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Artículo de método

Un modelo de ratón de cáncer de páncreas Syngeneic para estudiar los efectos de la electroporación Irreversible

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DOI:

10.3791/57265

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8 de junio de 2018

 ,  ,  , 
1Moores Cancer Center, University California San Diego, 2Duke University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Electroporación irreversible (IRE) es una técnica de ablación térmica no utilizada para el tratamiento de cáncer de páncreas localmente avanzado. Ser una técnica relativamente nueva, los efectos de la ira en el crecimiento del tumor están mal entendidos. Hemos desarrollado un modelo de ratón syngeneic que facilita el estudio de los efectos de la ira en el cáncer de páncreas.

Resumen

Cáncer pancreático (PC), una enfermedad que mata a aproximadamente 40.000 pacientes cada año en los Estados Unidos, ha evadido con éxito varios enfoques terapéuticos incluyendo las prometedoras estrategias de inmunoterapia. Electroporación irreversible (IRE) es una técnica de ablación no térmico que induce la muerte de la célula del tumor sin la destrucción de las estructuras colágenas adyacentes, permitiendo así que el procedimiento que se realiza en tumores muy cerca de los vasos sanguíneos. A diferencia de técnicas de ablación térmica, IRE resulta en la muerte celular apoptótica gradual, junto con la necrosis inducida por la ablación inmediata y está actualmente en uso clínico para pacientes seleccionados con PC localmente avanzado. Un ablativo procedimiento específico no objetivo como IRE puede inducir una gran variedad de respuestas en el microambiente del tumor. Unos pocos estudios han abordado los efectos de la ira sobre el crecimiento tumoral en otros tipos de tumor, pero ninguno se han centrado en la PC. Hemos desarrollado un modelo de ratón syngeneic de la PC en que subcutánea (SQ) y el trasplante orthotopic del tumores pueden ser tratados con éxito con ira en un entorno altamente controlado, facilitando diversos estudios longitudinales post procedimiento. Este modelo animal sirve como un sistema robusto para el estudio de los efectos de la ira y las formas de mejorar la eficacia clínica de ira.

Introducción

Adenocarcinoma ductal pancreática (PC) se proyecta para convertirse en la segunda causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos alrededor de 20201. La gran mayoría de pacientes diagnosticados de PC eventualmente morirán de enfermedad metastásica distante2. El microambiente de la PC es notoriamente inmunosupresor y quimioresistente. Su tejido conectador desmoplastic contiene una escasez de células de T effector (antitumoral) y una prominencia de los inmunosupresores leucocitos, incluyendo los macrófagos asociados a tumor (TAMs), (MDSCs) de las células supresoras derivadas mieloides y células de T reguladora (Tregs)3 . Estas subyacen a la necesidad de desarrollar estrategias multimodales que contrarrestar estos efectos del microambiente.

IRE ha sido desarrollado como un método no térmico de la ablación del tumor. A diferencia de técnicas de ablación térmica, IRE no causa necrosis coagulativa rápida pero en cambio resulta en progresiva apoptosis celular muerte4. Lo que es importante para los tumores pancreáticos, ira no es vulnerable a los efectos de "disipador" y puede realizarse justo al lado de los vasos sanguíneos5. Esta tecnología tiene 510 (k) de la FDA6 y está siendo usada clínicamente, para pacientes seleccionados con localmente avanzado o borderline resecable cáncer de páncreas. En la mayor serie publicada de IRE para PC7, la supervivencia mediana de pacientes que experimentan ira era aproximadamente doble de la supervivencia de los pacientes tratados con la quimioterapia moderna sola sin resección8,9.

Varios estudios han demostrado que la ablación térmica induce una respuesta inmune sistémica en otros tipos de tumor (revisado en Chu et al. 10). la ablación por radiofrecuencia (RFA) en tumor animal modelos conduce a mayor T cell infiltra11,12, incluyendo un aumento en células activadas asesino natural (NK) en hepatocelular cáncer pacientes13, 14y una disminución de Tregs inmunosupresoras en cáncer de pulmón pacientes15. Un número mucho más pequeño de estudios ha examinado inmune microambiental y respuestas de lesión a IRE16. IRE se ha demostrado para estimular una respuesta inmune sistémica en modelos con ratones inmunocompetentes en el que el crecimiento de los allografts secundaria de células renales (contralateral) fue reducido o impedido por la ira de un tumor primario dos semanas anterior17. También observaron que ratones inmunocompetentes requieren menos voltaje para la regresión completa de ratones inmunodeprimidos. Se ha presumido que IRE puede resultar en la presentación del antígeno mejorada en comparación con la necrosis coagulativa de la ablación térmica, pero esto no ha sido específicamente estudiado.

Hemos desarrollado un modelo de ratón syngeneic de la PC de la línea celular de KPC-Luc 4580 (regalo de J.J. Yeh en Universidad de Carolina del norte), que fue derivada de un tumor que se convirtió en un hombre LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; ROSA26 de LSL Luc / + ratón, para estudiar los efectos locales y sistémicos de IRE18,19. Esta línea celular expresan luciferasa es inmunogénica y también tumorígeno en ratones C57BL/6 inmunocompetentes cuando inyectan SQ o orthotopically y confiablemente produce metástasis hepáticas cuando se inyecta en el bazo. Hemos utilizado un generador de pulsos de onda cuadrada programable para entregar 100 μs pulsos de electricidad en una relación de tensión y distancia de 1.500 V/cm, utilizando una sonda de dos agujas matriz (separados por 5 mm) o platino pinzas-ARRODEO a tumores SQ u ortotópico, respectivamente, en ratones para modelar los efectos de la ira en un animal pequeño.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales realizan siguiendo que este protocolo debe ser aprobado por el respectivo cuidado de Animal institucional y Comité uso (IACUC). Todos los procedimientos aquí descritos han sido aprobados por la UCSD IACUC.

1. adquirir animales receptores

Nota: La línea celular de KPC-Luc 4580 fue establecida de un tumor que se presenta en un LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; ROSA26 de LSL Luc / + ratón (KPC), que es un modelo genéticamente de PC sobre un fondo de C57BL/6. La ventaja de esta línea celular es que expresa constitutivamente permitiendo luciferase tumor monitoreo en modelos ortotópicos. Sin embargo, otras líneas celulares pueden usarse siempre y cuando sean compatibles con el fondo genético de los ratones receptores.

  1. Determinar de antemano los grupos experimentales y el número de animales por grupo.
  2. Elija la edad (6 - 10 - vieja de semana ratones recomendadas) y sexo de los animales según la hipótesis y la línea celular utilizada.

2. la cultura de las células

  1. Dulbecco uso de modificado medio de eagle (DMEM): mezcla de nutrientes F12 (50: 50) medios que contienen 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% antibiótico de penicilina-estreptomicina (medios de crecimiento completa) para hacer crecer las células 4580 KPC-Luc.
  2. Si se congela, descongelar las células 4 días antes de la implantación del tumor.
  3. Crecen las células a 37 ° C con 5% CO2 y 95% de humedad bajo condiciones asépticas.
  4. Trypsinize las células con 0.25% tripsina durante 5 min a 37 ° C antes de llegar a > 80% de confluencia y neutralizar la tripsina añadiendo dos veces el volumen de medio de crecimiento completo.
    Nota: Estas células no establecen tumores eficientemente en ratones si se utilizan en el 100% de confluencia o si son pasados para más de 12 veces. Por lo tanto, es aconsejable congelar las células en pasajes anteriores bajo confluencia óptima.
  5. Contar las células usando un hemocitómetro y proceder a la inducción de tumor si hay números apropiados (0.5 - 1 x 106 células/ratón). Si no, expandir las células para un paso más hasta que se obtenga un número adecuado de células.

3. inducción de tumores SQ

  1. Preparar los materiales necesarios: P1000 y P100 pipetas y las puntas de la jeringa de 1 mL, 25G agujas, matriz de la membrana del sótano (BMM), tubos de centrífuga de medio basal de DMEM, 1,5 mL. Guardar todo el material estéril y frío (4 ° C) hasta el final del procedimiento. También mantener el cortapelo e hisopos de alcohol listo para uso animal.
  2. Trypsinize (según el paso 2.4) y contar las células y resuspender en una concentración de 2-4 x 107 células/mL de DMEM frío.
  3. Añadir un volumen igual de 100% BMM para hacer una suspensión definitiva en el 50% BMM. El volumen final debe ascender a 50 μl de suspensión celular para cada ratón necesaria. Preparar el 10% en exceso para acomodar el espacio muerto de la jeringa y los errores de pipeteo.
  4. Alícuota la suspensión en volúmenes de 550 μL en tubos de centrífuga de 1.5 mL se coloca en hielo.
  5. Refrenar los animales (ratones machos 6 - semana viejos de C57BL/6) utilizando un limitador o manualmente.
    Nota: Como alternativa, ratones pueden ser anestesiados con isoflurano de 2.5% en gas de oxígeno a un caudal de 2 L/min utilizando un vaporizador de precisión.
  6. Afeitar el sitio de inyección, que está en un flanco sobre una pierna, utilizando preferentemente un clipper. Limpie con un algodón embebido en alcohol el sitio de inyección dos veces.
  7. Dibujar 250 μl de suspensión celular a una concentración final de 1-2 x 107 células/mL en una jeringa de 1 mL frío y eliminar las posibles burbujas de aire al mover el pistón hacia arriba y hacia abajo. Conecte una aguja de 25G en la jeringa y llenar el espacio dentro de la aguja.
  8. Inserte cuidadosamente la aguja bajo la piel en un ángulo de 30° con el cuerpo cerca de los costados, asegurándose de que la aguja no perforar la cavidad peritoneal o la musculatura de las extremidades.
  9. Aplanar la aguja paralela al cuerpo y aplanar las arrugas en la piel. Lentamente inyectar 50 μl de suspensión celular. Mantenga la aguja en el sitio de la inyección para 10 s para permitir que el BMM se solidifique para evitar cualquier fuga.
  10. Retire lentamente la aguja manteniendo paralelos sin cualquier movimiento hacia un lado. Suavemente Limpie el sitio de inyección con un algodón embebido en alcohol y suelte el ratón para su vivienda.
    Nota: Si el ratón fue anestesiado durante el procedimiento, supervisar al animal hasta que recupere sus adrizamiento reflejos.
  11. Vigilar el crecimiento del tumor usando pinzas de hasta 5 mm de diámetro.

4. inducción de tumores ortotópicos

  1. Preparar los materiales necesarios. Autoclave el quirúrgico herramientas como tijeras, bisturís, aguja de controladores y puntas y pinzas de punta plana. Mantener prácticas Suturas estériles (6-0 absorbible y no absorbible 4-0), torundas de alcohol, cortapelos, crema depilatoria, lubricante ocular, gasa de algodón, solución de yodo povidona 10%, cortinas quirúrgicas, almohadillas, buprenorfina y agentes anestésicos.
  2. Eutanasia a un ratón de donantes (preferiblemente del mismo fondo para el modelo ortotópico) llevando un tumor SQ KPC con una cámara de llenado lento CO2 . Suprimir el tumor SQ cuidadosamente bajo condiciones estériles en una campana de BSL-2 utilizando pinzas estériles y microscissors poco antes de la implantación ortotópica. Durante la supresión del tumor tenga cuidado de no perforar la cavidad peritoneal y lavado el tumor inmediatamente con 2 intercambios de PBS estéril.
  3. Utilizando bisturís estériles, pique el tumor suprimido en trozos de 1 mm3 , colocarlos en una placa Petri que contiene media basal del DMEM estéril fría y almacenar en hielo hasta la implantación.
  4. Administrar el ratón receptor 0.05 - 1 mg/kg de buprenorfina analgésico SQ, de 30 min antes de la cirugía.
  5. Anestesiar los ratones receptores con 2-3% de isoflurano en oxígeno (2 L/min) con un vaporizador de precisión (o de otros agentes anestésicos). Mantenga ratones a 37 ° C cojín para la totalidad del procedimiento de calefacción. Aplicar lubricante en los ojos para evitar la desecación. Prueba la profundidad de la anestesia por la falta de una sorprendente reflejo inicialmente y confirmar la anestesia quirúrgica plano por la falta del reflejo pedal a un pellizco suave del dedo del pie. Mantener la anestesia durante todo el procedimiento quirúrgico.
  6. Coloque el ratón sobre su espalda y suavemente gire hacia su derecha para que quede expuesto el lado izquierdo del abdomen. Eliminar el vello abdominal de ratón con crema depilatoria y limpie con una gasa para no pelo libre entra en la incisión de abdomen post. Preparar el abdomen izquierdo para la cirugía con 3 ciclos de yodo povidona 10% seguido de toallitas de alcohol para desinfectar la piel.
  7. Con un bisturí estéril, hacer una incisión oblicua o transversal de 1.5 cm en la piel, 1 cm a la izquierda de la línea media, debajo de la caja torácica, ligeramente medial al bazo. Luego, extender la incisión a través de la musculatura abdominal, reflejo de la incisión superficial suprayacente.
  8. Localizar el bazo mediante plano con punta pinzas y suavemente lo extraer de la cavidad abdominal. Retraiga el bazo mediante un aplicador de algodón estéril y encontrar la cola del páncreas en la parte inferior del bazo.
  9. Con unas pinzas de punta plana, retraer lateralmente la cola del páncreas.
  10. Recoger pieza un tumor picada desde el ratón de donantes con la punta de una aguja de sutura estéril fina (6-0) y colocar con pinzas estériles.
  11. Mientras que suavemente contrae cuerpo y cola del páncreas lateralmente, inserte la aguja de la sutura que contiene el fragmento de tumor en la cola del páncreas. Pase la sutura lentamente a través del tejido, manteniendo el tumor en contacto con la cola pancreática. Aplicar una o dos suturas adicionales según la orientación del fragmento en relación con el tejido.
  12. Retire la aguja completamente el tejido y mantener el bazo páncreas exteriorizado por un adicional 60 s mientras la inspecciona para detectar cualquier signo de hemorragia o fuga. Entonces, internalizar suavemente les en la cavidad abdominal utilizando fórceps romos.
  13. Cierre la musculatura abdominal con una sutura absorbible de 6-0 o una puntada continua o interrumpida y cierre la piel con un 3-0 a 6-0 no absorbible sutura interrumpida. Descontinuar la anestesia en este punto.
  14. Permitir que el ratón se recupere en su casa jaula con libre acceso al alimento y agua. Coloque la jaula en una almohada para facilitar la recuperación. Monitor signos vitales como respiración, etc., de la perfusión durante el proceso de recuperación.
  15. Confirman los signos de enderezamiento reflejo una vez que el ratón se recupera, y la jaula luego volver puede a la vivienda habitual.
  16. Administrar buprenorfina 0.05 - 0.1 mg/kg 8-12 h después de la cirugía y cada 8-12 h después del procedimiento según sea necesario para las muestras de dolor.
  17. Monitorear el crecimiento del tumor utilizando una bioluminiscencia en vivo sistema de imagen (véase la Tabla de materiales).
    1. Seguir el crecimiento del tumor por proyección de imagen a partir del día 4 después de la implantación ortotópica y realizar proyección de imagen dos veces a la semana.
    2. En el día de la proyección de imagen, administrar (inyección intraperitoneal) 30 mg/kg D luciferin a una anestesia ratón receptor (2-3% de isoflurano en oxígeno (2 L/min)) 10 minutos antes de la proyección de imagen.
    3. Imagen de actividad de luciferasa utilizando el ajuste de la luminosidad sin filtros emisión durante un mínimo de 5 exposición en un sensor de luminiscencia con libre calefactada auto fluorescencia y manteniendo la anestesia para los ratones.

5. ira de tumores SQ

  1. Preparar los materiales necesarios: cuadrada onda electroporator, pedal de seguridad, electrodos (matriz de aguja y pinzas-trode) y adaptadores. Mantener Suturas estériles (no absorbible 4-0), torundas de alcohol, cortar el pelo, crema depilatoria, lubricante de ojos, gasa de algodón, buprenorfina y anestésicos también está cerca.
  2. Esterilizar la pinza o aguja electrodos matriz utilizando la esterilización con gas. No se recomienda el autoclave. Usar un esterilizador de bolas de vidrio para esterilizar los electrodos entre animales.
  3. Administre buprenorfina 0.05 - 0.1 mg/Kg a los ratones con tumores 30 min antes del procedimiento.
  4. Siga los pasos de 4.4-4.5 para inducir la anestesia en ratones con éxito una vez que el implante tumoral cuadrados alcanza los 5 mm de diámetro.
  5. Coloque el ratón anestesiado en su lado al tumor SQ en el flanco. Eliminar el vello con tijeras y piel limpia con un algodón embebido en alcohol.
  6. Para los tumores cuadrados, utilizar electrodos de aguja 2 matriz. Elevar la piel directamente en el sitio del tumor con unas pinzas y colocar los electrodos a través de la piel paralelo al cuerpo asegurándose de que no penetran en la cavidad peritoneal. Una vez a través de la piel, coloque los electrodos de manera tal que soporte el tumor.
  7. Programa electroporator para entregar 100 μs pulsos a una frecuencia de 1 Hz a 1.500 V/cm para un total de 150 pulsaciones. Entregar los pulsos con el pedal de pie. Separado cada conjunto de 10 impulsos en 10 s, con el fin de permitir la disipación de calor y confirmar la posición correcta de los electrodos.
    Nota: Sin el uso de agentes paralíticos, ratones experimentará contracciones musculares con ira que puede causar el desplazamiento de los electrodos a menos que manualmente aseguradas.
  8. Retire los electrodos después de la dosis completa, que no deben exceder de 200 s. registro entrega la tensión de corriente, que se muestra en el electroporator. Permitir que los ratones a recuperar después de ira según pasos 4.14-4.16.

6. ira de tumores ortotópicos

Nota: IRE de orthotopic tumores implica una segunda cirugía de supervivencia en el mismo ratón así que requieren especial aprobación del IACUC local antes de empezar.

  1. Preparar materiales requeridos: autoclave las herramientas quirúrgicas tales como tijeras, bisturís, aguja controladores, señaló fórceps y con punta plana de fórceps. Tenga la siguiente cerca así: Suturas estériles (6-0 absorbible y no absorbible 4-0), torundas de alcohol, cortar el pelo, crema depilatoria, lubricante ocular, gasa de algodón, solución yodo povidona al 10%, cortinas quirúrgicas, almohadillas, electroporator de onda cuadrada, interruptor de pedal de seguridad, electrodos y sus adaptadores, buprenorfina y anestésicos.
  2. Evaluar los ratones para el crecimiento del tumor ortotópico por proyección de imagen en vivo (ver paso 4.17) mediante la inyección intraperitoneal de 30 mg/kg de D-Luciferin.
    Nota: Los tumores ortotópicos son ideales para IRE tratamiento 8 a 10 días post implantación cuando los tumores son claramente visibles y todavía confinado al páncreas como puede verse en las imágenes de luminiscencia luciferasa (ver Resultados de representante).
  3. Siga los pasos 4.4-4.9, para localizar el tumor implantado. Si el tumor no es fácil de localizar, utilizar pinzas de punta romas para mover el estómago y bazo con cuidado para identificar el tumor.
  4. Extraer el tumor con pinzas de punta romas y capturar el tumor con los electrodos de platino de la pinzas-trode. Entregar los pulsos de electroporación conforme a lo programado en el paso 5.7 utilizando la onda cuadrada electroporator en sets de 10 pulsos controlados por el interruptor de pie.
  5. Mantener el tumor exteriorizado por al menos 60 post s IRE a monitorear para detectar cualquier signo de hemorragia. Inserte el tumor en la cavidad abdominal y cerrar la incisión como la descrita anteriormente (pasos 4.13 4.16) y controlar el ratón hasta que recupera.
  6. Monitorear los efectos de la ira sobre el crecimiento tumoral mediante imágenes en vivo de luciferase según paso 4.17.

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Resultados

Seguimos el procedimiento descrito anteriormente y genera tumores cuadrados en 5-6 semana viejo tipo salvaje C57BL/6 ratones inoculados con 1 x 106 células con 50% BMM. Cuando el tamaño de tumor alcanza 5-6 mm de diámetro, algunos de los ratones fueron sacrificados y sus tumores fueron suprimidos, implantaron orthotopically en un receptor ratones C57BL/6. IRE fue realizada 10 días post implante, como se muestra en la línea de tiempo en la figura 1....

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Discusión

En este estudio, hemos demostrado un modelo con ratones inmunocompetentes para PC que se puede utilizar para estudiar los efectos de la ira en el crecimiento del tumor. Actualmente, IRE se utiliza como una técnica de ablación termal no sólo en pacientes de PC localmente avanzados altamente seleccionados que no tienen progresión de la enfermedad distante después de meses de la terapia preoperatoria. Su uso ha sido limitado porque la mayoría de los pacientes con PC localmente avanzado desarrollar enfermedad metastásica dis...

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Divulgaciones

Los autores no tienen divulgaciones financieras pertinentes.

Agradecimientos

RRW ha recibido el apoyo para este trabajo de una beca de investigación aplicada colaborativa financiado por el C3 San Diego Padres Pedal la causa (#PTC2017).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Electroporador de onda cuadrada ECM 830Aparato de Harvard BTX# 45-0002 ( 58018-004 )
2 electrodo de matriz de agujaAparato de Harvard45-0167
Interruptor de pie de seguridadAparato de Harvard45-0211
Pinza de platinoAparato de Harvard  45-0486
DMEM-F12medios ThermoFisher Scientific11320-033
Suero fetal bovinoThermoFisher Scientific10437028
TripsinaThermoFisher Scientific25200056
MatrigelCorning 354230
IsofluranoSigma-Aldrich, Inc.
LacrilubeFisher Scientific 
BuprenorfinaFisher Scientific 
D-luciferrinaPerkin Elmer122799
IVIS  Sistema de imágenes Spectrum In VivoPerkin Elmer124262
Cepa de ratón C57BL/6JEl Laboratorio Jackson Línea de 6
(KPC-Luc 4580)J.J. Yeh Lab en la Universidad de Carolina
Agujas de jeringa BD PrecisionglideSigma-Aldrich, Inc.
Hisopo con alcohol (70% de alcohol isopropílico)BD326895
Calibradores digitalesThermoFisher Scientific14-648-17
Bisturíes desechables, estérilesVWR21909
Aplicadores con punta de algodónVWR89198
Aguja de sutura, 45 cm, tamaño 6-0Harvard Apparatus72-3308
Aguja de sutura, 45 cm, tamaño 4-0Harvard Apparatus72-3314
Povidona yodada 10%BD29900-404
Almohadilla térmica desechable KENT SCIENTIFIC CORP.TP-3E
CORTADORA DE PELO PARA RATÓNKENT SCIENTIFIC CORP.CL8787
Paño quirúrgicoHarvard Apparatus59-7421
Solución salina tamponada con fosfatoThermoFisher Scientific10010023
79263219090646NC1292810células 000664/Blackdel NorteZ192406

Referencias

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