Esta comunicación describe modelos murinos para los propósitos experimentales y metodologías para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de los seres humanos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los macrófagos alveolares son macrófagos terminalmente diferenciados, residente de pulmón de origen prenatal. Los macrófagos alveolares son únicos en su larga vida y su importante papel en el desarrollo pulmonar y función, así como sus respuestas localizadas del pulmón a la infección y la inflamación. Hasta la fecha, ningún método unificado para la identificación, aislamiento y manejo de los macrófagos alveolares de los seres humanos y ratones existe. Este método es necesario para estudios sobre estas importantes células inmunitarias innatas en varias configuraciones experimentales. El método descrito aquí, que puede ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio, es un enfoque simplificado para cosechar los macrófagos alveolares de lavado broncoalveolar o de tejido pulmonar y mantenimiento in vitro. Porque los macrófagos alveolares se presentan principalmente como células adherentes en los alvéolos, el enfoque de este método es el desalojo antes de la cosecha y la identificación. El pulmón es un órgano altamente vascularizado, y varios tipos de células de origen mieloide y linfoide habitan, interactúan y son influenciados por el microambiente del pulmón. Utilizando el conjunto de marcadores de superficie que se describe aquí, los investigadores pueden fácilmente y sin ambigüedades distinguir los macrófagos alveolares de otros leucocitos y purificarlos para aplicaciones posteriores. El método de cultivo desarrollado en este documento apoya a ambos humanos y ratón macrófagos alveolares para el crecimiento in vitro y es compatible con los estudios celulares y moleculares.
Introducción
El microambiente del pulmón es un ecosistema único complejo con un conducto de aire elaborado y vasculatura. El aire inhalado viaja a través de la tráquea y numerosas ramificaciones de bronquios y bronquiolos antes de llegar a los alvéolos, donde ocurre el intercambio de gases sangre aire. Debido a la interacción directa con la atmósfera, la superficie respiratoria requiere protección contra los efectos potencialmente perjudiciales de partículas en suspensión y contaminantes. Un número de barreras físicas, químicas e inmunológicas protege a los pulmones. En particular, el despliegue de los fagocitos en la superficie respiratoria sirve un sistema importante de primera ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de Animal y el Comité uso (IACUC) y la Junta de revisión institucional (IRB) en el Hospital y centro médico de San José.
1. aislamiento de AMs del líquido murino el lavado broncoalveolar (BAL)
- Anestesiar un ratón C57BL/6 de ocho semanas de edad con ketamina (87,5 mg/kg de peso corporal) y xilacina (12,5 mg/kg de peso corporal) cóctel por medio de una inyección intraperitoneal. Vaya al ratón logra anestesia quirúrgica con pérdida de los reflejos y la relajación de los músculos.
- Coloque el ratón sobre una superficie de disección con la cara ve....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El enfoque de citometría de flujo para identificar ratón AMs se muestra en la figura 1. Esto incluye el análisis de un conjunto mínimo de marcadores de superficie necesarios distinguir AMs de otros fagocitos reside en el pulmón o infiltración pulmonar. Análisis diferencial es necesaria para identificar positivamente a AMs de intersticiales macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, monocitos y macrófagos derivados de monocitos pulmonares que se producen en.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
AMs son macrófagos de pulmón-residente de larga vida que pueblan los pulmones comienza al nacer y perdurable sobre la vida entera26. Sus funciones en la fisiología pulmonar Patología de7 y12 y su potencial para predecir de autoinmunidad pulmonar24 han sido reconocidos. Porque AMs tiene una presencia a largo plazo en los pulmones11,27 y participan en la activación y la .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Clare Prendergast ayuda con editar el manuscrito. DKN es apoyada por una investigación conceder (#2095) de la Fundación Flinn y TM es apoyado por becas de institutos nacionales de salud (R01HL056643 y R01HL092514). DKN desarrolló los métodos, diseñó el estudio y escribió el manuscrito; OM con los estudios en animales y obtención de la muestra clínica; SB asistida con análisis cytometric del flujo y separación celular; TM bajo la supervisión de los estudios y revisaron el manuscrito.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución disociadora de células no enzimáticas | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Opot | Dechra | 620300 | |
| 22G Catéter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Sutura trenzada de seda no absorbible | Kent Científico | SUT-15-2 | |
| Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato S | Corning | 21-031-CM | |
| Ratón Fc bloque | BD Biosciences | 553142 | |
| Tampón de lisis (kit de ARN PureLink) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoetanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| Clasificador de células FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamina (Cetatesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xilacina (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μ Filtro de células M | Corning | 352360 | |
| Bloque Fc Humano | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Contador de células automatizado | Thermo Fisher Scientific | ||
| Solución de azul de tripano | Thermo Fisher Scientific | ||
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Suero fetal bovino Atlanta | Biologicals | S11150H | |
| celular L-929 | Colección de cultivos | tipo americano ATCC, CCL-1 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Corning | 30-002-CI | |
| Piruvato de sodio | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Matraz de cultivo de tejidos | Thermo Fisher Scientific | ||
| plato de cultivo de 60 mm | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Tubo cónico | Corning | 352097 | |
| 50 mL | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa analizador | celular BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Software |
| de análisis Anti-CD45 (Ratón) | Biolegend | 147709 | Clon I3/2.3, FITC conjugado |
| Anti-CD11b (Ratón) | Biolegend | 101228 | Clon M1/70, PerCP/Cy5.5 |
| conjugado Anti-CD11c (Ratón) | BD Biosciences | 565452 Clon N418, BV 421 conjugado | |
| Anti-I-Ab (Ratón) | Biolegend | 116420 | Clon AF6-120.1, PE/Cy7 conjugado |
| Anti-Siglec-F (Ratón) | BD Biosciences | 562757 | Clon E50-2440, PE-CF594 conjugado |
| Anti-Siglec-H (Ratón) | Biolegend | 129605 | Clon 551, PE conjugado |
| Anti-F4/80 (Ratón) | Biolegend | 123118 | Clon BM8, APC/Cy7 conjugado |
| Anti-Ly-6C (Ratón) | Biolegend | 128035 | Clon HK1.4, BV605 conjugado |
| Anti-CD64 (Ratón) | Biolegend | 139311 | Clon X54-5/7.1, BV711 conjugado |
| Anti-CD24 (Ratón) | BD Biosciences | 563115 | Clon M1/69, BV510 conjugado |
| Anti-CD103 (Ratón) | BD Biosciences | 745305 | Clon OX-62, BV650 conjugado |
| Anti-CD317 (Ratón) | Biolegend | 127015 | Clon 927, APC conjugado |
| Anti-CXCR1 (Ratón) | Biolegend | 149029 | Clon SA011F11, BV785 conjugado |
| Anti-CD45 (Humano) | Biolegend | 304017 | Clon HI30, AF488 conjugado |
| Anti-CD11b (Humano) | Biolegend | 101216 | Clon M1/70, PE/Cy7 conjugado |
| Anti-HLA-DR (Humano) | Biolegend | 307618 | Clon L243, APC/Cy7 conjugado |
| Anti-CD169 (Humano) | Biolegend | 346008 | Clon 7-239, APC conjugado |
| Anti-CD206 (Humano) | Biolegend | 321106 | Clon 15-2, PE conjugado |
| Anti-CD163 (Humano) | Biolegend | 333612 | Clon GHI/61, BV421 conjugado |
Referencias
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages devel....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
