Method Article

Perfusable Red Vascular con un modelo de tejido en un dispositivo de microfluidos

DOI:

10.3791/57242

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April 4th, 2018

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1Department of Micro Engineering, Kyoto University, 2Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 3International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo describe cómo diseñar una red vascular perfusable en un esferoide. Microambiente circundante del esferoide es ideado para inducir angiogénesis y conectarse el esferoide de los microcanales en un dispositivo de microfluidos. El método permite la perfusión de la esferoide, que es una técnica largamente esperada en cultivos tridimensionales.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un esferoide (un agregado multicelular) es considerado como un buen modelo de tejidos vivos en el cuerpo humano. A pesar del avance significativo en las culturas del esferoide, una red vascular perfusable en los esferoides sigue siendo un reto para la cultura a largo plazo necesaria para mantener y desarrollar sus funciones, como expresiones de la proteína y la morfogénesis. El protocolo presenta un método novedoso para integrar una red vascular perfusable dentro del esferoide en un dispositivo de microfluidos. Para inducir una red vascular perfusable en el esferoide, brotes angiogénicos conectados con microcanales fueron guiados a la esferoide utilizando factores angiogénicos de fibroblastos de pulmón humanos cultivados en el esferoide. Los brotes angiogénicos alcanzaron el esferoide, que se fusiona con las células endoteliales cultivadas conjuntamente en el esferoide y forman una red vascular continua. La red vascular podría inundar el interior del esferoide sin ninguna salida. La red vascular construida puede utilizarse más como una ruta para el suministro de nutrientes y eliminación de residuos, que mímico la circulación de sangre en vivo. El método proporciona una nueva plataforma en la cultura de esferoide hacia mejor recapitulación de los tejidos vivos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El cambio de una cultura (bidimensional) de monocapa a una cultura tridimensional está motivado por la necesidad de trabajar con modelos de cultura que imitan las funciones celulares de la vida los tejidos1,2,3. Planos y duros plástico sustratos utilizados en cultivo de células no se parecen a la mayoría de los entornos extracelulares en el cuerpo humano. De hecho, muchos estudios demuestran que cultura tridimensionales recrear tejidos específicos la arquitectura, señales mecánicas y bioquímicas y comunicación de la célula, que no se han observado en la cultura bidimensional convencional4, 5,6,7,8.

Un agregado multicelular o esferoide, es una de las técnicas más prometedoras para realizar este cultivo tridimensional9,10. Las células secretan la matriz extracelular (ECM) y pueden interactuar con otros en el esferoide. Aunque algunos otros bioingeniería enfoques11,12,13,14, como el amontonamiento de células, replicar con éxito la complejidad espacial del cuerpo humano, estos enfoques tienen sólo dos o tres tipos de células para la facilidad de análisis y enfocada en sólo una de las funciones de órganos diana. En contraste, las células esferoides están expuestas a ambientes de cultivo diferentes dependiendo de sus posiciones en el esferoide debido a la heterogénea oferta de nutrientes, oxígeno y paracrina y autocrina señalización de moléculas en el esferoide. Esta característica de esferoides imita parcialmente en vivo cultura condición y activar las células esferoides para crear tejido mucho más complejo y organizado de la estructura en vitro que las cultivadas en el apilamiento de tejido9, 15 , 16. tenga en cuenta que si un esferoide se compone de un solo tipo de células, la función de las células en el esferoide no es uniforme debido al ambiente heterogéneo en el esferoide. En los últimos años, las culturas esferoide permitieron células de madre pluripotentes células madre embrionarias (ESCs), inducidas (iPSCs) o células madre de tejido-residente en vivo secuencias de desarrollo de imitar y recrear mini-órganos como el cerebro17, hígado18y riñón19,20.

A pesar de importantes avances en las técnicas de cultivo esferoide, cultivo esferoides grandes durante mucho tiempo es todavía problemático. En un tejido tridimensional, las células necesitan estar ubicados a menos de 150-200 μm de un vaso sanguíneo debido a la limitada fuente de oxígeno y nutrientes21. Redes vasculares en el esferoide están necesarias recapitular intercambiando sustancias entre la sangre y los tejidos in vivo. Para ello, otros grupos han co cultivadas las células endoteliales con las células de destino22,23,24 o inducido la diferenciación de las células pluripotentes en CD31-positive células20. Sin embargo, las estructuras de recipiente-como informadas no tiene los extremos abiertos del lumina para suministrar oxígeno y nutrientes al centro del esferoide. Para imitar la función vascular para nutrir las células en el cultivo tridimensional, abierta y perfusable de la red vascular debe ser desarrollada en el esferoide.

Durante los últimos años, algunos grupos de investigación en el campo de la Microtécnica informaron métodos para construir una red vascular perfusable, formada espontáneamente en un dispositivo de microfluidos utilizando factores angiogénicos de células de morfología de fibroblastos25 ,26. Estas redes vasculares tienen una morfología similar a sus contrapartes en vivo y pueden ser remodeladas por factores ambientales, haciéndolos convenientes para mímico funciones vasculares en una cultura del esferoide. El propósito de este protocolo es construir una red vascular perfusable en un esferoide usando una plataforma de microfluidos27. El dispositivo de microfluidos se modifica el dispositivo previamente divulgados25 por lo que puede ser incorporado un esferoide. Dirigiendo la secreción angiogénico de las células del fibroblasto de un esferoide a las células endoteliales en microcanales, angiogénica brota de los microcanales que se anastomosa con el esferoide y forma una red vascular perfusable. Este método permite una entrega directa de una amplia gama de sustancias, como las moléculas fluorescentes y granos micrómetro-escala en el interior de un esferoide, que proporciona el marco para un cultivo de tejidos a largo plazo con las redes vasculares.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. fabricación del molde dispositivo microfluídico

  1. Diseñar el modelo del dispositivo microfluídico utilizando software disponible comercialmente (Clewin5 o AutoCAD 2016, etcetera.). Para la función de la Clewin5, consulte el manual del usuario (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
    Nota: El archivo del diseño está disponible en archivo adicional 1.
  2. Transferir el archivo de diseño a un micro generador y carga la herramienta con una máscara de cromo recubierta con el photoresist positivo.
  3. Exponer el photoresist positivo en la zona de patrón utilizando un generador de patrón micro.
  4. Desarrollar el photoresist positivo usando el revelador (Tabla de materiales) y enjuague la máscara con agua desionizada (DI).
  5. Usando el grabador de cromo (Tabla de materiales), grabe el cromo en el área expuesta donde fue quitado el photoresist positivo. Enjuague la máscara con agua desionizada.
  6. Eliminar el remanente de la fotoresistencia en la máscara usando acetona.
    Nota: La máscara de transparencia puede ser una alternativa para la máscara de Cr.
  7. Preparar una oblea de silicio limpia (4 pulgadas, P(100)) y spin capa hexamethyldisilazane (HMDS) a 3.000 rpm durante 30 s.
  8. HMDS Softbake durante 5 minutos a 120 ° C y la oblea se enfríe durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  9. Spincoat el photoresist negativo (tabla de materiales) en 500 rpm durante 10 s y 1.200 r.p.m. durante 30 s.
    Nota: La condición de la capa de vuelta debe producir las capas de Fotoprotección con un espesor de aproximadamente 100 μm en las obleas después de fotolitografía.
  10. Prebake el photoresist negativo por 45 min a 95 ° C y enfriar la oblea durante 60 min a temperatura ambiente.
  11. Compruebe la intensidad de la luz UV en cada experimento y calcular el tiempo de exposición para una dosis de energía de exposición total en 250 mW/cm2. Coloque la fotomáscara (paso de 1.1-1.6) en la oblea y exponerlas a la luz UV.
  12. Postbake el photoresist negativo durante 1 min a 65 ° C y a 5 min a 95 ° C. Permita que la oblea se enfríe durante 1 min a temperatura ambiente.
  13. Desarrollar la capa de photoresist negativo durante 15 min en el primer baño de desarrollador (Tabla de materiales) y a 2 minutos en el segundo baño. Enjuague la oblea en el primer baño de isopropanol (IPA) durante 10 s y en el segundo baño de IPA para 10 s.
  14. Hardbake el photoresist negativo durante 30 min a 200 ° C y la oblea se enfríe durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  15. Medir el espesor de la capa de photoresist negativo utilizando a un analizador de superficie.
  16. Colocar la oblea en un desecador conectado a una bomba de vacío y añadir 200 μL de silano (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Encienda la bomba durante 10 minutos, luego apáguelo y mantenga la oblea en el desecador durante 4 horas.

2. fabricación pasos y el conjunto de capas PDMS

  1. El polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) antes del molde (base PDMS: agente endurecedor = 10:1 (w/w)) y extraiga el gas en una cámara de vacío por 2 h.
  2. Cura de PDMS a 80° C en un horno de aire expulsado durante la noche.
  3. Pele los PDMS de la oblea de silicio.
  4. Perforar los agujeros 1A - 3B (figura 1) y la cultura de esferoide bien. Use un punzón de 2 mm de diámetro de agujeros 1A - 3B y un diámetro de 1 mm del sacador para el esferoide bien.
  5. Limpiar la losa PDMS y un cubreobjetos de vidrio (24 x 24 mm) con cinta adhesiva, pegando y despegando la cinta. Luego tratar la losa PDMS con plasma aire 40 s (40 mW, 50 sccm).
  6. Enlace de la losa PDMS en el vidrio cubreobjetos para expulsar cualquier burbuja de aire de la superficie de la losa PDMS, cubreobjetos y curado a 80 ° C durante al menos 12 h.

3. esferoide preparación

Nota: En el estudio, la proteína fluorescente roja expresando umbilical humano vena células endoteliales (RFP-HUVECs) y proteína fluorescente verde expresando HUVECs (GFP-HUVECs) se utilizan en el esferoide y microcanales, respectivamente, para distinguir el origen de HUVECs después de la construcción de una red vascular perfusable. Si no es necesario el origen de HUVECs, HUVECs son suficientes para el experimento.

  1. Descongelar la RFP-HUVECs (3,0 × 105 células/frasco) y fibroblastos de pulmón humano (hLF) (1,0 × 106 células/frasco) y añadir a 10 mL de medio para las células endoteliales y células del fibroblasto, respectivamente (Tabla de materiales). La cultura les en un plato de 100 mm a 37 ° C y 5% CO2 para 2-3 días para el confluente HUVECs RFP y hLFs. Esta preparación dará ~ 200 esferoides.
  2. Separar el RFP HUVECs y hLFs de los platos con 2 mL de tripsina 0,05%-EDTA y detener la reacción de la tripsina con 4 mL de DMEM con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v/v) penicilina/estreptomicina.
  3. Después de la centrifugación a 220 x g durante 3 min, eliminar el sobrenadante y resuspender el RFP HUVECs y hLFs en el medio endotelial a concentración celular final 2,5 × 104 y 1,0 × 105 células/mL, respectivamente.
  4. Suavemente agregar 200 μL de la suspensión de células (5.000 células de RFP HUVECs) y 20.000 células para hLFs por pozo en una placa de 96 pocillos con superficie de enlace bajas.
  5. Incubar la placa de 96 pocillos en 37 ° C y 5% CO2 para un período de 2 a 4 días.
    Nota: Puesto que el diámetro de esferoide depende el período de cultivo y el número de células iniciales en la placa de 96 pozos, puede ser controlada por estos dos parámetros.

4. célula de siembra en el dispositivo de microfluidos

Nota: La Convención de nomenclatura para los agujeros, canales y el esferoide bien se demuestran en la figura 1. Entendemos por día 0 el día cuando se termina la recolección de celulares en el dispositivo de microfluidos. Esquema de las líneas de tiempo experimental se muestra en la figura 2.

  1. Carga de esferoide día −1)
    Nota: El siguiente paso debe realizarse en hielo para evitar la gelificación de colágeno y fibrina.
    1. Disolver el fibrinógeno en tampón fosfato salino (PBS) para una concentración final de 2,80 mg/mL.
    2. Preparar el colágeno neutralizado (3.0 mg/mL en PBS) según protocolo del fabricante.
    3. Combinar 107.2 μl de solución de fibrinógeno (2,80 mg/mL), 8.0 μL de colágeno neutralizado (3.0 mg/mL) y 3.6 μl de aprotinina (5 U/mL) por reacción en un tubo. Esta solución se denomina "solución mix master" (MS).
      Nota: El volumen es suficiente para la carga de un esferoide. Si hay más de un esferoide, multiplique cada volumen por el número de esferoides.
    4. Trombina en PBS para una concentración final de 50 U/mL se disuelven.
      Nota: Alícuotas de 50 trombina U/mL (20 μl/tubo) se almacenan a −30 ° C y se descongelan antes de cada experimento.
    5. Coloque la placa de 96 pocillos que contienen esferoides dentro del gabinete de seguridad de la biotecnología.
    6. Preparar dos platos de Petri de 35 mm dentro de la bioseguridad de gabinete, con un plato en el hielo (plato 1) y el otro plato sobre la mesa (plato 2). Pipeta 99 μl de MS en el centro del plato 1 (figura 3a) para formar una gota.
    7. Recortar las puntas de 2 amarillos (10-100 μL) y 3 claras las puntas de pipeta (1-100 μL) de la colección de esferoides de la placa de 96 pocillos, mezcla de trombina con MS, colección precisa de los esferoides, inyección de los esferoides en el dispositivo e inyección de medios de comunicación en el dispositivo , respectivamente. El tamaño del poro de la punta debe ser ligeramente mayor que el diámetro de los agujeros 1A - 3B de los canales 1 y 3 o el esferoide en canal 2 para un ajuste preciso ajuste.
      Nota: En adelante, a menos que se indique lo contrario, use las puntas de pipetas en este paso. La fotografía de corte puntas está disponible en la figura 4.
    8. Recoger un esferoide con 100 μl de medio de la placa de 96 pocillos y agregar al plato 2 (figura 3a).
    9. Recoger el esferoide con volumen mínimo de los medios de comunicación del plato 2. Mientras sujeta la pipeta vertical, el esferoide debe moverse hacia la parte inferior de la punta de la pipeta por gravedad. Expulsar el esferoide tocando la punta de la pipeta en el menisco de la gota de MS en plato 1 (figura 3a).
      Nota: Los pasos siguientes 4.1.10 y 4.1.11 deben realizarse rápidamente.
    10. Añadir 1 μl de la trombina (50 U/mL) y mezclar suavemente con la punta de pipeta amarilla.
    11. Con la pipeta a 7 μl, recoger el esferoide y lentamente lo coloca en el pozo del esferoide (figura 3b).
    12. Incubar por 15 min a 37 ° C para la congelación de la fibrina.
    13. Inyecte lentamente el medio endotelial de agujeros 1A y 3A y llenar los canales 1 y 3 con los medios de comunicación (20 ~ 30 μL/canal).
    14. Coloque el dispositivo en un plato de 100 mm con un Kimwipe húmedo para evitar la evaporación de los medios desde el dispositivo (Figura 3C).
    15. Coloque el dispositivo en 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h eliminar las burbujas en la interfase entre los medios y la fibrina.
  2. Día 0) HUVECs carga
    1. Descongelar la GFP-HUVECs (3.0 x 105 células/vial) y añadir a 10 mL del medio endotelial. La cultura les en un plato de 100 mm a 37 ° C y 5% CO2 para 2-3 días llegar a sub-confluencia. Un plato de los confluentes GFP-HUVECs es suficiente para la preparación de dispositivos 8-10.
    2. Separar GFP-HUVECs de los platos con 2 mL de tripsina 0,05%-EDTA y detener la reacción de la tripsina con 4 mL de DMEM con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v/v) penicilina/estreptomicina.
    3. Después de la centrifugación a 220 x g durante 3 min, Resuspender el GFP-HUVECs en medio endotelial en 5.0 x 106 células/mL.
    4. Inyectar la suspensión de células HUVECs en canal 1 a través del agujero 1B (20 μl/canal).
    5. Incline el dispositivo de microfluidos 90°, coloque en el lado e incubar a 37 ° C por 30 minutos asegurar que el HUVECs se adhieren a la fibrina en el canal 2.
      1. Confirmar la fijación de HUVECs en la fibrina. Cuando el número de HUVECs en la interfaz entre el gel y el medio no es suficiente, la vasculatura puede desconectarse en la raíz vascular después de algunos días de la cultura del dispositivo (figura 5). En el protocolo, la tasa de éxito de la perfusión es > 50%.
    6. Repita los pasos 4.2.4 y 4.2.5 canal 3.
    7. Células en cultivo en un plato de 100 mm con un Kimwipe humedecido a 37 ° C y 5% de CO2 por 7-14 días.
  3. Día 1 ~) Media exchange
    1. La mitad de los medios de comunicación en canales 1 y 3 cambio de cada día.

5. tinción de núcleos

  1. Preparar 4% paraformaldehido (PFA) en PBS.
  2. Quitar los medios de comunicación de los canales 1 y 3 y añadir 20 μl del 4% PFA por canal. Para sustituir la solución en 4% PFA, repetir eliminar la solución desde el dispositivo y agregar 4% PFA tres veces.
  3. Incubar el dispositivo a 4 ° C durante la noche.
  4. Quitar 4% PFA desde el dispositivo y el lavado de los canales tres veces con PBS.
  5. Añadir 20 μl de 10 μg/mL del colorante fluorescente (Tabla de materiales) por canal para teñir los núcleos celulares. Para cambiar la solución en el dispositivo, repita el eliminar la solución desde el dispositivo y agregar 10 μg/mL el tinte fluorescente tres veces.
  6. Guarde el aparato a 4 ° C por 24 h.

6. líquida perfusión de un esferoide

  1. Preparar el esferoide después de cultivo de más de 7 días en el equipo de 37 ° C y 5% CO2 para la realización de una vía vascular continua.
  2. Retire el medio de 3B, 1B, 3A y 1A de los agujeros.
  3. Introducir 10 μl de solución 10 μm isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrán en PBS en los agujeros 1A y 1B.
  4. Controlar el flujo de microesferas o tinte FITC bajo un microscopio invertido.

7. cuantificación de la longitud de brotes

Nota: Software versión 1.49 de ImageJ se utiliza para todos los análisis de la imagen en este estudio.

  1. Se superponen las imágenes de GFP HUVECs días 0, 1, 3, 5 y 7.
  2. Reste la posición de la punta de la vasculatura del día 0 de la misma posición en imágenes tomadas en los días 1, 3, 5 y 7.
  3. Determinar el crecimiento de la punta vascular desde la posición de la raíz (figura 6). La distancia entre la punta vascular y raíz se define como la longitud de brotes en este estudio (figura 7b).

8. cuantificación de los ángulos Vascular

Nota: El ángulo Vascular se definió como el ángulo consistió en ángulo vascular, raíz y el centro del esferoide (figura 7 c).

  1. Binarize las imágenes fluorescentes de la esferoide de cocultivo con RFP HUVECs y medir la posición de "centroide" por la función de análisis en ImageJ. En este estudio, la posición de medida "centroide" se define como el centro del esferoide (figura 6).
  2. Determinar la posición de los vasculares y las raíces de la misma manera en el paso 7.
  3. Medir los ángulos vasculares utilizando la función de análisis en el software ImageJ.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figura 1 muestra un diseño y una foto del dispositivo microfluídico. Tiene tres canales paralelos, en que canal 2 contiene el esferoide bien. Canales 1 y 3 se utilizan para el cultivo HUVEC y canal 2 es para el esferoide. Cada canal está separada por microposts trapezoidal diseñado para patrón de PDMS. Los microposts que no el hidrogel en canal 2 en canales 1 y 3 por tensión superficial y permiten el intercambio de sustancias entre el esferoide y HUVECs en...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Informes anteriores muestran que hLFs secretan un cóctel de varios factores angiogénicos, como angiopoyetina-1, angiogenina, factor de crecimiento, transformación de factor de crecimiento-α, factor de necrosis tumoral y algunas de las proteínas de matriz extracelular29, 30. Este ensayo se basa en la secreción de angiogenic del hLFs en un esferoide de cocultivo, que es la limitación de la técnica. Por lo tanto, es fundamental para una formación vascular estable d...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El autor declara que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por cresta JST (número JPMJCR14W4), sociedad para la promoción de la ciencia (JSP) KAKENHI (número de concesión 25600060, 16 16386 K), el centro de innovación programa de MEXT y TJS, se centró en el desarrollo de la tecnología de clave evaluación de Agencia de Japón para investigación médica y el desarrollo, AMED, Mizuho Fundación para el fomento de las ciencias. Microfabricación fue apoyado por el centro de tecnología de Nano de la Universidad de Kyoto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AutoCAD 2017AutodeskAutoCAD 2017
Una máscara de cromo recubierta con AZP 1350.TECNOLOGÍA DE SUPERFICIE LIMPIACBL2506Bu-AZP
Micro generador de patronesHeidelberguPG101
MF CD-26 Reveladormateriales electrónicos Rohm and haas-Desarrolladoren protocolo 1.4
S-CleanSasaki ChemicalS-24Grabador de cromo en protocolo 1.5
AcetonWako012-00343
Oblea de silicioCanosisSiJ-4
Spin CoaterMIKASA1H-D7
Hexametildisilazano (HMDS)Tokyo Ohka KogyoH0089
SU-8 3050MicroChem-Negativofotorresistente en protocolo 1.9
Exposición UVNanometric Technology IncLA310s
SU-8 ReveladorMicroChemY020100Revelador para el fotorresistente negativo en el protocolo 1.13
2-propanolWako163-04841
Perfilador de superficiesVeecoVeeco Dektak XT-S
(Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silanoSigma 448931
Polidimetilsiloxano (PDMS)Dow Corning Toray184W/C
Punzón de biopsia (1.0mm) Punzónde biopsia Kai Industries BP-10F
(2,0 mm)  Kai IndustriesBP-20F
Sistema de PlasmaFemto CienciaCOVANCE
Cubierta de vidrioMATSUNAMI GLASSC024241
Placas de cultivoIwaki1000-035
RFP Expresión de células endoteliales de la vena umbilical humanaAngio ProteomiacAP-0001RFP
Fibroblastos pulmonares humanos normalesLonzaCC-2512
Medio de crecimiento de células endotelialesLonzaCC-3162
Kits de medios de crecimiento de fibroblastosLonzaCC-3132
DMEMThermo Fisher Scientific
Suero fetal bovinoThermo Fisher Scientific26140079
Solución de penicilina-estreptomicinaWako168-23191
0.05w/v% Tripsina-0.53mmol/l EDTA• Solución 4Na con Rojo FenolWako204-16935
PBS (Sales tamponadas con fosfato)Takara bioT900
Placa de 96 pocillosSumitomo baquelita631-21031
1000ul ChipNIPPON GeneticsFG-402
200ul  ChipNIPPON GeneticsFG-301
10ul ChipNIPPON Genetics37650
CO2incubadora Thermo FisherScientific Model 370
GFP Expresión de células endoteliales de vena umbilical humanaAngio ProteomiacAP-0001GFP
Fibrinógeno de plasma bovinoSigmaF8630
Aprotinina de pulmón bovinoSigmaA6279
Colágeno ICorning354236
Trombina de plasma bovinoSigmaT4648
Hoechst 33342InvitrogenH21492Colorante fluorescente para teñir núcleos en el protocolo 5.5
Solución de paraformaldehídoWako163-25983
Microscopio de fluorescencia invertidaOLYMPUSIX71
Cámara CCD DEGITALOLYMPUSORCA-R2
Microscopio biológico de barrido láser confocalOLYMPUSFV1000
Microscopio de fluorescencia invertidaOLYMPUSIX-83
Isotiocianato de fluoresceína-dextranoSigmaFD70S
de 11965092

References

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