
El propósito de este método es exactamente e identificar con precisión el móvil de la bacteria Candidatus liberibacter spp., el agente causativo del enverdecimiento de los cítricos, en el líber de árboles cítricos infectados5. ADN genómico se extrae tejido de la hoja entera, que contiene bacterias vivas. Este ADN genómico extraído se utiliza como plantilla para PCR convencional, donde se utilizan oligonucleótidos complementarios a la secuencia de ADNr 16S de la bacteria para amplificar esta secuencia. Oligonucleótidos complementarios a un gen FBOX cítricos se utilizan como un control de amplificación interno. Optamos por utilizar este método, porque se ha demostrado para tener éxito en la investigación anterior6.
Este método tiene la clara ventaja de ser simple, relativamente barato y puede realizarse en cualquier laboratorio de bioquímica normalmente equipada. Además, la PCR sigue siendo el método más preciso y exacto para la detección de este patógeno, debido a la dificultad de cultivo este patógeno7y capacidad del patógeno de sobrevivir y reproducirse durante años dentro de un anfitrión asintomático8. Muchos análisis PCR de diferentes especialidades se han utilizado para detectar con éxito este patógeno; sin embargo, la PCR convencional sigue siendo el ensayo más simple para la detección exacta y específica, especialmente en huéspedes asintomáticos8.

<table><tbody><tr><td>Wizard Kit de purificación de ADN genómico</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Fuente de soluciones de lisis de núcleos, RNasa, precipitación de proteínas y rehidratación de ADN</td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido</td><td>Productos de aire</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler pro con panel de control</td><td>Microondas Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W Centrífuga</td> de sobremesa <td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 baño de agua digital</td><td>Fisher scientific</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>Espátula metálica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>Mortero</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE Mezclador de vórtice</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 10 &mu; L puntas</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 200 &mu; L puntas</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 1250 &mu; Puntas en L</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>Kit de pipetas de volumen variable</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&mu; cubeta</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de fundición apilable y peines Carolina</td><td>213655</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Fuente de alimentación</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT System</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Bioespectrómetro básico</td><td>Eppendorf</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>tubos de PCR de 0,2 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación Forward Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación Inversa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td> Agua<td></td></tr><tr><td>, grado PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ escalera de ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

específica y detección precisa de los citrus greening patógeno candidatus liberibacter spp mediante pcr convencional en muestras de tejido de hoja de citrus

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Enverdecimiento de los cítricos, también conocida como huanglongbing, es una enfermedad destructiva de cítricos causando estragos en granjas de cítricos a nivel mundial. Esta enfermedad causa moteado asimétrica hoja amarilla, vena amarillamiento, defoliación, caries de la raíz y en última instancia, la muerte de la planta de cítricos. Cuando infectados, las plantas de cítricos con retraso en el crecimiento y producen flores fuera de temporada. Estas flores raramente rendir fruto, y aquellos que producen cítricos pequeñas, amargas y de forma irregular no son deseables. Esta enfermedad se transmite por el psílido asiático de los cítricos, Diaphorina citri y por el injerto de tejido infectado de cítricos. El patógeno tiene un período de incubación largo y variable dentro de la planta cítricos, a veces años, antes de que aparezcan los síntomas. Los intentos de cultivar este agente patógeno en vitro han tenido éxito, posiblemente debido a la baja y desigual concentración del patógeno dentro de infectados tejido cítricos, o porque es difícil replicar el medio ambiente las condiciones propicia para el crecimiento de el patógeno. Es muy difícil identificar la enfermedad antes de que se ha propagado, debido a su período de incubación largo y la incapacidad de los investigadores para el patógeno de la cultura. Como resultado, la enfermedad sólo se hace evidente después de repente destruir toda producción de un agricultor cítricos. Presentado aquí es un método para la detección precisa y específica del patógeno de enverdecimiento de los cítricos, Candidatus liberibacter spp. usando un kit de extracción de DNA genómico y PCR. Este método es simple, eficiente, rentable y adaptable para el análisis cuantitativo. Este método puede adaptarse para su uso en cualquier tejido cítricos; sin embargo, potencialmente está limitada por la cantidad de patógenos presentes en el tejido. Sin embargo, este método permitirá cítricos agricultores identificar plantas cítricas infectadas antes y frenar la propagación de esta enfermedad destructiva antes de que se propaguen aún más.

Un resultado positivo produce una banda distinta correspondiente a 500 bp para Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, o una banda distinta correspondiente a 700 bp para Laa2/Laj5, un inserto en el β ribosomal 16S operón9. La banda de control de amplificación interno debe aparecer también en 400 bp. Esta banda corresponde a la amplificación de los cítricos FBOX gen10...

Enverdecimiento de los cítricos es una enfermedad particularmente destructiva que afecta a cultivos de cítricos a nivel mundial. Presentado aquí es un método simple usando PCR y extracción de ADN genómica de tejido foliar cítricos para la identificación exacta y precisa de lo patógeno de enverdecimiento de los cítricos Candidatus liberibacter spp.

Específica y detección precisa de los Citrus Greening patógeno Candidatus liberibacter spp mediante PCR convencional en muestras de tejido de hoja de Citrus

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar con precisión el patógeno del enverdecimiento de los cítricos Candidatus liberibacter spp. en el tejido de las hojas de los cítricos. Este método permite a los productores e investigadores de cítricos identificar de forma rápida y precisa la presencia del patógeno responsable de causar el enverdecimiento de los cítricos.La demostración del procedimiento estará a cargo de Ian Palmer, un estudiante graduado de mi laboratorio. Este método es eficiente, rentable y adaptable para el análisis cuantitativo. Además, se puede realizar con un nivel mínimo de experiencia y equipo de laboratorio.Primero use unas tijeras limpias para cortar una hoja fresca entera de un árbol de cítricos y colóquela en una bolsa de plástico limpia para sándwiches. A continuación, enfríe un mortero, añadiendo una pequeña cantidad de nitrógeno líquido. A continuación, use las tijeras para cortar pequeños trozos de tejido de la hoja, de aproximadamente una pulgada cuadrada de tamaño.Coloca los trozos de hoja en el mortero para congelarlos inmediatamente. Comience rápidamente a moler el tejido de la hoja con el mortero, hasta que el nitrógeno líquido se evapore y quede un polvo verde fino. A continuación, enfríe una espátula de metal en nitrógeno líquido, durante 10 a 15 segundos.A continuación, utilice la espátula fría para recoger el tejido molido del mortero en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Utilice una pipeta de 1000 ml para añadir 600 ml de solución de lisis de núcleos a la muestra. A continuación, agite la muestra durante uno a tres segundos.Incubar el tubo a 65 grados centígrados, en un baño de agua durante 15 minutos. Una vez finalizado el período de incubación, use una pipeta de 10 ml para agregar 3 ml de solución de ARN al licato para eliminar el ARN. A continuación, mezcle el contenido del tubo invirtiéndolo de dos a cinco veces.Incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos en una incubadora de armario. Después de 15 minutos, agregue 200 ml de solución de precipitación de proteínas a la muestra. Agita el tubo a alta velocidad durante 20 segundos.A continuación, centrifugar la muestra a 13000 G durante tres minutos. Durante el curso de la centrifugación, agregue 600 ML de isopropanol mantenido a temperatura ambiente, a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ML. Una vez finalizada la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante del tubo de centrífuga y colóquelo en el tubo que contiene isopropanol.Deseche la bolita. Invierte el tubo para que el ADN sea visible como una hebra similar a un hilo. A continuación, centrifugar la muestra a 13000 g durante un minuto a temperatura ambiente.Decantar el sobrenadante después de la centrifugación. A continuación, añada 600 ml de etanol al 70% al pellet. Invierta el tubo varias veces para lavar el pellet.Centrifugar el tubo a 13000 g durante un minuto. Una vez finalizada la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, invierta el tubo con la tapa abierta sobre un papel absorbente para que se seque al aire durante 15 minutos.Una vez seco, agregue 100 ML de solución de rehidratación de ADN al pellet. Incubar la suspensión de ADN a 65 grados centígrados en un baño de agua durante una hora. Golpee el tubo periódicamente mientras mezcla.Añadir 1 ml de agua purificada en una microcubeta. Lea el agua como en blanco en el espectrofotómetro. A continuación, añada 1 ml de la muestra en la microcubeta.Coloque la microcubeta en el espectrofotómetro y obtenga la concentración de ADN. Constituir la reacción de PCR añadiendo todos los reactivos, y 100 nanogramos de ADN genómico en un tubo de PCR de 50ML. Mezcle los reactivos agitando suavemente el tubo, seguido de una centrifugación rápida.Coloque el tubo de PCR en el termociclador y ejecute el programa. Para preparar el gel de agarosa, pese 0,4 gramos de polvo de agarosa. A continuación, añada el polvo de agarosa a un matraz Erlenmeyer de 200 ML, ajustando el volumen a 50 ML con tampón TAE 1X.Calienta la mezcla de agarosa en el microondas a temperatura alta durante aproximadamente 1,5 minutos. Agitar cada 30 segundos hasta que la agarosa se disuelva por completo. A continuación, agregue 2,5 ml de 10 miligramos por mililitro de bromuro de etidio a la agarosa líquida.Luego agite el matraz para mezclar el bromuro de etidio y vierta rápidamente el gel de agarosa líquido en un molde de gel nivelado. Inserte inmediatamente un peine de gel estándar de 12 dientes. Deje que el gel se enfríe durante unos 20 minutos a temperatura ambiente y luego retire el peine de gel.Ahora coloque el gel solidificado en la unidad de electroforesis llena con tampón TAE 1X. Cargue la muestra total de ADN amplificada y 5 ml de ADN más tarde en pocillos separados en el gel. Ponga en marcha la unidad de electroforesis, a una velocidad constante de 90 voltios durante 35 minutos.A continuación, retire el gel de la unidad de electroforesis. A continuación, coloque el gel en un transiluminador UV. Capture las fotografías de los patrones de bandas de gel en el transiluminador a 302 nanómetros.Para identificar la bacteria verde, se electroforizan los ADN genómicos amplificados por PCR obtenidos de muestras infectadas y no infectadas. En el gel, estas bandas correspondientes a 500 pares de bases indican la presencia de una región específica del ADN ribosómico Las16S en la bacteria CL asiaticas. Estas bandas correspondientes a 700 pares de bases indican la presencia de LAA2/LAJ5, y se insertan presentes en la secuencia de ADN del operón beta ribosómico 16S en la bacteria.Estas bandas distintivas a 400 pares de bases indican la amplificación de solo el gen F-box de los cítricos, que se refiere al control de amplificación interna. Para considerar válidos nuestros resultados, se requiere la presencia de esta banda. Por el contrario, la presencia de solo una banda a 400 pares de bases, pero la ausencia de las otras bandas a 500 y 700 pares de bases indica un tejido cítrico saludable.Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en unas cuatro horas si se realiza correctamente. Este procedimiento puede adaptarse para permitir la realización de métodos más cuantitativos, como la RTQPCR, para detectar la cantidad de patógeno presente.

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Investigación

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Environment

Entorno

Fuente: Gulla, S., et al. Análisis tándem-repetición multilocus de la bacteria patogénica de peces Yersinia ruckeri mediante PCR multiplex y electroforesis capilar. J. Vis. Exp. (2019).Este protocolo extrae ADN genómico de Yersinia ruckeri suspendiendo colonias aisladas en agua ultrapura y aplicando calor para lisar las células. La centrifugación separa el sobrenadante que contiene ADN de los restos celulares, produciendo ADN plantilla adecuado para la genotipificación basada en PCR y el...

Extracción de ADN genómico de tejido foliar vegetal infectado con bacterias patógenas

Fuente: Chen, H., et al. Detección específica y precisa del patógeno de la reforestación de cítricos Candidatus liberibacter spp. mediante PCR convencional en muestras de tejido de hojas cítricas. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demuestra la extracción de ADN genómico total de tejido foliar de cítricos infectado con una bacteria patógena. El protocolo permite una recuperación fiable de ADN para la detección posterior basada en PCR del patógeno limitado por el floema.

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Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el<em&gt; Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis</em&gt; Patosistema

PCR anidada es una técnica sensible, específica y directa que se puede aplicar a garrapata que extractos de ADN para sonda de burgdorferi de Borrelia, el agente causativo de la enfermedad de Lyme. El experimento inicial de PCR utiliza cartillas gene-específicas para generar amplicones de largo, que luego se convierten en plantillas para una posterior reacción usando cebadores internos.

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Desarrollamos un método para detectar zoosporas phytophthora capsici en fuentes de agua utilizando un método de extracción de ADN de papel de filtro junto con un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que se puede analizar en el campo o en el laboratorio.

Detección de Phytophthora capsici en agua de riego mediante amplificación isotérmica mediada por bucle

En este trabajo, se desarrolló un método de detección rápido, sensible y portátil para Candidatus Liberibacter asiaticus basado en la amplificación de la polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a.

Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus desplegable en campo mediante amplificación de polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a

Diseñamos, fabricamos y validamos un instrumento que procesa rápidamente tejidos de yemas cítricas de corteza ricos en floema. En comparación con los métodos actuales, el extractor de tejido de yemas (BTE) ha aumentado el rendimiento de las muestras y ha disminuido los costes de mano de obra y equipos necesarios.

Automatización del procesamiento de yemas de cítricos para la detección de patógenos posteriores a través de la ingeniería de instrumentos

Este manuscrito describe un novedoso dispositivo de infusión directa de plantas para evaluar la efectividad de moléculas contra la bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) o su insecto vector (Diaphorina citri, Kuwayama) que, en combinación, están asociadas con la enfermedad de los cítricos de Huanglongbing.

Dispositivo de infusión directa para la administración de moléculas en plantas

En este protocolo, se ilustra un ensayo combinado de amplificación de polimerasa recombinasa CRISPR / Cas12a para la detección del patógeno vegetal invasor , Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza tropical 4.

Ensayo combinado de amplificación de polimerasa recombinasa CRISPR/Cas12a para detectar Fusarium oxysporum f. sp. cubense Raza tropical 4

Aquí, describimos un procedimiento simple y rápido para detectar ADN de patógenos de abejas, como Lotmaria passim y Nosema ceranae, utilizando una lisis celular lista para la amplificación, amplificación de polimerasa recombinasa y ensayos CRISPR/Cas12a.

Detección in situ de ADN de parásitos tripanosomátidos y Nosema ceranae mediante lisis alcalina acoplada al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Aprende a detectar Candidatus liberibacter spp. en tejido foliar de cítricos mediante PCR convencional y extracción de ADN. Este método eficiente permite identificar rápidamente el patógeno causante del greening.

Específica y detección precisa de los Citrus Greening patógeno Candidatus liberibacter spp mediante PCR convencional en muestras de tejido de hoja de Citrus (Video) | JoVE Journal

Específica y detección precisa de los Citrus Greening patógeno Candidatus liberibacter spp mediante PCR convencional en muestras de tejido de hoja de Citrus

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