Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تكييف 3 ' التضخيم السريع من كدنا ينتهي إلى خريطة المحاضر في السرطان

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57318
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and Health Sciences, Butler University

Summary

البروتوكولات اثنين مختلفة 3 'التضخيم السريع كدنا الغايات (3' سباق) جعل هنا وصف استخدام اثنين بولمرس الحمض النووي مختلفة لتعيين تسلسل التي تشمل جزءا من الإطار القراءة المفتوحة (ORF) كودون التوقف وأكملها 3 ' UTR من نسخة باستخدام الحمض النووي الريبي الحصول على خطوط خلايا السرطان المختلفة.

Abstract

نضوج مرناس التوكسينات ينطوي على إنهاء تشكيل 3 '، الذي ينطوي على إضافة ذيل poly(A). من أجل تعيين 3 'نهاية الجين، هو الطريقة التقليدية لاختيار 3' التضخيم السريع كدنا الغايات (3 ' سباق). تتطلب بروتوكولات لسباق 3 'التصميم الدقيق والتحديد كبسولة تفجير متداخلة ضمن 3' المنطقة غير مترجمة (3 ' UTR) من الجينات المستهدفة للفائدة. ومع ذلك، مع بعض التعديلات يمكن استخدام البروتوكول لتشمل كامل 3 'UTR وتسلسل داخل الإطار القراءة المفتوحة (ORF)، تقديم صورة أكثر شمولاً عن العلاقة بين ORF و 3' UTR. هذا بالإضافة إلى تحديد إشارة بوليادينيليشن (PAS)، فضلا عن موقع الانقسام وبوليادينيليشن تقدمها التقليدية 3 ' العرق. توسيع 3 'العرق يمكن الكشف عن غير عادية 3' تحيلها، بما في ذلك اندماج الجينات داخل 3 ' UTR، وتسلسل المعلومات التي يمكن استخدامها للتنبؤ المحتملة ميرنا ربط المواقع، فضلا عن الاتحاد الأفريقي الغنية زعزعة العناصر التي قد تؤثر على استقرار محضر.

Introduction

تشكيل نهاية 3 ' هو خطوة حاسمة في نضوج مرناً التي تتألف الانقسام ومن المصب مرناً قبل نظام تقييم الأداء متبوعاً بالإضافة ~ 250 أونتيمبلاتيد أدينينيس، التي تشكل poly(A) الذيل1،2. البروتين ملزمة poly(A) (بابب) بربط ذيل poly(A)، وهذا يحمي نسخة مرناً من التدهور، ويسهل الترجمة1.

وتشير التقديرات الحالية إلى أن 70% جينات البشرية المرور متعددة، وهكذا يخضع بوليادينيليشن البديلة، أسفر عن عدة 3 ' ينتهي3. وبالتالي، من المهم أن تحدد فيها الذيل poly(A) تعلق على بقية 3 ' UTR، فضلا عن تحديد نظام تقييم الأداء المستخدمة من قبل أي نص معين. وادي ظهور الجيل التالي التسلسل في تحديد وقت واحد 3 ' تحيلها وتمرير الآلاف من الجينات. هذه الزيادة في القدرة على تسلسل يتطلب تطوير خوارزميات بيوينفورماتيك لتحليل البيانات التي تنطوي على بوليادينيليشن البديلة للنهاية 3 '. لكشف حيثياته أو التحقق من صحة نظام تقييم الأداء ومن ثم تعيين النهاية 3 'للجينات الفردية من البيانات تسلسل واسعة النطاق، 3' العرق يظل أسلوب اختيار4،5. وتشمل تسلسل المدرجة في منتجات كدنا 3 'سباق عادة جزء فقط من 3' UTR يحتوي على الذيل poly(A) وموقع الانقسام، ونظام تقييم الأداء، وفي تسلسل المنبع لنظام تقييم الأداء. خلافا لبكر، الأمر الذي يتطلب تصميم واستخدام الجينات محددة إلى الأمام وعكس كبسولة تفجير، 3 ' سباق فقط يتطلب اثنين الجينات محددة المتداخلة إلى الأمام الإشعال. ومن ثم، بكر يتطلب معرفة أكثر تفصيلاً من تسلسل النوكليوتيدات من منطقة كبيرة من الجينات يجري تضخيم4،6. منذ 3 ' سباق يستخدم نفس عكس التمهيدي أن أهداف الذيل poly(A) لجميع بوليادينيلاتيد الحمض النووي الريبي النصوص، إلا الإشعال إلى الأمام يجب أن تكون الجينات محددة، وبالتالي، فقط التي تتطلب معرفة بمنطقة أصغر بكثير من مرناً. وهذا يتيح تضخيم المناطق التي تسلسل لا تتسم تماما4،7. وقد سمح 3 'سباق لاستخدامها ليس فقط لتحديد نهاية 3' الجينات، ولكن أيضا تحديد وتوصيف مناطق شاسعة في المنبع لنظام تقييم الأداء التي تشكل جزءا كبيرا من 3 ' UTR. عن طريق الجمع بين 5 'سباق مع معدلة 3' سباق يتضمن أجزاء أكبر من 3 'UTR ومناطق الحماية، من الممكن تماما تسلسل أو استنساخ أكمله نسخة مرناً من النهاية 5' إلى النهاية 3 '8.

مثال على هذا التطبيق من تعديل 3 'العرق هو تحديد الأخيرة من رواية CCND1-مرك الانصهار الجينات نسخة من خطوط الخلايا"اللمفاوية خلية عباءة" ومرضى السرطان. 3 ' UTR تتألف من تسلسل من جينات كلا من CCND1 و مرك والمعاندة لميرنا البند9. اثنين متداخلة CCND1 محددة إلى الأمام الإشعال تعتبر مكملة للمنطقة المتاخمة والمتلقين للمعلومات من كودون وقف CCND1 فورا. على الرغم من أن يمكن استخدام تسلسل الترنسكربيتوم كله جنبا إلى جنب مع أدوات بيوينفورماتيك محددة للكشف عن اندماج الجينات داخل UTR 3 '10، العديد من مختبرات قد تفتقر إلى الموارد المالية أو الخبرة بيوينفورماتيك لجعل استخدام هذه التكنولوجيا. ومن ثم، 3 'العرق بديل لتحديد حيثياته والتحقق من صحة الجينات الانصهار الرواية التي تشمل 3' UTR. وبالنظر إلى زيادة في عدد الجينات الانصهار المبلغ عنها جذرية كذلك قراءة من خلال النصوص، 3 ' سباق قد أصبح أداة قوية في وصف تسلسل الجين11،12. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن تسلسلات مختلفة داخل 3 'UTR فضلا عن طول 3' UTR يمكن أن تؤثر على استقرار نسخة مرناً، التعريب، طواعية، ووظيفة13. يرجع جزئيا إلى زيادة اهتمام في رسم الخرائط الترنسكربيتوم، وكان هناك زيادة في العدد من مختلف بولمرس الحمض النووي يجري تطويرها لاستخدامها في المختبر. من المهم تحديد ما أنواع التعديلات يمكن جعل 3 ' بروتوكول سباق في النظام باستخدام مرجع متاح للحمض النووي [بولمرس].

عمل هذه التقارير تكييف 3 'سباق الخريطة أكملها 3' UTR، نظام تقييم الأداء، و 3 ' نهاية الانقسام والموقع من محضر ANKHD1 باستخدام كبسولة تفجير داخل القسم ANKHD1 من النسخة وهما الحمض النووي [بولمرس] مختلفة متداخلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ارتداء معطف مختبر، والقفازات، ونظارات السلامة في جميع الأوقات أثناء تنفيذ جميع الإجراءات في هذا البروتوكول. التأكد من فتح الحاويات/الأنابيب التي تحتوي على الفينول وغوانيدين isothiocyanate الكاشف هي فقط في هود مصدقة، والتخلص من نفايات الفينول في حاوية معينة. استخدام أنابيب معقمة خالية من الدناز/رناسي ونصائح والمواد الكاشفة.

1-خلية ثقافة

  1. تنمو خط الخلية هيلا وتعليق عباءة خلية سرطان الغدد الليمفاوية الخلية سطرين، Granta-519 وجيكو-1، في دميم التي تحتوي على 10% FBS ويو/مليلتر 100 البنسلين/ستربتوميسين في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية. تضعف الخلايا 01:10 والعد باستخدام عداد جسيمات14.
  2. لاستخراج الحمض النووي الريبي، لوحة 500,000 الخلايا/بئر في صفيحة جيدا 6 (2 مل وسائل الإعلام كل بئر). بعد حضانة ح 24، جمع الحمض النووي الريبي من الخلايا.

2. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. حصاد الخلايا
    ملاحظة: باستثناء خطوة الطرد المركزي، تنفيذ كافة الخطوات المذكورة في غطاء زراعة الأنسجة للحفاظ على العقم.
    1. تعليق الخلايا (جيكو-1 و Granta-519):
      1. نقل الخلايا (جنبا إلى جنب مع 2 مل من وسائل الإعلام) إلى أنبوب 15 مل، والطرد المركزي في 1,725 س ز لأدنى 5 أسبيراتي وسائل الإعلام وترك بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب.
      2. ريسوسبيند بيليه الخلية في 50 ميليلتر من 1 × الفوسفات خفف المحلول الملحي (PBS). إضافة 500 ميليلتر من أحادي الطور الفينول وغوانيدين isothiocyanate كاشف لكل عينة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. تخلط جيدا وتترك في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق في حين عكس أنبوب ميكروسينتريفوجي كل 1 دقيقة.
    2. للخلايا ملتصقة (هيلا):
      1. نضح خلية ثقافة وسائل الإعلام من كل بئر. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر يغسل الحطام.
      2. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميليلتر من أحادي الطور الفينول وغوانيدين isothiocyanate كاشف لكل بئر.
      3. تبني على RT لمدة 5 دقائق مع هزاز لطيف. نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  2. تحلل الخلية
    1. تجميد الخليط خلية isothiocyanate الفينول وغوانيدين في-20 درجة مئوية ح 1.
      ملاحظة: يمكن أن يترك المزيج في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو حتى حاجة.
    2. ذوبان الجليد الخليط خلية isothiocyanate الفينول وغوانيدين على الجليد. إضافة 100 ميليلتر من كلوروفورم إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي في غطاء PCR. دوامة العينة 10-15 ق حتى يصبح الخليط الوردي ومعتمة. احتضان العينة على الجليد (عند 4 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة.
    3. الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة في 20,800 س ز و 4 درجة مئوية. بعناية إزالة المرحلة مائي عديم اللون العلوي (~ 200 ميليلتر) ونقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.
  3. الجيش الملكي النيبالي هطول الأمطار
    1. إضافة وحدة تخزين متساوية من الايزوبروبانول لكل عينة. أضف 1 ميليلتر من كوبريسيبيتانت (انظر الجدول للمواد) لكل عينة بمثابة ناقل للجيش الملكي النيبالي، والمساعدة في تصور الجيش الملكي النيبالي في الخطوات اللاحقة. احتضان العينة في-80 درجة مئوية على الأقل 4 ح. للحصول على أفضل النتائج، احتضان بين عشية وضحاها في-80 درجة مئوية.
    2. نقل العينة إلى تبريد أجهزة الطرد مركزي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 35 دقيقة في 20,800 س ز/4 درجة مئوية؛ الجيش الملكي النيبالي ستظهر كبقعة زرقاء على الجزء السفلي من الأنبوب. بعناية إزالة الايزوبروبانول من العينة. إضافة 500 ميليلتر من الإيثانول 80% وريسوسبيند بيليه بإيجاز فورتيكسينج 3 ق.
    3. إزالة أجهزة الطرد المركزي العينة في 20,800 س ز في الرايت للحد الأدنى 5 الإيثانول في كل من العينة. أيردري السماح العينة لحوالي 10 دقيقة ريسوسبيند العينة في 35 ميليلتر من المياه خالية من رناسي. ضع على كتلة حرارة (65 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق للتأكد من أن الجيش الملكي النيبالي تماما في الحل، وفورا وضع الأنبوب على الجليد.
    4. تحديد تركيز مجموع الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي كما سبق ذكره، فيما عدا استخدام 1.5 ميليلتر من عينات الحمض النووي الريبي بدلاً من 1 ميليلتر15. بشكل اختياري، تشغيل 1 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي على 1% [اغروس] هلام لتحديد سلامة الحمض النووي الريبي.

3-الدناز المعاملة

  1. بعد التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي، إجراء معاملة الدناز في الجيش الملكي النيبالي إجمالي للحط من أي الحمض النووي. لكل عينة، إضافة الكواشف التالية من مجموعة خالية رناسي الدناز جعل فعل مجموع 20 ميليلتر مزيج في أنبوب ميكروسينتريفوجي منفصلة:
    1. ميكس 2 ميليلتر من الدناز 10 س رد فعل المخزن المؤقت مع 4.4 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي. يصل إلى ما مجموعة 14 ميليلتر بالماء.
    2. إضافة 2 ميليلتر من الدناز رناسي مجاناً. احتضان عند 37 درجة مئوية مدة 30 دقيقة حضور 2 ميليلتر من رناسي المانع (من مجموعة النسخ عكس).
    3. إضافة 2 ميليلتر من الحرارة و "يتوقف الحل" على كتلة حرارة لمدة 10 دقائق على 70 درجة مئوية لإلغاء تنشيط إنزيم الدناز.
      ملاحظة: العلاج الدناز اختيارية.

4-كدنا التوليف

حجم رد نهائي من 50 ميليلتر:

  1. حجم رد نهائي من 50 ميليلتر: 22 نقل ميليلتر من الدناز تعامل الجيش الملكي النيبالي لأنبوب جديد، أو نقل 4 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي بالمياه إضافة إلى إجمالي حجم 22 ميليلتر لأنبوب جديد. إضافة 2 ميليلتر من التمهيدي25 ديناراً اليغو T7 من 10 ميكرون التمهيدي الحل. التسلسل للتمهيدي25 ديناراً اليغو T7-جككجتاتاكجاكتكاكتاتاجتتتتتتتتتتتتتتتتتتتتتتتت 5 '-3'.
  2. من مجموعة "عكس النسخ" إضافة 2 ميليلتر من مثبط رناسي (20 ش/ميليلتر) ميليلتر 8 5 x رد فعل المخزن المؤقت، 4 ميليلتر من دنتبس 10 ملم و 2 ميليلتر من المنتسخة العكسية (200 يو/ميليلتر).
    ملاحظة: إعداد رد فعل دون المنتسخة العكسية للعمل كعنصر سلبي.
  3. احتضان في 42 درجة مئوية حاء 1 نقل مباشرة الجليد. حرارة الأنبوب عند 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ووضع الأنبوب على الجليد.

5-التمهيدي البحث عن نسخة الجينات الانصهار

  1. التصميم التمهيدي
    1. تحميل التسلسل كدنا من مستعرض الجينوم فرقة (ENST00000360839.6/NM_017747)، وتحديد منطقة داخل ORF من الهدف نسخة (ANKHD1) المنبع كودون التوقف. نسخ ولصق في المنطقة بأسرها (تصل إلى 700 النيوكليوتيدات) التي تحتوي على تسلسلات المنبع من كودون التوقف في منطقة إدخال تسلسل من التمهيدي تصميم البرمجيات (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. حدد خيار إظهار تصميم مخصص وحدد 10 للعدد من أجهزة الإشعال أن النظام ينبغي أن تولد (نتائج العودة) وترك كافة المعلمات الأخرى بتعيين إلى الافتراضي.
    3. اختر خمسة أجهزة الإشعال إلى الأمام والإشعال عكس اثنين غير متراكبة. ترتيب الإشعال وتشكيل مع المياه خالية من رناسي/الدناز إلى تركيز نهائي من 10 ميكرون. مزيد من التفاصيل حول التصميم العام التمهيدي لبكر مشمولة في مكان آخر16.
  2. PCR لتحديد كبسولة تفجير محتملة لاستخدامها في وقت لاحق 3 ' سباق
    ملاحظة: لتحديد الإشعال إلى الأمام النهائي استخدامها في رد الفعل، اختبار كبسولة تفجير تصميم بإعداد مجموعات مختلفة من الإشعال إلى الأمام وعكس لبكر العادية في غطاء PCR.
    1. نقل كدنا (2 ميليلتر) إلى أنبوب PCR العذبة 0.5 مل. إضافة 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام و 1 ميليلتر من التمهيدي عكسي (من حل التمهيدي 10 ملم). جعل ميليلتر تصل إلى 12.5 بإضافة ميليلتر 8.5 من المياه خالية من نوكلاس. إضافة ميليلتر 12.5 2 x ميكس ماجستير بكر لجل.
    2. استخدام الشروط PCR الدراجات الحرارية التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها دورات 29 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ق، و 72 درجة مئوية للحد الأدنى 1 وضعت دورة النهائية في 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    3. بعد بكر، تشغيل المنتجات على 1% [اغروس] هلام ملطخة اثيديوم بروميد. وترد تفاصيل التفريد كما سبق مع بضعة تعديلات17.
      1. حل ز 1 من [اغروس] في 100 مل من المخزن المؤقت تريس-خلات (تاي) في قارورة 250 مل. تغلي في فرن ميكروويف.
      2. إجازة يبرد لمدة 1 دقيقة وإضافة 7.5 ميليلتر اثيديوم بروميد الحل (الأوراق المالية 10 ملغ/مل) في غطاء دخان. مزيج جيد من قبل يحوم في قارورة وتصب في جهاز جل أفقي. ترك في RT في غطاء الدخان عن 30 دقيقة على الأقل للسماح للجل ترسيخ.
      3. تغطي الجل مع المخزن المؤقت x TAE 1 وتحميل 10 ميليلتر للمنتج [بكر] على [اغروس] هلام جنبا إلى جنب مع 3-5 ميليلتر لسلم الوزن الجزيئي الحمض النووي. تشغيل في 175 الخامس لتصور الحد الأدنى 10 المنتجات التي تستخدم تصوير، وإذا كان المزيد من الفصل بين المنتجات، تشغيل الهلام 5-10 لكل دقيقة إضافية.
  3. تحديد الإشعال المتداخلة لسباق 3 '
    1. تحليل نتائج PCR [اغروس] هلام لتحديد الإشعال التي لها عصابة PCR متميزة وقوية وواحدة. استخدام الدليل التمهيدي 5 '--معظم (ANKHD15'-ككتكككاجكجاجتتكتاك-3 ') جنبا إلى جنب مع التمهيدي25 أوليجودت T7 في بكر أول تشغيل.
    2. حدد التمهيدي المتداخلة أن يوجد المصب التمهيدي الأول (ANKHD1 5 '-كجتجاكاكاجتجاتكت-3')، واستخدامها مع التمهيدي T7 (5 '-جككتاتاكجاكتكاكتاتاج-3') في المجموعة الثانية من ردود فعل PCR.

6-تحسين 3 'سباق خريطة 3' UTR استخدام اثنين من الإنزيمات المختلفة

ملاحظة: كان هناك زيادة في تنوع بولمرس الحمض النووي يستخدم لبكر؛ ولذلك أردنا أن تحدد الشروط القياسية التي يمكن تطبيقها حتى عند استخدام إنزيمات مختلفة لردود الفعل PCR سباق 3 '. كبسولة تفجير العكسية لأي نسخة هي تظل ثابتة؛ فهذه التغييرات فقط في كبسولة تفجير الأمام المتداخلة التي محددة لنص الهدف.

  1. البروتوكول 1:3 ' سباق باستخدام بوليميراز الدنا معدلة من بيروكوككوس فوريوسوس (بفو)
    1. بكر أول
      1. نقل 1 ميليلتر من كدنا أن أنبوب بكر وإضافة 5 ميليلتر بفو x 10 رد فعل المخزن المؤقت. إضافة 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام متداخلة الأولى و 1 ميليلتر من التمهيدي25 أوليجودت T7 1 ميليلتر من دنتبس (من حل 10 ملم).
      2. جعل حجم إجمالي ميليلتر يصل إلى 49 بإضافة 40 ميليلتر من الماء. أضف 1 ميليلتر من بفو دنا بوليميريز ومزيج جيد. قم بتشغيل الاسترداد باستخدام التشكيل الجانبي PCR في الجدول 1.
    2. بكر الثاني
      1. نقل 2 ميليلتر من المنتجات من PCR الأول إلى أنبوب بكر جديدة وتخلط مع 5 ميليلتر بفوx 10 "الترا الثاني" رد فعل المخزن المؤقت. إضافة 1 ميليلتر من التمهيدي PCR متداخلة الثاني و 1 ميليلتر من التمهيدي T7 1 ميليلتر من دنتبس (حل 10 ملم).
      2. جعل حجم رد فعل مجموع ميليلتر يصل إلى 49 بإضافة 39 ميليلتر من الماء. أضف 1 ميليلتر من بفو دنا بوليميريز. قم بتشغيل الاسترداد استخدام نفس ملف التعريف PCR كإعداد بكر الأول (الجدول 1).
  2. بروتوكول 2:3 ' سباق باستخدام بوليميريز الحمض النووي تشيميريك تتكون من مجال ربط الحمض النووي تنصهر فيها بيروكوككوس-مثل تصحيح التجارب المطبعية بوليميريز PCR ميكس الرئيسية
    1. بكر أول
      1. نقل 1 ميليلتر من كدنا أن أنبوب PCR. إضافة 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام متداخلة الأولى و 1 ميليلتر من التمهيدي25 أوليجودت T7. جعل يصل إلى 25 ميليلتر بإضافة 22 ميليلتر من الماء.
      2. إضافة 25 ميليلتر من 2 × ميكس سيد بكر ومزيج جيد. استخدام PCR الدراجات الشروط الموضحة في الجدول 2.
    2. بكر الثاني
      1. نقل 2 ميليلتر من المنتجات من PCR الأول إلى أنبوب بكر جديدة. أضف 1 ميليلتر من التمهيدي PCR متداخلة الثانية جنبا إلى جنب مع 1 ميليلتر من التمهيدي عكس T7.
      2. جعل يصل إلى 25 ميليلتر بإضافة 22 ميليلتر من الماء. إضافة 25 ميليلتر من 2 × ميكس ماجستير PCR. قم بتشغيل الاسترداد استخدام نفس ملف التعريف PCR كإعداد بكر الأول (الجدول 2).

7-التحقق من المنتج بكر الثانية لسباق 3 '.

  1. تأخذ 5-10 ميليلتر الثاني بكر المنتج (فضلا عن المنتج من الجولة الأولى من تقارير إتمام المشروعات إذا تماما هو التعبير عن النسخة) وتشغيل على [اغروس] هلام. الهلام وتشغيل التفريد كما تم وصفه سابقا (الخطوات 5.2.3.1 إلى 5.2.3.3). تصور النتائج المتعلقة تصوير.

8-منتجات تنقية والتسلسل

  1. تنقية منتجات PCR جل من بكر الثاني باستخدام هلام وبكر بلغة الحمض النووي تنظيف النظام وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  2. أداء سانغر التسلسل (بدلاً من ذلك، إرسال الجل المنقي عينات المنتج بكر والإشعال التسلسل الملائم لمختبر تسلسل). تحليل البيانات التسلسل بعد سانغر التسلسل.
  3. تحميل برنامج تحليل تسلسل (انظر الجدول للمواد)، واستيراد ملفات التتبع إلى البرنامج. دعوة استخدام "قفس قاعدة" نقية الفردية (قيم جودة) للحصول على القاعدة معلومات18. تحميل تشروماتوجرام مع آثار عالية الجودة للعرض.
    اختياري: المنتج المنقي جل يمكن استنساخ باستخدام مجموعة مواد استنساخ مناسبة والمستنسخين معزولة أرسلت سانغر التسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البحث التمهيدي إلى الأمام متداخلة:

[اغروس] هلام من ويبين الشكل 1 اثنين مميزة بكر جل المنتجات (الممرات 1 و 2) التي تستخدم نفس الأمام التمهيدي لكن الإشعال عكس مختلفة. 3 لين منتج PCR متميزة ومتميزة إلى الأمام وعكس تمهيدي. كبسولة تفجير مثالية لاستخدامها لرد فعل بكر على أساس هي تلك التي تعطي منتج واحد مميزة بكر (لين 3). التمهيدي إلى الأمام المستخدمة في حارات 1 و 2 يعطي الفرقة الأقوى ويعطي أكبر منتجات PCR (المتوقع)، ويستخدم كأول التمهيدي إلى الأمام. التمهيدي الثاني المتداخلة للمجموعة الثانية من ردود الفعل PCR في سباق 3 ' هو التمهيدي إلى الأمام من 3 لين.

[بولمرس] الحمض النووي المختلفة المستخدمة في 3 ' سباق تنتج نتائج مماثلة:

اثنين بولمرس الحمض النووي مختلفة تنتج منتجات PCR نفس الحجم على الرغم من وجود شروط ركوب PCR مختلفة ل 3 ' سباق (الشكل 2). وهناك واحد فقط الفرقة المتميزة لمنتج PCR المتوقعة. كل ما لا تملك المنتسخة العكسية عناصر سالبة (-) للطرح فرقة، عرض أي تلوث الجينوم من الجيش الملكي النيبالي المستخدمة في توليف كدنا فضلا عن ردود فعل المتلقين للمعلومات اللاحقة.

نتائج سانغر التسلسل:

كانت المنتجات PCR جل تنقية وإرسالها سانغر التسلسل. إظهار النتائج هو موضح في الشكل 3 ألف جزء من اللوني تسلسل من سانغر التسلسل. ويحدد تسلسل ممثل موقع كودون التوقف، إشارة بوليادينيليشن المفترضة، وموقع الانقسام، فضلا عن بولي (أ) ذيل في سباق المنتج 3 ' (الشكل 3B).

Figure 1
رقم 1: تحديد الجينات متداخلة اثنين محددة الإشعال إلى الأمام لاستخدامها في سباق 3 '- سيظهر مثال من [بكر] منتوجات من تركيبات مختلفة من الجينات محددة إلى الأمام وتشغيل الإشعال عكس استخدام كدنا هيلا على اثيديوم بروميد الملون [اغروس] هلام مع سلم الوزن الجزيئي (ميغاواط). حارات 1 و 2 من منتجات PCR من نفس الجينات محددة التمهيدي إلى الأمام ولكن الإشعال عكس مختلفة. الأسهم تشير إلى المنتج بكر المتوقعة لكل حارة. بالإضافة إلى الفرقة لمنتج PCR المتوقعة، هناك عصابة إضافية. منتج PCR واحد في 3 حارة من جينات مختلفة محددة المتداخلة إلى الأمام وعكس تمهيدي ويظهر الفرقة الوحيدة المتوقعة.

Figure 2
رقم 2: التحقق من سباق المنتجات 3 ' من المجموعة الثانية من ردود الفعل PCR. تم تشغيل المنتجات من تفاعل PCR الثانية مع بوليميراز () بفو دنا بوليميريز والحمض النووي (ب) تشيميريك على [اغروس] هلام مع اثيديوم بروميد. الممرات التي يصور بها (-) من عينة مراقبة سلبية لكل خط الخلية عندما أجرى توليف كدنا من الجيش الملكي النيبالي في غياب إنزيم المنتسخة العكسية. حارات 1 و 2 من منتجات PCR من replicates البيولوجية لكل خط الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: رسم خرائط منتجات PCR 3 ' سباق. (أ) بجزء من chromatogram تسلسل جل تنقية 3 ' سباق منتج عرض إشارة بوليادينيليشن المتوقعة وموقع الذيل poly(A). (ب) ممثل تسلسل من سانغر التسلسل البيانات عرض كودون التوقف، إشارة بوليادينيليشن (PAS)، الموقع الانقسام ومرفق الذيل poly(A) وكذلك قسم من تسلسلات ذيل بولي (A). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

دورة خطوة درجة الحرارة والمدة عدد الدورات
تمسخ الأولى 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق 1
الصلب والتمديد الأولى 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق 1
سوبسيليس (تمسخ، والصلب وملحق) 95 درجة مئوية عن 40 ثانية، 50 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق 20
دورة النهائي (تمسخ والصلب وملحق) 95 درجة مئوية عن 40 ثانية، 50 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 72 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة 1
عقد 4 درجة مئوية، ∞

الجدول 1: بفو ظروف ركوب PCR بوليميريز الحمض النووي لسباق 3 '.

دورة خطوة درجة الحرارة والمدة عدد الدورات
تمسخ الأولى 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق 1
الصلب والتمديد الأولى 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق 1
سوبسيليس (تمسخ، والصلب وملحق) 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 50 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة 4 20
دورة النهائي (تمسخ والصلب وملحق) 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 50 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 72 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة 1
عقد 4 درجة مئوية، ∞

الجدول 2: بوليميراز الدنا تشيميريك PCR ظروف ركوب الدراجات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وعلى الرغم من ظهور تقنيات ضخمة يسلسل موازية، على أساس الجينات بالجينات، 3 ' سباق لا يزال الأسلوب الأسهل والأكثر اقتصادا للتعرف على نظام تقييم الأداء والنيوكليوتيدات المجاورة بذيل poly(A). تكييف الموصوفة هنا يوسع استخدام 3 'سباق إلى تضخيم وخريطة تسلسل التي تشمل قسما من ORF كودون التوقف و أكملها 3' UTR من محضر مرناً ANKHD1 . ميزة رئيسية لسباق 3 'أنه مع تعديلات طفيفة قليلة، يمكن استنساخ المنتجات من 3' سباق إلى ناقلات أخرى لتسهيل استجواب UTR الدالة 3 ' بما في ذلك استهداف ميرنا وفحوصات الاستقرار فضلا عن فحوصات أخرى آليا إلى المصب. يمكن أن يتم ذلك من قبل بما في ذلك مواقع إنزيم التقييد داخل9،متواليات متداخلة التمهيدي10. يمكن إجراء تعديلات ليشمل فقط 3 'UTR دون أي تسلسل من ORF للاستنساخ لأغراض الاختبارات الوظيفية UTR 3'5.

هو أحد المحددات رئيسية لنجاح 3 ' سباق تطوير كبسولة تفجير المتداخلة التي تستهدف الجين للفائدة. تسلسلات كدنا من مستعرض الجينوم انسيمبل ينصح بتحديد أفضل المناطق دون مجمع الأشكال المتعددة من أجل تطوير أجهزة الإشعال الأمثل. ومن الناحية المثالية، عدة متداخلة إلى الأمام كبسولة تفجير، وكذلك يمكن فحص كبسولة تفجير عكس اثنين على الأقل داخل الجين لمصلحة استخدام PCR القياسية لتحديد الإشعال الجينات متداخلة محددة هما أفضل لاستخدام. في هذه الدراسة أعطى أول الجينات محددة إلى الأمام التمهيدي المحدد لسباق 3 ' في البداية شريطين مع بكر القياسية المستخدمة بشكل روتيني في المختبر. ولسوء الحظ، محدودة عدد كبير من البرامج في نسخة مصلحة التصميم التمهيدي. بطانات في نص الهدف يؤدي إلى عدم تطابق بين كبسولة تفجير والهدف، مما يؤدي إلى عدم كفاءة الصلب والتضخيم، وينبغي أن تخفض إلى الحد أدنى19. قد يؤدي وجود بطانات أربعة على الأقل في أول كتاب واحد، أو حدوث مزيج من خمس حالات عدم التطابق (التمهيدي ثلاثة في واحد واثنان في آخر) في تثبيط كامل لتفاعل PCR، ومن ثم الخيار الوحيد لتصميم أجهزة الإشعال أكثر20. بدلاً من تصميم كبسولة تفجير المزيد للحصول على الفرقة واحد واحد لمعيار PCR المستخدمة للبحث التمهيدي في التجارب التي ذكرت هنا، عدلت شروط ركوب بكر وبولمرس الحمض النووي بعد ذلك، تستخدم في سباق 3 ' من أجل تحسين احتمالات الحصول على فرقة محددة واحدة. وزادت درجة الحرارة تمسخ إلى 98 درجة مئوية واحدة من بولمرس الحمض النووي (زيادة من 95 درجة مئوية المستخدمة في البحث التمهيدي). لكلا بولمرس الحمض النووي المستخدمة في 3 '"سباق بكر"، مدة تمسخ الأولى ارتفع إلى 3 دقائق بدلاً من 30 الموصى به ثانية إلى 2 دقيقة من أجل تجريدها الكامل القالب كدنا. فعلى سبيل المثال التمهيدي25 ديناراً اليغو T7 يتوقع أن يحتمل أن تكون النموذج ضعف الهياكل الثانوية، مما قد يقلل من توافر كبسولة تفجير21. زيادة طول تمسخ الأولى ودرجة الحرارة فواصل أي الهياكل الثانوية ويساعد العائد الفرقة محددة واحدة بعد الدورة النهائية من سباق 3 '. وباﻹضافة إلى ذلك، كانت الفرقة غير محددة أخف من العصابات المتوقعة، مما يوحي بأنه يبدو في أعلى PCR الدورات (دورات ليصل إلى 35)؛ قصر دورات PCR إلى 20 فقط يقلل من التضخيم في الفرقة غير محددة.

إمكانيات أخرى من 3 ' العرق، مثل سائر بكر على أساس ردود الفعل، هو التضخيم غير مكتملة من المنطقة المستهدفة22. ومن ثم، لكلا الإنزيمات لاسخدام انلينغ درجة الحرارة الأولية بمبلغ 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتحسين الصلب من الإشعال إلى الهدف وتبع ذلك درجة حرارة تمديد أولى في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. وكان دورة PCR النهائي لكل إنزيم وقت تمديد نهائي لمدة 15 دقيقة في 72 درجة مئوية. وكانت هذه الخطوات ملحق أطول من تلك التي أوصت بها الجهات المصنعة بولمرس الحمض النووي. خطوة التمديد الطويل (الاستطالة) يسمح توليف كاملة من أمبليكونس غير مكتملة، تمكين ملحق كامل عن منتجات التضخيم الأولية والنهائية16.

بكر الخطوات التي تحدث في سباق 3 ' حساسة للغاية، حيث أنهم قد كشف الحمض النووي (أو تلويث الحمض النووي الأخرى) بدلاً من نص الهدف مرناً، أسفر عن عدة نطاقات غير متوقعة في جل22. طريقة واحدة لمنع التلوث هو القيام بعمل PCR في غطاء PCR مخصص، وارتداء القفازات، واستخدام الكواشف نظيفة وأنابيب معقم يعقم "الماصة؛" نصائح. في PCR العادية، يمكن أن تصمم الإشعال إلى الأمام وعكس حيث يوجدون في exons مختلفة (عبر كبسولة تفجير إنترون)؛ بهذه الطريقة، سوف يعني منتج PCR عادي كبير زاد منطقة التي تحتوي على إنترون. ومع ذلك، هذا قد دائماً لا ممكناً في حالة ما إذا إلا 3 'تسلسل UTR، تقع داخل إكسون الطرفي نفسه، هو الهدف لسباق التضخيم 3'. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يكون الجيش الملكي النيبالي قبل المعالجة مع إنزيم الدناز قبل توليف كدنا. استخدام T7 اليغو التمهيدي25 ديناراً رئيس الوزراء رد فعل المنتسخة العكسية بدلاً من هيكسانوكليوتيدي عشوائي لتوليف كدنا حبلا أول من الجيش الملكي النيبالي يقلل أيضا من تضخيم المنتجات الجينوم. أخيرا وليس آخراً، إنشاء عنصر تحكم سلبية ("–" الممرات في الشكل 2)، حيث يتم إعداد توليف كدنا في غياب المنتسخة العكسية ينصح بشدة. يخضع للمراقبة خطوات مماثلة على عينات أخرى في سباق الإجراءات اللاحقة 3 '. يعني وجود عصابة في عنصر التحكم هذا التلوث الدنا الجينومي المحتملة.

وعلى الرغم من التحديات المذكورة أعلاه، 3 'العرق أداة قوية في رسم الخرائط 3' ينتهي على أساس جينات فردية. ظهور تكنولوجيا الجيل القادم قد أدى إلى زيادة في المرجع للنصوص التي لها البديل 3 ' ينتهي الناتجة عن بوليادينيليشن البديلة، التي قد أو قد لا تنطوي على الربط بديلة. إضافة إلى التعقد، في الخلايا السرطانية، ترتيبات جديدة الصبغية متكررة ويمكن أن ينتج الجينات النمطان الانصهار المنتجات23. الانصهار بين اثنين من الجينات قد تشمل ORF، أو في بعض الحالات، تشمل فقط تسلسل ضمن9،10UTR 3 '. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا جينات ملتصقين/المشارك-ترانسكريبيد، التي يتم نسخها في وقت واحد ولكن يجوز أن تترجم البروتينات المختلفة11. 3 ' العرق يمكن تكييفها لتعيين جميع هذه النصوص غير طبيعية فريدة من نوعها، وكذلك النصوص العادية. وهذا مهم لأن هذه النصوص غير طبيعي قد ينتهي بمثابة المؤشرات الحيوية أمراض معينة أو أهداف محددة من المخدرات، مثل، يستهدف الدواء Imatinib ABL1 بنك الجينات الانصهار في السرطان.

ومن ثم، 3 'سباق هو أسلوب متعدد الاستخدامات التي يمكن أن تستخدم لتضخيم النصوص العادية، والتعرف على الرواية تحيلها 3'، واندماج رواية الجين داخل5،9UTR 3 '. وفي هذا التقرير، 3 'سباق استخدمت لتضخيم وخريطة كودون التوقف، ونظام تقييم الأداء، وأكملها 3' UTR من محضر ANKHD1 باستخدام مختلف الحمض النووي [بولمرس]. يمكن استخدام النهج المبين الخريطة 3 ' نهاية أي نسخة بوليادينيلاتيد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونود أن نعترف جيبس بيتين لمساعدتها التقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

Tags

علم الوراثة، العدد 133، النصوص، 3 'نهاية، 3' التضخيم السريع كدنا الغايات (3 ' سباق)، تفاعل البوليميراز المتسلسل، إشارة بوليادينيليشن (PAS)، بوليادينيليشن
تكييف 3 ' التضخيم السريع من كدنا ينتهي إلى خريطة المحاضر في السرطان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' … More

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter