Estrategias de muestreo y procesamiento de las muestras de tejido de Biobanco de porcinos modelos biomédicos

Resumen

La aplicación práctica y el rendimiento de métodos para la generación de muestras de tejido representativo de modelos animales porcinos para un amplio espectro de análisis aguas abajo en el Banco de proyectos se demuestran, incluyendo volumetría, muestreo al azar sistemático, y procesamiento de muestras de tejido de tipo cualitativo y cuantitativo análisis morfológicos y moleculares de diagnóstico.

Resumen

En la investigación médica aplicada, modelos porcinos constantemente han vuelto más populares. Considerando el alto valor de cada animal, particularmente de cerdos genéticamente modificados modelos y a menudo limitado número de animales disponibles de estos modelos, establecimiento de colecciones (Biobanco) de muestras de tejido adecuadamente procesado adecuado para un amplio espectro de métodos de análisis posteriores, incluyendo análisis no especificados en el momento del muestreo, representan enfoques significativos para aprovechar al máximo el valor traslacional del modelo. Con respecto a las peculiaridades de la anatomía porcina, recientemente han establecido directrices amplias para generación estandarizado de representante, muestras de alta calidad de diferentes órganos porcinos y tejidos. Estas directrices son indispensables para la reproducibilidad de los resultados y su comparabilidad entre diferentes estudios e investigadores. La grabación de los datos básicos, como el órgano pesos y volúmenes, la determinación de los lugares de muestreo y de los números de las muestras de tejido que se generen, así como su orientación, tamaño, proceso y direcciones de ajuste, es factores relevantes determinar la generalización y la utilización de la muestra para análisis morfológicos moleculares, cualitativas y cuantitativas. Aquí, se presenta una demostración ilustrativa, práctica, paso a paso de las técnicas más importantes para la generación de representante, espécimen multiuso Biobanco de tejidos porcinos. Los métodos aquí descritos incluyen la determinación de volúmenes de órganos y tejidos y densidades, la aplicación de un procedimiento de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen de órganos parenquimales por punto de conteo, la determinación del grado de contracción de tejido relacionadas con la fijación histológica de las muestras y la generación de muestras aleatoriamente orientadas para análisis estereológicos cuantitativos, como isotrópica uniforme aleatorio (IUR) las secciones generadas por los métodos de "Orientador" y "Isector" y vertical uniforme aleatorias secciones (VUR).

Introducción

En la medicina traslacional, los cerdos son cada vez más común para el uso como modelos de animales grandes^1,2,3,4,5, debido a varias ventajas similitudes el porcino y anatomía humana y fisiología y la disponibilidad de métodos biológicos moleculares establecidos permitiendo generación de adaptados, modificados genéticamente modelos de cerdo para una amplia gama de condiciones de enfermedad^1,4.

Sin embargo, en comparación....

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí utilizan muestras de tejidos derivadas animales muertos y cumplen con las regulaciones legales alemanas del bienestar animal.

1. volumetría

1. Técnica de inmersión para la determinación de densidades de tejido/órgano (figura 1 y figura 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. Preparar materiales: hojas bisturí, toallas de papel, pinzas finas, escalas estándar de laboratorio, vidrio o vasos de plásticos, solución sal....

Resultados

Técnica de inmersión para la determinación de la densidad del tejido/órgano

Figura 12A -B muestra la representación determinación de la densidad y el volumen de un riñón porcino utilizando la técnica de inmersión que se describe en el paso 1.1 (figura 1, figura 2). Resultados más representativos de las mediciones de densidad d.......

Discusión

Generación de colecciones de muestras Biobanco de modelos animales porcinos requiere técnicas robustas y protocolos para la determinación de volúmenes de órganos y tejidos, la generación reproducible de representante, las muestras de tejido redundante apto para una amplia gama de métodos de análisis diferentes y por la aleatorización de la orientación de las secciones de la muestra para los análisis cuantitativos de estereológicos. Los métodos descritos en el presente artículo se adaptan a los tamaños de porcinos órganos.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	Carl Roth GmbH, Alemania	Agar (polvo), Cat.: 5210.3	Disolver aproximadamente 1 g de agar en 10 ml de agua fría en un vaso de vidrio o plástico, calentar en horno microondas a 700 W, hervir la solución dos veces agitando rigurosamente. Echa en el molde mientras aún está caliente y deja que se solidifique. Precaución: Mientras manipula con agar líquido caliente, use gafas protectoras y guantes.
Pinza	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Alemania	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Cualquier tipo de pinza (mecánica o electrónica) también servirá.
Moldes de fundición (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermü ECM, Alemania	Einbettschä lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Cualquier otro tipo de molde de fundición de metal utilizado para la inclusión en parafina también servirá.
Plantillas de copia de cuadrículas cruzadas (5 mm - 6 cm)	n.a.n.a.Las		plantillas de copia de cuadrículas cruzadas (5 mm - 6 cm) se proporcionan en el archivo de datos complementario de Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Plantillas de copia de círculos equiangulares y ponderados por coseno	n.a.n.a.Las		plantillas de copia de círculos equiangulares y ponderados por coseno se proporcionan en Nyengaard & Gundersen. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) y en Gundersen et al. Principios estereológicos y procedimientos de muestreo para patólogos toxicológicos. En: Haschek y Rousseaux&agudo; s Manual de Patología Toxicológica. 3ª ed., 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Abrazaderas plegables (clips de carpeta YIHAI, 15 mm y 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 e Y10005	Cualquier otro tipo de abrazaderas plegables estándar para oficinas también servirá.
Pinzas (anatómicas)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Alemania	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Cualquier tipo de pinza anatómica servirá.
Solución de formaldehído al 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Alemania	Formaldehído 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Diluido al 4% a partir de una solución concentrada. Tampón a pH neutro. Use protección adecuada para los ojos, las manos y las vías respiratorias. Procese muestras de tejido fijadas en solución de formaldehído debajo de una campana extractora y use gafas protectoras y guantes de laboratorio.
Papel cuadriculado (para calibración)	Bü romarkt Bö ttcher AG, Jena, Alemania. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Cualquier tipo de papel cuadriculado (a escala milimétrica) servirá.
Vasos de precipitados de laboratorio (5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Alemania	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Cualquier tipo de vasos de vidrio o plástico de 5 y 100 ml de volumen servirá.
Báscula	laboratorioMettler Toledo GmbH, Gieß es, Alemania	PM6000	Cualquier báscula de laboratorio estándar con rangos de medición entre 0,1 mg y aproximadamente 20 g, respectivamente entre 100 mg y aproximadamente 500 g hará
	AG, Gö ttingen, Alemania	BP61S Cuchillas
de micrótomo	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermü nde, Alemania	FEATHER Microtomo blasdes S35, Cat.:14700	Cualquier tipo de hojas de micrótomo de un solo uso servirá.
Morfometría/planimetría software/sistema	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Descargar de https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Alemania	de análisis de		imágenes VideoplanTM
Cámara	Nikon	D40	Cualquier tipo de cámara fotográfica digital que se pueda montar en un trípode servirá.
Transparencias de plástico	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Alemania	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Cualquier transparencia de plástico imprimible (láser) servirá.
Tablas de números aleatorios	n.a.n.a.Las		tablas de números aleatorios se pueden generar cómodamente (con números definidos de números aleatorios y dentro de intervalos definidos), utilizando generadores de números aleatorios, como: https://www.random.org/
Hojas de afeitar	Plano GmbH, Wetzlar, Alemania	T5016	Cualquier tipo de hojas de afeitar servirá.
Regla	Bü romarkt Bö ttcher AG, Jena, Alemania. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparente, Cat.: ln30	Cualquier tipo de regla a escala de cm-mm servirá también.
Solución salina (0,9%)	Carl Roth GmbH, Alemania	Cloruro de Natrium, >99% Cat.: 0601.1	Para preparar solución salina al 0,9%, disuelva 9 g de NaCl en 1000 ml de agua destilada a 20 °C.
Hojas de bisturí	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Alemania	BRAUN Cuchillas quirúrgicas N° 22	Cualquier tipo de hojas de bisturí servirá.
Escáner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Cualquier tipo de escáner de oficina estándar capaz de escanear con resoluciones de 150-600 ppp servirá.
Dispositivos de corte	n.a.n.a.Los		ejemplos de dispositivos de corte autoconstruidos se pueden encontrar en Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) y en el archivo de datos complementario de Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Moldes de fundición esférica (por ejemplo, de 25,5 mm de diámetro)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Alemania	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25,5 mm	Los moldes de fundición esférica también pueden ser de construcción propia u obtenerse de otros proveedores de confitería (para bombones). Los moldes de fundición indicados aquí son en realidad el paquete/envoltura de cuerpos de pralinés huecos (primero coma los bombones y luego use el paquete para la generación de secciones del sector i)
Alambre fino	Basteln & Hobby Schobes, Straß lejana, Alemania. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Cualquier otro tipo de alambre delgado también servirá.
Papel de seda	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Alemania	Toallitas de trabajo Declcate-Blanco, Cat.: 1-5305	Cualquier otro tipo de papel de papel de papel de laboratorio también servirá.
Bolígrafo resistente al agua	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nü rnberg, Grmany	Lumocolor permanente 313, 0,4 mm, S, negro, Cat.: 313-2	Cualquier otro tipo de bolígrafo resistente al agua también servirá.