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Artículo de método

Estrategias de muestreo y procesamiento de las muestras de tejido de Biobanco de porcinos modelos biomédicos

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DOI:

10.3791/57276

⸱

6 de marzo de 2018

 , 
1Institute of Veterinary Pathology at the Centre for Clinical Veterinary Medicine, LMU Munich

En este artículo

Resumen

La aplicación práctica y el rendimiento de métodos para la generación de muestras de tejido representativo de modelos animales porcinos para un amplio espectro de análisis aguas abajo en el Banco de proyectos se demuestran, incluyendo volumetría, muestreo al azar sistemático, y procesamiento de muestras de tejido de tipo cualitativo y cuantitativo análisis morfológicos y moleculares de diagnóstico.

Resumen

En la investigación médica aplicada, modelos porcinos constantemente han vuelto más populares. Considerando el alto valor de cada animal, particularmente de cerdos genéticamente modificados modelos y a menudo limitado número de animales disponibles de estos modelos, establecimiento de colecciones (Biobanco) de muestras de tejido adecuadamente procesado adecuado para un amplio espectro de métodos de análisis posteriores, incluyendo análisis no especificados en el momento del muestreo, representan enfoques significativos para aprovechar al máximo el valor traslacional del modelo. Con respecto a las peculiaridades de la anatomía porcina, recientemente han establecido directrices amplias para generación estandarizado de representante, muestras de alta calidad de diferentes órganos porcinos y tejidos. Estas directrices son indispensables para la reproducibilidad de los resultados y su comparabilidad entre diferentes estudios e investigadores. La grabación de los datos básicos, como el órgano pesos y volúmenes, la determinación de los lugares de muestreo y de los números de las muestras de tejido que se generen, así como su orientación, tamaño, proceso y direcciones de ajuste, es factores relevantes determinar la generalización y la utilización de la muestra para análisis morfológicos moleculares, cualitativas y cuantitativas. Aquí, se presenta una demostración ilustrativa, práctica, paso a paso de las técnicas más importantes para la generación de representante, espécimen multiuso Biobanco de tejidos porcinos. Los métodos aquí descritos incluyen la determinación de volúmenes de órganos y tejidos y densidades, la aplicación de un procedimiento de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen de órganos parenquimales por punto de conteo, la determinación del grado de contracción de tejido relacionadas con la fijación histológica de las muestras y la generación de muestras aleatoriamente orientadas para análisis estereológicos cuantitativos, como isotrópica uniforme aleatorio (IUR) las secciones generadas por los métodos de "Orientador" y "Isector" y vertical uniforme aleatorias secciones (VUR).

Introducción

En la medicina traslacional, los cerdos son cada vez más común para el uso como modelos de animales grandes1,2,3,4,5, debido a varias ventajas similitudes el porcino y anatomía humana y fisiología y la disponibilidad de métodos biológicos moleculares establecidos permitiendo generación de adaptados, modificados genéticamente modelos de cerdo para una amplia gama de condiciones de enfermedad1,4.

Sin embargo, en comparación con modelos de roedores, se limita el número de animales de un modelo de cerdo respectivo que puede prestarse para experimentos en cualquier momento. Esto es debido al intervalo de generación porcina de aproximadamente un año y los esfuerzos financieros y tiempo necesarios para la generación de modelos porcinos y cría de animales. Por lo tanto, los individuos de un modelo porcino, así como las muestras que se pueden generar de estos cerdos, son muy valiosos, especialmente si genéticamente modelos porcinos o cuestiones experimentales a largo plazo (por ejemplo, las complicaciones tardías de enfermedades crónicas) se examinan en individuos de2,6,7.

En el curso de cualquier estudio, realización de análisis adicionales que no había sido previsto en el diseño experimental inicial del estudio puede más tarde resultan para ser relevantes, por ejemplo, distintas preguntas que surgen de previamente descubiertos por dirección resultados inesperados. Si las muestras adecuadas para tales experimentos adicionales no están disponibles, desproporcionadamente elevado costo y gastos de tiempo podrían ser necesarios generar cerdos adicionales y muestras de tejido. Para estar preparado para tales eventualidades, generación de colecciones de Biobanco de conservado muestras de respaldo de diferentes órganos, tejidos o bio-líquidos, cuantitativa y cualitativamente adecuados para una amplia gama de análisis posteriores, se considera un importante enfoque2,6,7. Derivando beneficios óptima de un modelo animal porcino, la disponibilidad de muestras adecuada Biobanco también ofrece la posibilidad única para efectuar un amplio espectro de métodos de análisis diferentes sobre los materiales idénticos a nivel de órganos múltiples en la misma cada animal, por ejemplo, por la distribución de las muestras a los científicos de diferentes grupos de trabajo organizados en una red de investigación2,6,7. Además, la estrategia de muestreo '' progresista '' en biobancos también contribuye a una reducción del número de animales necesarios en un estudio. Las ventajas del modelo porcino biobancos han demostrado recientemente en un órgano múltiple, multiomics estudio, examen de órganos diafonía en un modelo porcino genéticamente modificado de la diabetes a largo plazo, utilizando muestras del Biobanco cerdo Munich MIDY 2.

Hay algunos requisitos obligatorios Biobanco de muestras generalmente deben cumplir para establecer la fiabilidad y la interpretabilidad de los resultados de los análisis realizados posteriormente. Las muestras deben generarse reproducible, y deben ser adecuadamente representante, es decir, que reflejan las características morfológicas y moleculares interesadas del tejido/órgano las muestras fueron tomadas de7. Para ser conveniente para una amplia gama de tipos de análisis posteriores, las muestras deberán tomadas en cantidades suficientes y procesadas según las demandas (incluyendo las condiciones de tiempo y temperatura) de los diferentes métodos analíticos, incluyendo descriptivo Análisis histopatológicos, como cryohistology, parafina plástico histología, inmunohistoquímica, hibridación en situ , análisis microscópico ultraestructural de electrón y diagnóstico análisis de laboratorio clínico, así como moleculares Análisis de DNA, RNA, proteínas y metabolitos.

Para permitir la evaluación de una amplia gama de distintos parámetros morfológicos cuantitativos tales como números, volúmenes, longitudes o superficies de las estructuras tisulares distintos análisis estereológicos cuantitativa, planos de sección al azar de la las muestras histológicas de los respectivos órganos/tejidos necesitan ser preparado7,8,9,10,11. En estudios morfológicos cuantitativos, la determinación precisa del volumen total del tejido, órgano o compartimiento del órgano, las muestras fueron tomadas de (es decir, el espacio de referencia) es de crucial importancia7,9 , 12 para calcular las cantidades absolutas de los parámetros de interés en el respectivo órgano, tejido u organismo. Finalmente, el efecto de la contracción relacionada con la inclusión del tejido durante la preparación de secciones histológicas tiene que ser determinada y tener en cuenta13. Por lo tanto, cuantitativos análisis estereológicos, especialmente de muestras archivadas (fijada bloques de tejido embebido, cortes histológicos, las muestras de tejido, etc.) de los estudios anteriores son a veces severamente limitada o incluso imposible12, particularmente si la volumetría de los respectivos órganos/tejidos no se realizó, si no hay diseños de muestreo adecuado se aplicaron para garantizar muestras representativas, si los números y cantidades de muestras individuales disponibles no son suficientes, o si el procesamiento de la muestras es incompatible con la estimación de los parámetros morfológicos cuantitativos de interés. Debido a los múltiples posibles factores que influyen en la adecuación de los materiales de archivo-muestra para los análisis de distintos parámetros morfológicos cuantitativos inequívocamente no puede ser respondida, pero depende de la cuidadosa evaluación de cada caso individual.

Así, como la ubicación, tamaño, número, proceso, dirección de ajuste y orientación de muestras potencialmente afectarán los resultados de los análisis posteriores, estos factores son de gran importancia y deben ser considerados en el diseño experimental de cualquier estudio. En cuanto a estos aspectos y las particularidades de la anatomía porcina, directrices de muestreo completa, detallada, a gran escala recientemente se han establecido modelos animales adaptados al porcino, proporcionando una sólida referencia estandarizados, reproducibles y la eficiente generación de muestras redundantes, adecuadamente procesadas, alta calidad de más de 50 diferentes porcino órganos y tejidos6,7.

Las descripciones metodológicas y el video tutorial se muestra en el presente artículo proporcionan detallada, ilustrativo, comprensible, instrucciones paso a paso para el funcionamiento práctico de una variedad de técnicas de volumetría, toma de muestras de tejidos porcinos y órganos y procesamiento de las muestras de tejido para métodos de diferente análisis aguas abajo. Las técnicas recomendadas incluyen métodos para determinación de densidades basadas en los principios de Arquímedes y Cavalieri9y volúmenes de órganos y tejidos, incluyendo la determinación de las dimensiones de la contracción tridimensional de tejidos relacionados con la incrustación en diferentes inclusión media14 durante el proceso de la examinación histológica, acerca de la aplicación del muestreo aleatorio sistemático ponderado de volumen posible, procesamiento de muestras de tejido muestreado para diferentes posterior Análisis7,8,9,15y generación de apropiadamente orientan y procesaron muestras para posibles análisis estereológicos cuantitativa7,8, 9,10,11. Junto a su aplicación en proyectos de Biobanco porcino, los métodos demostrados son generalmente apropiados para examinar propiedades cuantitativas histo-morfológico de órganos/tejidos todos los estudios. Además, diseños de muestreo al azar sistemático son particularmente beneficios para la generación de muestras representativas en experimentos utilizando métodos de análisis molecular para detectar alteraciones de la abundancia de, por ejemplo, ARN, proteínas o metabolitos en distintos órganos y tejidos.

Los párrafos siguientes proporcionan una breve introducción a estos métodos, mientras que su rendimiento práctico se describe en la sección de protocolo.

Determinación de volúmenes de órganos y tejidos
Determinación de volúmenes y pesos de órganos es importante en varios parámetros experimentales, como estos factores podrían indicar cambios, potencialmente relacionados a experimentalmente examinan factores de interés. El volumen total de un órgano, tejido también es necesaria para calcular parámetros cuantitativos absolutos (por ejemplo, el número total de células), de densidades de volumen stereologically Estimado numérico(es decir, el número de células por unidad de volumen del tejido)7,12. Aparte de técnicas de uso de equipo técnico complejo, tales como tomography de la computadora, hay básicamente tres métodos prácticos utilizados para determinar el volumen absoluto de un órgano o tejido. El volumen de un órgano puede determinarse "volumétrica medida directa" según el principio de Arquímedes, es decir, medición del volumen de agua o solución salina desplazados por la estructura cuando completamente sumergida. Sin embargo, de órganos porcinos comparable grandes, estos enfoques son imprácticos y propensas a la imprecisión, ya que requieren matraces volumétricos/medición muy grande. Más convenientemente, se puede calcular el volumen de un órgano/tejido de su peso y densidad7,12,16, que eficientemente puede ser determinado mediante el «método de inmersión»7,12 ,16 (paso protocolo 1.1.). Volúmenes de órganos y tejidos se pueden calcular también mediante volumetría enfoques basados en el "principio de Cavalieri" (1598-1647). En términos simples, se establece el principio de Cavalieri, que si dos objetos son seccionados en planos paralelos a un plano de tierra, y los perfiles de las secciones de cortan a través de los dos objetos en la correspondiente Distancias desde el plano de tierra tienen las mismas áreas, los dos objetos tienen el mismo volumen. Así, el volumen de los objetos forma arbitrariamente puede estimarse como el producto de sus áreas de Perfil de sección en planos paralelos, igualmente distante de la sección y la distancia entre los planos de sección. Esto es comprensible con la siguiente analogía: considere dos pilas que consiste en el mismo número de monedas idénticas se colocan lado a lado, una pila con la ordenada de monedas apilado uno encima del otro dando forma cilíndrica de la pila de monedas y el otro pila de monedas con el centro coloca monedas (Figura 3A). Aunque las formas de las dos pilas de moneda son diferentes, sus volúmenes son los mismos, desde las áreas de las monedas en los niveles correspondientes de ambas pilas (es decir, las áreas de los perfiles de secciones paralelas de cortan a través de dos pilas de moneda en distancias iguales desde el de tierra) son idénticos. Estimación de los volúmenes de órganos porcinos y tejidos utilizando el principio de Cavalieri7,12,15 se describe en el paso 1.2.

Determinación del grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión histológica
En el análisis de varios parámetros morfológicos cuantitativos medidos en las secciones histológicas del tejido, el efecto de la contracción relacionada con la inclusión del tejido que ocurre durante el proceso de la histología del tejido debe ser determinado y tomado en cuenta. El grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión puede ser variable y depende tanto en el tejido, su procesamiento y el medio empotrar8,13,17,18,19. Generalmente, se producen cambios relacionados con la inclusión del volumen de una muestra de tejido (es decir, principalmente la contracción) en las tres dimensiones del espacio y, por tanto, afecta a todos los parámetros dimensionales estimados por análisis cuantitativos estereológicos8 . Básicamente, se puede estimar el grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión, expresado como el factor de contracción de tejido lineal (fS), como se muestra en el paso 1.3. y se utiliza para la corrección de parámetros morfológicos cuantitativos (sensible a la contracción)14.

Muestreo aleatorio sistemático ponderado por el volumen de órganos/tejidos
Para el establecimiento de una colección de Biobanco de muestras de órganos y tejidos porcinos, enfoques de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen como se describe en el paso 2 han demostrado para ser técnicas prácticas, ahorro de tiempo y eficientes para la generación de representante, tejido de usos múltiples muestras7,8,9,15.

Generación de secciones isotrópico aleatorio uniforme y Vertical uniforme aleatoria secciones para cuantitativos análisis estereológicos
Las muestras de tejido de Biobanco deben ser conveniente para una amplia variedad de métodos diferentes análisis estereológicos cuantitativa para la estimación de un máximo de parámetros que no se pudo determinar sin una muestra adecuadamente preparada. Casi todos los parámetros estereológicos cuantitativos pueden determinarse, utilizando «isotrópico (independiente) uniforme aleatorio (IUR) las secciones»8,9. En las secciones IUR, la orientación tridimensional del plano de sección de la muestra de tejido es al azar. Esto puede lograrse por asignación al azar de la posición de la muestra de tejido en relación con la posición del plano de sección, como se aplica en el método de "Isector"11 (paso 3.1 del Protocolo), o por asignación al azar de la orientación del plano de sección relativa a la muestra de tejido, como en el método de "Orientadores"10 (paso 3.2 del Protocolo). En muestras de tejido, como piel o mucosa muestra mostrar un eje vertical presente de forma natural, o definido y bien identificable, preparación de "uniforme aleatorio (VUR) las secciones verticales" (paso de protocolo 3.3.) estrictamente seccionado en el plano de su eje vertical es ventajoso8,20. Para un discurso completo de los fundamentos teóricos del muestreo de IUR/VUR y una discusión amplia de posibles análisis estereológicos cuantitativas aguas abajo, el lector interesado se refiere a los libros de texto de estereología cuantitativa en la vida Ciencias8,9.

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Protocolo

Todos los métodos descritos aquí utilizan muestras de tejidos derivadas animales muertos y cumplen con las regulaciones legales alemanas del bienestar animal.

1. volumetría

  1. Técnica de inmersión para la determinación de densidades de tejido/órgano (figura 1 y figura 2) 7 , 12 , 16
    1. Preparar materiales: hojas bisturí, toallas de papel, pinzas finas, escalas estándar de laboratorio, vidrio o vasos de plásticos, solución salina al 0.9% y titulares construido por la propia muestra (figura 2A).
    2. Suprimir un pedazo de tejido (tamaño máximo: 2 x 2 x 2 cm3) de los órganos y tejidos, específicamente desde el compartimiento del órgano de interés. Órganos pequeños, como la pituitaria o la glándula pineal, son medidos en su totalidad.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el tamaño de la muestra es notablemente más pequeño que el diámetro interior de la taza (paso 1.1.5 et seq.) y su nivel de llenado para permitir la inmersión completa de la muestra sin contacto con las paredes internas del vaso en el paso 1.1.7.
    3. Limpiar cuidadosamente la muestra con papel de cocina para eliminar el exceso de sangre/tejido líquido.
    4. Pesar la muestra en una balanza de precisión y registrar el peso de la muestra (mS). Determinar el peso de las muestras de tejido pequeñas con mg (figura 1A).
    5. Lugar un vaso lleno de solución salina al 0.9% temperatura en la escala. No llene completamente el vaso, para permitir una inmersión de la muestra de tejido en el paso posterior sin desbordamiento.
      PRECAUCIÓN: Utilice un tamaño de vaso apropiado para el tamaño y peso de las muestras de tejido a medir y el rango de medición eficaces de la escala. Para muestras más grandes hasta 2 x 2 x 2 cm3, un tamaño de vaso de precipitados de 50 – 100 mL es apropiado en combinación con una escala de medición de aproximadamente de 100 mg a 500 g, mientras que para muestras pequeñas, utilice vasos de 5 – 10 mL en combinación con Balanzas de precisión con rangos de medición entre aproximadamente 0.1 mg y 20 g.
    6. Sumerja el sostenedor de la muestra (es decir, un lazo lo suficientemente rígido de alambre fino o algo similar, figura 2A) en la solución salina en una posición marcada (flechas en figura 2, figura 1By figura 2B). Luego, restaura (Tara) la pantalla de la báscula a cero.
    7. Colocar cuidadosamente la muestra de tejido para el sostenedor de la muestra y sumergir completamente la muestra con la solución salina hasta alcanzar la posición marcada en el portamuestras (flechas en figura 2, figura 1By figura 2B).
      PRECAUCIÓN: La muestra sumergida y el sostenedor de la muestra no deben tener contacto con las paredes internas o el fondo del vaso o la superficie de la solución salina.
    8. Mientras sostiene el portamuestras y la muestra sumergida en esa posición, registrar el peso visualizado en la báscula (mL), refiriéndose al peso de solución salina desplazado por la muestra de tejido (figura 1 C, figura 2B, y Figura 2).
    9. Calcular el volumen de la muestra (VS) de mLy la densidad de la solución salina a temperatura ambiente (20 ° C) (solución salina ρ = 1,0048 g/cm³) como VS = mL/ Salina de ρ [g/g/cm³] (Figura 1).
    10. Calcular la densidad de la muestra de tejido (ρmuestra) el peso (es decir, masa) de la muestra (mS) y su volumen (VS): muestra ρ = mS /VS[g/cm³] (figura 1).
    11. Para órganos medidos en su totalidad, repita la medición tres veces y calcular la densidad del órgano promedio de los valores de medición individuales. Grandes órganos/tejidos, realizar mediciones repetidas con muestras diferentes del mismo órgano/tejido/órgano compartimiento y calcular la densidad media de las mediciones individuales, por consiguiente.
    12. Calcular el volumen total del compartimiento del órgano/tejido/órgano de su peso y densidad (figura 1).
  2. Aplicación del método de Cavalieri para la determinación de volúmenes de órgano porcino 7
    1. Preparar materiales: regla, pinza, cuchillo, tijeras, pinzas, lápiz resistente al agua, transparencias plásticas, scanner, Foto cámara y rejillas cruzadas impresas en plástico transparencias.
    2. Coloque el totalidad de órganos y tejidos en una superficie lisa (corte de base) y mida la longitud (l) del órgano a lo largo de su eje longitudinal (figura 3B, figura 5A).
    3. Cortar el órgano/tejido completo equidistantes paralelos ortogonal al eje longitudinal del órgano (figura 3, figura 5B). Elija una distancia d entre dos secciones (es decir, el espesor de sección intervalo seccionamiento, generalmente aproximadamente 1 cm) lo suficientemente pequeñas para obtener un número suficiente de placas de tejido/órgano. Posición al azar la primera sección dentro de una distancia entre 0 y el intervalo de seccionamiento desde el margen del órgano. Mientras corte, visualizar la posición y orientación de cada plano de sección, para obtener aproximadamente paralelo de órganos y tejidos las losas de espesor aproximadamente uniforme.
      Nota: El número de placas de tejido/órgano necesario depende de la forma y el tamaño de los órganos y tejidos examinados. Si órganos pequeños o muestras deben ser seccionados en losas delgadas de ≤5 mm, incrustar las muestras en agar antes de seccionamiento (ver paso 1.3.3.) y usar un dispositivo técnico para rebanar de la muestra embebido en agar. Intervalos de seccionamiento empíricamente recomendables para porcinos más órganos y tejidos, así como ejemplos de dispositivos de corte, se indican en el Material complementario de "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"7.
    4. Colocar todos los bloques de órganos y tejidos en la misma superficie hacia abajo en la base de corte (es decir, constantemente en el derecho o el plano de la sección izquierda de cada losa de órgano, figura 3D, figura 5) y contar las losas (n).
    5. Obtener perfiles de sección de las placas de tejido por uno de los siguientes métodos:
      1. Cuidadosamente coloque las placas de tejido en transparencias de plástico debidamente etiquetados, manteniendo la orientación de sus superficies superior e inferior de la sección. Trace los contornos de las placas de tejido en las transparencias de plástico usando un lápiz resistente al agua (figura 3E1-2).
      2. Tomar imágenes fotográficas de las placas de tejido, sosteniendo la cámara verticalmente sobre la superficie de la sección (figura 3F). Para la calibración, coloque una regla de tamaño al lado de las placas de tejido.
      3. Analizar las placas de tejido en un escáner plano manteniendo la orientación de las superficies de sección superior e inferior (figura 3). Para la calibración, coloque una regla de tamaño al lado de las placas de tejido.
    6. Medir las áreas de los perfiles de sección (calcada, fotografiada o escaneada) de todos los bloques de tejido por uno de los siguientes métodos:
      1. Recubrimiento o superposición de los perfiles de la losa de órgano trazado con un tamaño adecuado, rejilla calibrada de cruces equidistantes imprime una transparencia plástica y todos los cruces de golpear el área del perfil (figura 3E3-4; Compárese con Figura 5). Calcular el área de Perfil de sección de la losa de cada órgano al multiplicar al número de cruces que golpea el área del perfil por el área correspondiente a una cruz.
        Nota: Para recibir el volumen suficientemente precisa estimaciones, elegir una rejilla cruzada con una distancia suficientemente pequeña entre cruces adyacentes, que cruza un promedio de al menos 100 llegará a las superficies de sección de las losas de un órgano en cada caso examinado del estudio . Tamaños de rejilla cruzada empíricamente recomendable para porcino más órganos y tejidos se indican en el Material complementario de "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"7.
      2. Medir las áreas de las placas de tejido en las imágenes digitales de fotos/exploraciones usando apropiado disponible comercialmente o freeware morfometría suave - y aplicaciones de hardware (figura 3 H), como un sistema de análisis de imagen comercial de21, o ImageJ22.
        Atención: Nota que uno tejido losa (la primera o la última) se coloca en el escáner descansando sobre su superficie natural, respectivamente, se enfrenta a la cámara con su superficie natural. Por lo tanto, el escaneado de la imagen, la imagen de esta losa, no mostrará una superficie de sección. Por lo tanto, no hay Perfil de área de sección se mide en la imagen de escaneado de imágenes y fotos de esta losa de tejido (figura 3I). También nota excesiva proyección presente en imágenes escaneadas y fotografías de las losas de órganos y tejidos, es decir, sólo medir las áreas de los perfiles de sección real, pero no del tejido en la imagen de mentira detrás de la superficie de la sección de la losa (figura 12 G-H).
    7. Calcular el volumen del órgano estima como el producto de la suma de todos los ámbitos de Perfil de sección correspondientes de todos los bloques de tejido por caso (es decir, constantemente de la derecha o la izquierda, respectivamente, la superficie de la sección superior o inferior de cada órgano de la losa y el espesor medio de las losas (es decir, el cociente de la longitud medida del eje vertical del órgano (l) y el número de losas)15.
  3. Determinación del grado de contracción de tejido tridimensional relacionado con la incorporación durante el procesamiento de las muestras de tejido para histología
    1. Preparar materiales: cuchillas microtomo, fórceps, agar, moldes de fundición de metales, scanner digital y regla de tamaño (p. ej., papel milimetrado).
    2. Cortar una superficie fresca, de sección plana de una muestra de tejido fijo.
      Nota: Si utilizando muestras de fácilmente deformables () tejidos (tejido adiposo, tejidos gelatinosos), incorporar la muestra de tejido fijo en agar antes de seccionamiento (Figura 4A).
    3. Para embeber la muestra en agar:
      1. Mezclar polvo de agar estándar como para medio de cultivo Microbiología con un volumen adecuado de agua (aproximadamente 0,5 – 1 g agar/10 mL de agua) en un vaso de vidrio. Revolver la mezcla y calentar en el microondas a 700 W hasta que hierva de 3 a 5 s. revolver la mezcla y hervir nuevamente por 3 – 5 s.
      2. Opcionalmente, para aumentar el contraste del agar para la muestra de tejido, tinte el agar líquido, por ejemplo, con tinta negra (Añadir tinta de 1 mL a 10 mL de agar líquido caliente y agitar vigorosamente).
      3. Verter el agar caliente en un molde de bastidor (por ejemplo, un molde de metal utilizado para parafina inclusión, figura 10A-D) y sumerja la muestra de tejido fijo en el agar caliente. Dejar que el agar enfriar hasta la solidificación, retire el molde y corte el bloque de agar con el tejido embebido usando un micrótomo u hoja de afeitar.
        PRECAUCIÓN: Durante la manipulación de agar líquido caliente, utilizar guantes y gafas protectoras. Las muestras de tejido del proceso fijadas en solución de formaldehído en un extractor campana y usan gafas protectoras y guantes de laboratorio.
    4. Coloque la muestra con su superficie de sección hacia abajo en un escáner plano, junto con una regla de tamaño y escanear la superficie de la sección (Figura 4AB).
    5. Determine el área de la superficie de la sección de la muestra de tejido fijo (Af) en la exploración digital, utilizando una de las técnicas descritas en el paso 1.2.6 (Figura 4B).
    6. Embeber la muestra en medio de empotrar plástico, tales como epoxi (p. ej., Epon) o glycolmethacrylate/metacrilato de metilo (MMA/GMA)23, (protocolos siguientes)25 24,23, Figura 4). Asegurar que la superficie de la sección de la muestra fija en el paso anterior (1.3.4) se mantiene en la muestra de plástico incorporado.
      Nota: Para mantener la orientación de la superficie de la sección de la muestra durante el procesamiento de la muestra, siempre coloque la muestra con su superficie de sección previsto hacia abajo en el cassette de inclusión o lo molde de la fundición, o marcar la sección prevista superficie (o el lado opuesto de la muestra) con tinta.
    7. Corte una sección histológica del bloque plástico correspondiente a la superficie original de la sección de la muestra de tejido fijo (paso 1.3.2) usando un micrótomo (figura 4), la sección de montaje en un portaobjetos de vidrio (figura 4) y mancha de forma rutinaria) por ejemplo, hematoxilina y eosina tinción H & E)24,25.
      Atención: Para recibir una sección histológica aproximadamente en el mismo plano que la superficie original de la sección de la muestra de tejido fijo, ajuste cuidadosamente la posición de los bloques en el Monte del micrótomo antes de seccionamiento.
    8. Coloque el portaobjetos con la sección manchada hacia abajo en un escáner plano con una regla de tamaño y escanear la sección (figura 4E).
    9. Determinar el área de la sección de la muestra de tejido de plástico encajado (Ae) en la exploración digital, utilizando una de las técnicas descritas en el paso 1.2.6 (figura 4F).
    10. Calcular la contracción media relacionados con la inclusión del tejido (para el tejido respectivo y medio inclusión) de las áreas de medición de perfiles de sección correspondientes de las muestras de tejido antes y después de la incrustación de plástico medio de inclusión. El factor de contracción lineal fs se calcula como la raíz cuadrada del cociente de las áreas de los perfiles de sección de n muestras de tejido después de la incrustación de plástico incrustar medio (Ae) y las áreas de la perfiles de sección correspondientes de las mismas muestras de tejido antes de incrustar en plástico incrustar medio (Af) (figura 4)14.

2. volumen ponderado muestreo sistemático al azar los puntos de conteo y procesamiento de tejido submuestras para diferentes tipos de análisis aguas abajo7

  1. Preparar materiales: regla, pinza, cuchillo, tijeras, pinzas, lápiz resistente al agua, punto de Cruz cuadrículas impresas en transparencias de plástico y las tablas de número aleatorias.
    Nota: Se proporcionan plantillas de copia para cruzar las rejillas (5 a 60 mm) en el Material complementario de "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"7.
  2. Coloque los órganos y tejidos en una superficie lisa (corte de base) y mida la longitud (l) del órgano a lo largo de su eje longitudinal (figura 5A, figura 6A).
  3. Cortar el órgano/tejido completo equidistantes paralelos ortogonal a su eje longitudinal (figura 5B). Elija una distancia d entre dos secciones (es decir, el seccionamiento, sección intervalo grueso, generalmente aproximadamente 1 cm) lo suficientemente pequeñas para obtener un número suficiente de rebanadas de tejido/órgano. Posición al azar la primera sección dentro de una distancia entre 0 y el intervalo de seccionamiento desde el margen del órgano. Mientras corte, visualizar la posición y orientación de cada plano de sección para obtener Losas de aproximadamente paralelo de órganos y tejidos de espesor aproximadamente uniforme.
    Nota: El número de placas de tejido/órgano necesario depende del tamaño de los órganos y tejidos examinados y el número de localizaciones de tejido muestreado. Si órganos pequeños o muestras deben ser seccionados en losas delgadas de ≤5 mm, incrustar las muestras en agar antes de seccionamiento (ver paso 1.3.3.) y uso de dispositivos técnicos para el corte de la muestra embebido en agar. Intervalos de seccionamiento empíricamente recomendables para porcinos más órganos y tejidos, así como ejemplos de dispositivos de corte se indican en el Material complementario de "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"7.
  4. Colocar todos los bloques de órganos y tejidos en la misma superficie hacia abajo en la base de corte (Figura 6B).
  5. Superposición de las placas de tejido con una tamaño adecuado rejilla cruzada impresión en una transparencia plástica colocando el exterior izquierda superior transversal de la rejilla sobre un punto al azar en el tejido (figura 5-D, Figura 6B).
    Nota: Elegir una rejilla cruzada con una distancia suficientemente pequeña entre cruces adyacentes, por lo que en cada caso examinado del estudio, por lo menos dos veces tantos cruces llegará a la superficie de sección del compartimiento del tejido muestreado, como el número de muestras que debe tomar de eso compartimiento de tejido. Tamaños de rejilla cruzada empíricamente recomendable para porcino más órganos y tejidos se indican en el Material complementario de "Tejido muestreo guías para porcino biomédica modelos"7.
  6. Marca y cuenta cruza golpeando el tejido (respectivamente, el tejido sub-compartimiento de ser muestreado). Aplicar siempre un modo uniforme de conteo y la numeración de las cruces que golpea el compartimiento del tejido muestreado en todos los bloques de tejido, por ejemplo, de numeración consecutiva de las respectivas cruces en cada línea por línea, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, o, por ejemplo, numerando las cruzas en una losa de tejido tras otro en dirección a la derecha, a partir de la Cruz más cercana a la posición de 12:00, como exemplarily demostrados en la figura 5E.
  7. Divida el número de cruces que golpea el compartimiento de tejido/tejido para ser muestreadas (n) por el número de muestras que se generen para obtener el intervalo de muestreo sistemático (i).
  8. Determinar la primera posición de muestreo seleccionando un número aleatorio x en el intervalo entre 1 y yo. Para ello, utilice una tabla de números al azar. Marca la primera posición de la toma de muestras (x) y cada siguiente x +, x + 2, x + 3i, etc., Cruz golpea el compartimiento de tejido/tejido muestreado en la transparencia del plástico utilizando un lápiz resistente al agua (figura 5F).
    Nota: Tablas de números aleatorias pueden ser convenientemente y rápidamente generadas utilizando un generador de números al azar en línea.
  9. El tejido de lugares correspondientes a la marcada cruza ligeramente elevando la transparencia plástica y colocar un pequeño trozo de papel confeti limpio, en blanco en la superficie de la losa de tejido utilizando un par de pinzas (figura 5, figura 6E de la etiqueta ).
  10. Impuestos especiales muestras de tejido de los lugares muestreados (figura 5 H, figura 6F, Figura 7A) y los diferentes tipos de análisis posteriores (figura 6, Figura 7A-B), tal como se especifica en subdividir aún más Tabla 1.
  11. Después del muestreo, limpie las transparencias de plástico con agua tibia y jabón, seca y reutilizarlos.

3. generación de secciones al azar uniforme isotrópico (IUR) y Vertical uniforme aleatorio (VUR) secciones para cuantitativas análisis estereológicos

  1. Técnica "Isector"
    1. Preparar materiales: cuchillas de afeitar o micrótomo, agar, moldes de la fundición esférica (p. ej., moldes de fundición de bombones, que pueden obtenerse de los proveedores de pastelería), foldback abrazaderas y pinzas.
    2. Colocar una pieza tamaño adecuado (1 x 1 x 1 cm3) fijas, sistemáticamente al azar muestreada de tejido en un molde de fundición esférica, sujetan por las abrazaderas foldback y llenar el molde con agar líquido caliente (figura 8A-E).
    3. Desmoldar la esfera agar (figura 8F) fundición después de la solidificación del agar.
    4. Rodar la esfera de agar con la muestra de tejido embebido en la mesa, detener y sección en una posición aleatoria.
      Nota: El plano de la sección resultante es una sección IUR (figura 8F-G).
    5. Proceder a integrar la muestra de tejido en la resina plástica como GMA/MMA, manteniendo la orientación de la sección IUR plano (ver 1.3.5).
  2. Técnica de "Orientador"
    1. Preparar los materiales: cuchillas de afeitar o micrótomo, agar, pinzas, tablas de números aleatorias, estampados de círculos equiangular y coseno-weighted.
      Nota: Se proporcionan plantillas de copia de círculos en anteriores publicaciones8,26.
    2. Coloque la muestra de tejido fijo (o de tejido fijo embebido en agar) en una impresión de un círculo equiangular con un borde paralelo a la 0 – 180 ° dirección (Fig. 9A, figura 10E).
    3. Determinar un ángulo al azar mediante la tabla de números aleatorios. Encontrar las marcas correspondientes a la escala del círculo equiangular, que la muestra se basa en. Uso de estas marcas, corte una sección a través de la muestra (o por el agar que rodea la muestra de tejido embebido), con el plano de sección estar orientado paralelo a la dirección del ángulo al azar indicada en la escala del círculo equiangular y vertical a la superficie de la muestra (figura 9B-C, figura 10F) en reposo.
    4. Coloque el bloque de tejido de la superficie de la sección generada en el paso anterior frente a la desventaja en un círculo de coseno-weighted con el borde de la superficie de descanso colocado paralelo a la dirección de 1-1 (figura 9, figura 10 H).
    5. Repita el paso 3.2.3 y corte una sección nueva a través de la muestra en un ángulo aleatorio determinado mediante la tabla de números aleatorios (figura 9E-F, figura 10I-J).
      Nota: El plano de la sección resultante es una sección IUR.
    6. Caso, determinar el área del perfil de sección IUR el fijo de muestra de tejido para la determinación de la contracción relacionada con la inclusión del tejido (figura 9-J) como se describe en el paso 1.3 y proceder a integrar la muestra de tejido de plástico resina como GMA/MMA.
  3. Generación de secciones al azar uniforme Vertical (VUR)
    1. Preparar materiales: cuchillas de afeitar o micrótomo, agar, pinzas, tablas de números al azar y estampados de círculos equiangular.
      Nota: Se proporcionan plantillas de copia de círculos en anteriores publicaciones8,26.
    2. Definir un eje vertical dentro de la muestra de tejido fijo que siempre es reconocible en las secciones de muestra durante los pasos subsecuentes.
      Nota: Normalmente, el eje vertical a la superficie natural de la muestra de tejido es elegido como el eje vertical.
    3. Si procede, incluir la muestra en agar (figura 11B).
      Nota: Inclusión de Agar antes de VUR - o IUR-seccionamiento de la muestra fija es generalmente recomendable para muestras pequeñas, finas, frágil o blandas. También usar agar-inclusión de las muestras para facilitar la colocación de la muestra seccionada de RVU durante la posterior fijación de la muestra en medio de la resina plástica.
    4. Coloque la muestra en una impresión de un círculo equiangular con el eje vertical está orientado ortogonalmente al plano de la mesa de papel/tabla (figura 11).
    5. Cortar la muestra en un ángulo aleatorio (determinado mediante una tabla de números aleatorios) con el plano de sección ortogonal a la mesa y paralelos al eje vertical para recibir un plano de sección VUR (figura 11).
    6. Caso, determinar el área del perfil de sección IUR el fijo de muestra de tejido para la determinación de la contracción de tejidos relacionados con la inclusión como se describe en el paso 1.3 (Comparar con figura 9-J) y proceder a integrar la muestra de tejido en resina plástica como GMA/MMA.

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Resultados

Técnica de inmersión para la determinación de la densidad del tejido/órgano

Figura 12A -B muestra la representación determinación de la densidad y el volumen de un riñón porcino utilizando la técnica de inmersión que se describe en el paso 1.1 (figura 1, figura 2). Resultados más representativos de las mediciones de densidad d...

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Discusión

Generación de colecciones de muestras Biobanco de modelos animales porcinos requiere técnicas robustas y protocolos para la determinación de volúmenes de órganos y tejidos, la generación reproducible de representante, las muestras de tejido redundante apto para una amplia gama de métodos de análisis diferentes y por la aleatorización de la orientación de las secciones de la muestra para los análisis cuantitativos de estereológicos. Los métodos descritos en el presente artículo se adaptan a los tamaños de porcinos órganos...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Lisa Pichl excelente asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarCarl Roth GmbH, AlemaniaAgar (polvo), Cat.: 5210.3Disolver aproximadamente 1 g de agar en 10 ml de agua fría en un vaso de vidrio o plástico, calentar en horno microondas a 700 W, hervir la solución dos veces agitando rigurosamente. Echa en el molde mientras aún está caliente y deja que se solidifique. Precaución: Mientras manipula con agar líquido caliente, use gafas protectoras y guantes.
PinzaHornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, AlemaniaSchieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902Cualquier tipo de pinza (mecánica o electrónica) también servirá.
Moldes de fundición (metal)Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermü ECM, AlemaniaEinbettschä lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302bCualquier otro tipo de molde de fundición de metal utilizado para la inclusión en parafina también servirá.
Plantillas de copia de cuadrículas cruzadas (5 mm - 6 cm)n.a.n.a.Lasplantillas de copia de cuadrículas cruzadas (5 mm - 6 cm) se proporcionan en el archivo de datos complementario de Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Plantillas de copia de círculos equiangulares y ponderados por cosenon.a.n.a.Lasplantillas de copia de círculos equiangulares y ponderados por coseno se proporcionan en Nyengaard & Gundersen. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) y en Gundersen et al. Principios estereológicos y procedimientos de muestreo para patólogos toxicológicos. En: Haschek y Rousseaux&agudo; s Manual de Patología Toxicológica. 3ª ed., 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Abrazaderas plegables (clips de carpeta YIHAI, 15 mm y 19 mm)Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., ChinaY10006 e Y10005Cualquier otro tipo de abrazaderas plegables estándar para oficinas también servirá.
Pinzas (anatómicas)NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, AlemanianeoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811Cualquier tipo de pinza anatómica servirá.
Solución de formaldehído al 4%SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, AlemaniaFormaldehído 37/40 %, Cat.: 1000411525005Diluido al 4% a partir de una solución concentrada. Tampón a pH neutro. Use protección adecuada para los ojos, las manos y las vías respiratorias. Procese muestras de tejido fijadas en solución de formaldehído debajo de una campana extractora y use gafas protectoras y guantes de laboratorio.
Papel cuadriculado (para calibración)Bü romarkt Bö ttcher AG, Jena, Alemania. www.bueromarkt-ag.dePenig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514Cualquier tipo de papel cuadriculado (a escala milimétrica) servirá.
Vasos de precipitados de laboratorio (5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, AlemaniaBecherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036Cualquier tipo de vasos de vidrio o plástico de 5 y 100 ml de volumen servirá.
BásculalaboratorioMettler Toledo GmbH, Gieß es, AlemaniaPM6000Cualquier báscula de laboratorio estándar con rangos de medición entre 0,1 mg y aproximadamente 20 g, respectivamente entre 100 mg y aproximadamente 500 g hará
AG, Gö ttingen, AlemaniaBP61S Cuchillas
de micrótomoEngelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermü nde, AlemaniaFEATHER Microtomo blasdes S35, Cat.:14700Cualquier tipo de hojas de micrótomo de un solo uso servirá.
Morfometría/planimetría software/sistemaNational Institute of Health (NIH)ImageJDescargar de https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Alemaniade análisis deimágenes VideoplanTM
CámaraNikonD40Cualquier tipo de cámara fotográfica digital que se pueda montar en un trípode servirá.
Transparencias de plásticoAvery Zweckform GmbH, Oberlaindern, AlemaniaLaser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562Cualquier transparencia de plástico imprimible (láser) servirá.
Tablas de números aleatoriosn.a.n.a.Lastablas de números aleatorios se pueden generar cómodamente (con números definidos de números aleatorios y dentro de intervalos definidos), utilizando generadores de números aleatorios, como: https://www.random.org/
Hojas de afeitarPlano GmbH, Wetzlar, AlemaniaT5016Cualquier tipo de hojas de afeitar servirá.
ReglaBü romarkt Bö ttcher AG, Jena, Alemania. www.bueromarkt-ag.deOffice-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparente, Cat.: ln30Cualquier tipo de regla a escala de cm-mm servirá también.
Solución salina (0,9%)Carl Roth GmbH, AlemaniaCloruro de Natrium, >99% Cat.: 0601.1Para preparar solución salina al 0,9%, disuelva 9 g de NaCl en 1000 ml de agua destilada a 20 °C.
Hojas de bisturíAesculap AG & Co KG, Tuttlingen, AlemaniaBRAUN Cuchillas quirúrgicas N° 22Cualquier tipo de hojas de bisturí servirá.
EscánerHewlett-Packardhp scanjet 7400cCualquier tipo de escáner de oficina estándar capaz de escanear con resoluciones de 150-600 ppp servirá.
Dispositivos de corten.a.n.a.Losejemplos de dispositivos de corte autoconstruidos se pueden encontrar en Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) y en el archivo de datos complementario de Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Moldes de fundición esférica (por ejemplo, de 25,5 mm de diámetro)Pralinen-Zutaten.de, Windach, AlemaniaPralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25,5 mmLos moldes de fundición esférica también pueden ser de construcción propia u obtenerse de otros proveedores de confitería (para bombones). Los moldes de fundición indicados aquí son en realidad el paquete/envoltura de cuerpos de pralinés huecos (primero coma los bombones y luego use el paquete para la generación de secciones del sector i)
Alambre finoBasteln & Hobby Schobes, Straß lejana, Alemania. www,bastel-welt.deMessingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742Cualquier otro tipo de alambre delgado también servirá.
Papel de sedaNeoLab Migge GmbH, Heidelberg, AlemaniaToallitas de trabajo Declcate-Blanco, Cat.: 1-5305Cualquier otro tipo de papel de papel de papel de laboratorio también servirá.
Bolígrafo resistente al aguaStaedler Mars GmbH & Co KG, Nü rnberg, GrmanyLumocolor permanente 313, 0,4 mm, S, negro, Cat.: 313-2Cualquier otro tipo de bolígrafo resistente al agua también servirá.
de Sartorius Sistema Agotado fotográfica

Referencias

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