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Immunology and Infection

Formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos: técnicas para la identificación y cuantificación

Published: May 06, 2018
doi:
10.3791/57322
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,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics,Harvard Medical School

Summary

Este protocolo permite al lector a analizar la formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos usando un enfoque multifacético para capturar la naturaleza dinámica de los biofilms bacterianos mediante la evaluación de adherencia, formación de la matriz de sustancias poliméricas extracelulares, y de dispersión.

Abstract

Formación de biopelículas es un proceso dinámico y gradual que se produce en bacterias bajo condiciones ambientales difíciles o momentos de estrés. Para patógenos entéricos, se induce una respuesta de estrés importante durante el tránsito gastrointestinal y a la exposición de la bilis, un componente normal de la digestión humana. Para superar los efectos bactericidos de la bilis, muchos patógenos entéricos forman una biopelícula que se presumen para permitir sobrevivir al tránsito por el intestino. Aquí presentamos metodologías para definir la formación de biopelículas a través de ensayos de fase sólida adherencia así como detección de la matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y visualización. Además, se presenta evaluación de dispersión de biofilm para imitar el análisis de eventos desencadenar liberación de bacterias durante el proceso de infección. Tinción de cristal violeta se utiliza para detectar bacterias adherentes en un ensayo de adherencia de la placa de 96 pozos de alto rendimiento. Evaluación de producción de EPS está determinada por dos ensayos, a saber, microscopía de tinción de la matriz EPS y análisis semicuantitativo con una lectina de polisacárido conjugado fluorescente. Por último, dispersión de biofilm se mide a través de recuentos de colonias y chapado. Datos positivos de ensayos múltiples apoyan la caracterización de biopelículas y pueden ser utilizados para identificar la formación de biopelículas inducida por sales biliares en otras cepas bacterianas.

Introduction

Formación de biofilms es una estrategia importante de supervivencia bacteriana inducida durante duras condiciones ambientales. Exposición a compuestos bactericidas como antibióticos o cambios en los nutrientes o la disponibilidad de oxígeno induce un estado de estrés en las bacterias que pueden ser aliviadas a través de la formación de biopelículas. Una biopelícula se caracteriza por el accesorio de bacteria a una superficie o a otras bacterias y se acompaña de la secreción de la matriz de EPS conformada principalmente por polisacáridos1,2,3. Formación de biopelículas es un proceso dinámico en el que una cascada de eventos culmina en la formación de una comunidad bacteriana adherente madura1,2,3. Las bacterias producen adhesinas para facilitar el apego temprano mientras cambio de perfiles de expresión génica de adhesina para fortalecer el apego durante la maduración de la biopelícula. Al mismo tiempo, ocurre la producción de EPS para cubrir la comunidad bacteriana en una matriz para proteger las células contra el estresor inicial. Bacterias dentro del biofilm son de crecimiento lento; y como tal, la mayoría antibióticos ineficaces. Además, el lento crecimiento conserva energía hasta que las condiciones cambien para favorecer el crecimiento bacteriano1,2,3. Después de las duras condiciones, las bacterias dispersan el biofilm y reanudar un estilo de vida planctónica1,2,3. Tradicionalmente, los biofilms se observan en las superficies y representan un desafío clínico persistente debido a depósitos de infección en catéteres y en la vivienda aparatos1,2,3.

Formación de biofilms fue descrita recientemente por varios patógenos entéricos; bacterias que infectan el intestino delgado o colon4. Para las especies de Shigella , la infección ocurre en el colon humano después de un tránsito a través de la mayoría del tracto gastrointestinal. Durante el paso por el intestino, Shigella se expone a la bilis; un detergente de degradar lípidos secretado en el intestino para facilitar la digestión de lípidos mientras que simultáneamente mata la mayoría de las bacterias5. Patógenos entéricos tienen una capacidad única de resistir los efectos bactericidos de bilis6. Nuestro análisis recientes utilizaron en vivo-como combinaciones de glucosa y las sales biliares para demostrar formación de biofilm robusto en S. flexneri , así como otras especies de patógenos Shigella, Escherichia coliy Salmonella4. Previamente, Salmonella enterica serovar Typhi fue demostrado para formar un biofilm inducida por bilis debido a la colonización única de la vesícula biliar durante la infección crónica7,8,9, 10. Además, investigaciones previas con Vibrio11y Campylobacter12 demostraron la formación de biofilm en respuesta a la bilis. Por lo tanto, los análisis amplió las observaciones de la formación de biofilm inducida por bilis a otros patógenos y ayudan a establecer la demostración de una respuesta patógeno entérico conservado a bilis. A diferencia de la crónica biofilms que transcripción genética bacteriana limitada y senescencia celular puede ocurrir1,2,3, proponemos que el biofilm inducida por bilis entérico es más transitorio en naturaleza. Este transitorio, biofilm virulento se caracteriza por un desmontaje rápido (como se ve en el análisis de dispersión) y una mayor expresión de genes de virulencia en la biopelícula población4,6. 

Formación de biopelículas es un proceso multifacético, dinámico y el uso de las sales biliares como un factor de iniciación sólo ha sido recientemente descrito por patógenos entéricos más, las herramientas y técnicas utilizadas son únicas y creativas aplicaciones de los métodos tradicionales. Por lo tanto, aquí se presentan tres estrategias gratuitas para cuantificar varias características importantes de la formación de biofilm inducida por sales biliares, incluyendo la adherencia bacteriana, producción de la matriz EPS y la dispersión de bacterias viables del biofilm. Estas técnicas se han utilizado principalmente para la investigación con Shigella; y por lo tanto, la evaluación de otros patógenos entéricos puede requerir optimización. Sin embargo, datos positivos de los tres ensayos apoyan identificación de biofilms y establecen protocolos reproducibles para la formación del biofilm inducida por sales biliares.

Protocol

1. preparación de reactivos Medio de las sales biliares: para preparar el caldo de soja tríptica (TSB) que contiene las sales biliares 0,4% (peso/volumen), resuspender 200 mg de las sales biliares en 50 mL esterilizado TSB. Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Hacer medio fresco cada semana.Notas: Las sales biliares utilizadas habitualmente es una mezcla de 1:1 de colato sódico y desoxicolato de sodio aislado de las vesículas ovinas y bovinas. Como demostrado anteriormente4, la presencia de glucosa se requiere para la formación del biofilm inducida por sales biliares. TSB agrega glucosa en relación con caldo de Luria-Bertani (LB); y por lo tanto, era suficiente para inducir la formación de biofilm en Shigella y los otros patógenos entéricos analizados. Dependiendo de la bacteria a analizar, podrían necesitarse concentraciones diferentes de glucosa o azúcar diferentes requisitos. 0.5% w/v cristal violeta en agua: disolver 2,5 g de cristal violeta en 500 mL de agua destilada. Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Concanavalina A (ConA) conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC): reconstituir el stock en PBS 1 x. Diluir el caldo 10 mg concentrado con 400 μL de PBS 1 x a una concentración final de 25 μg/mL y proteger de la luz. PBS + glucosa: Disolver 0,2 g de glucosa en 10 mL 1 x PBS (glucosa 2% w/v final). Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco en el día de uso. PBS + sales biliares: Disolver 40 mg en 10 mL 1 x PBS (0.4% w/v sales biliares finales). Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco en el día de uso. PBS + glucosa y sales biliares: disolver las sales biliares 40 mg y glucosa 0,2 g en 10 mL 1 x PBS (0.4% w/v biliares sales y glucosa de 2% w/v final). Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco en el día de uso. Preparar placas de agar LB. Solución de formaldehído/glutaraldehído: 810 añadir μl formaldehído (solución 37%, concentración final de 3%) y glutaraldehído de 125 μl (solución 25%, concentración final de 0.25%) a 14 mL 1 x PBS. Homogeneizar y almacenar a 4 ° C. La solución debe estar fría para el uso correcto.PRECAUCIÓN: La solución es tóxica y requiere de disposición de residuos peligrosos. Solución Antifade mountant: utilizar solución antifade mountant que contiene manchas de 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para inhibir el fotoblanqueo de muestras de microscopía inmunofluorescente y tinción fluorescente del ADN de las bacterias. 2. preparación de las bacterias Crecen durante la noche cultivos de cepas bacterianas a probarse al inocular 3 mL de TSB con una colonia sola, bien aislada en un tubo de cultivo estéril. Incubar a 37 ° C con agitación a 225 rpm para la incubación durante la noche (16-24 h).Nota: Las cepas deben ser restreaked de las existencias del congelador cada 2 a 4 semanas y placas de mantenimiento en no más de 2 semanas de edad. 3. fase sólida adherencia ensayo Nota: Esta prueba cuantifica las bacterias adherentes utilizando un método de placa de 96 pocillos. Las bacterias se cultivan estáticamente en las placas de fondo plano. Lavado se realiza para eliminar las bacterias no adherente y bacterias adherentes se tiñen con cristal violeta. El colorante violeta cristal une peptidoglicano en la pared celular bacteriana y puede ser solubilizado con etanol. El número de bacterias adherentes se determina basado en retención de violeta cristal. Configurar dos tubos de 1,5 mL. Etiqueta con TSB o TSB + sales biliares (BS). Añadir 1 mL de TSB o TSB + BS en los respectivos tubos. Inocular los tubos con 20 μl del cultivo durante la noche (en un 1:50 dilución). En una placa de 96 pocillos estéril, clara, fondo plano, tratada con cultivo de tejidos, añadir 130 μL/pocillo de medios de control no inoculado a tres pozos para servir como el control en blanco. Establecer tres pocillos de control para cada tipo de medios de comunicación (TSB TSB + y BS) para ser probado. Agregar 130 μL/pocillo de cultivo inoculados en tres pozos y repita hasta que todas las condiciones experimentales se platean por triplicado. Incubar durante 4-24 h a 37 ° C estáticamente. Usando un lector de placas, registro el OD600. Establecer los pocillos de control como ‘en blanco’. Confirmar que el medio de control es claro sin evidencia de turbidez. Si se detecta cualquier turbidez, deseche el experimento. Los valores de OD600 pueden utilizarse para normalizar los datos si existen diferencias significativas en la tasa de crecimiento entre cepas bacterianas. Retire el medio de cultivo utilizando una línea de vacío inclinando suavemente la placa y aspirando lentamente el medio en el borde inferior del pozo. Asegúrese de recoger todo el medio de cultivo sin afectar la población bacteriana adherente en la superficie de plástico. Si la matriz EPS fue producido durante el tiempo de incubación, la matriz será visualizada como un precipitado blanco. No molestes a la matriz EPS. Lave suavemente los pozos una vez con 200 μL de PBS estéril. Retire el lavado PBS utilizando la línea de vacío. Invertir la placa para secar. Deje un mínimo de 20 minutos para secar.Nota: Puesto que el biofilm debe secarse completamente antes de la tinción, el protocolo puede ser pausado en este paso por unas horas o incluso durante la noche. El tiempo de secado adicional no modificará el procedimiento de tinción mientras que el secado incompleto afecta a la cuantificación de los resultados y la reproducibilidad. Añadir 150 μL de violeta de cristal de 0.5% a cada uno experimental y el control también. Incubar por 5 min a temperatura ambiente (RT). Lavar los pozos una vez con 400 μL de agua destilada. El volumen agregado ayuda a eliminar residuos cloruro de metilrosanilina de los lados de los pocillos. Retire la colada con la línea de vacío. Lavar los pocillos 5 veces con 200 μL de agua destilada. Retire la colada con la línea de vacío.Nota: Lavado cuidadoso es importante para la cuantificación. Cuando los pocillos del blanco de agua destilada y no contienen ningún residual cloruro de metilrosanilina, proceder al siguiente paso. Invertir la placa para seco, protegido de la luz. Asegurar un secado completo de la placa como se señaló anteriormente. Desmanchar los pozos con 200 μL de etanol al 95%. Incube la placa en el agitador durante 30 minutos. Para evitar la evaporación, particularmente en temperaturas más altas, realizar este paso a 4 º C. Usando un lector de placas, grabar la OD540.Nota: La longitud de onda de máxima absorbancia de la violeta cristalina es cerca de 590 nm. La literatura reporta un rango de OD540 – OD5954,13,14,15,16 violeta cristal absorbencia; por lo tanto elegir una longitud de onda disponible en el lector de la placa base. 4. EPS matriz detección Nota: Estos ensayos gratuitos cuantifican y visualizar la EPS. En tanto, EPS se detecta mediante una lectina de polisacáridos se unen. La proteína fluorescente conjugado permite cuantificación (paso 4.1) o visualización (paso 4.2). Detección semicuantitativa de EPS Configurar dos tubos de 1,5 mL. Etiqueta con TSB o TSB + BS. Añadir 1 mL de TSB o TSB + BS en los respectivos tubos. Inocular los tubos con 20 μl del cultivo durante la noche (un 1:50 dilución). En una placa de 96 pocillos estéril, negro, fondo plano, tratada con cultivo de tejidos, añadir 130 μL/pocillo de medios de control no inoculado a tres pozos para servir como el control en blanco. Establecer tres pocillos de control para cada tipo de medio ser probado. Añadir 130 μL/pocillo de cultivo inoculados a los pozos y repita hasta que todas las condiciones experimentales se platean por triplicado. Incubar durante 4-24 h a 37 ° C estáticamente. Transfiera el medio de cultivo a una placa de 96 pocillos claro con una pipeta, idealmente una pipeta multicanal. Ser cauteloso para recoger todo el medio de cultivo sin afectar la población adherente o la EPS se encuentra en la superficie de plástico. Ponga a un lado. Fije la placa negra durante 15 min a TA con 200 μL/pocillo de formaldehído/glutaraldehído en 1 x PBS. Mientras que la población adherente es fijación, evaluar la fracción sobrenadante del paso 4.1.6. Usando un lector de placas, registro el OD600. Establecer los pocillos de control como ‘en blanco’. Confirmar que el medio de control es claro sin evidencia de turbidez. Si se detecta cualquier turbidez, deseche el experimento. Por otra parte, el ensayo completo puede realizarse en una placa de fondo negro claro. En estas circunstancias, los valores de OD600 pueden grabarse y el medio de cultivo pueden ser posteriormente desechado antes de proceder al paso 4.1.7. Los valores de OD600 pueden utilizarse para normalizar los datos en el caso hay diferencias significativas en la tasa de crecimiento entre cepas bacterianas. Retire el parche y deshacerse de los residuos peligrosos. Lave suavemente los pocillos dos veces con 200 μL/pocillo de PBS estéril. Retire el lavado PBS utilizando la línea de vacío inclinando suavemente la placa y lentamente aspirando el lavado en el borde inferior del pozo. Añadir 150 μL/pocillo de ConA-FITC de 25 μg/mL e incubar por 15 min a TA. Suavemente Lave dos veces con 200 μL de PBS. Añadir 150 μL de PBS a cada pocillo. Registrar la fluorescencia a 488 nm. Visualización de la microscopia confocal de la producción de EPS y cálculo del espesor de la biopelícula Configurar dos tubos de 1,5 mL. Etiqueta con TSB o TSB + BS. Añadir 1 mL de TSB o TSB + BS en los respectivos tubos. Inocular los tubos con 20 μl del cultivo durante la noche (en un 1:50 dilución). Configurar una placa de 24 pocillos estéril con 12 mm redondo vidrio cubreobjetos estériles. Añadir 400 μL/pocillo de medios de control no inoculado a tres pozos para servir como el control en blanco. Establecer tres pocillos de control para cada tipo de medio ser probado. Añadir 400 μL de cultivo inoculados a wells por duplicado y repita hasta que todas las condiciones experimentales son plateadas. Incubar durante 4-24 h a 37 ° C estáticamente. No confirmar visualmente el crecimiento en la condición TSB, crecimiento y precipitado EPS (blanco) en el TSB + condición de BS y crecimiento o precipitado blanco en los pozos control estéril. Eliminar el sobrenadante. Fijar durante 15 min a temperatura ambiente en 200 μL/pocillo de solución de glutaraldehído formaldehído / de 1 x PBS. Eliminar la solución y disponer de residuos peligrosos. Lave suavemente los pocillos dos veces con 200 μL/pocillo de PBS estéril. Retire el lavado PBS utilizando la línea de vacío. Añadir 150 μL/pocillo de ConA-FITC de 25 μg/mL e incubar por 15 min a TA. Suavemente Lave dos veces con 200 μL/pocillo de PBS. Monte con solución antifade mountant con DAPI.Nota: La solución es una solución de montaje prefabricado, basado en el glicerol que contiene DAPI para conservar la etiqueta fluorescente mientras que simultáneamente tinción el ADN en células bacterianas para la visualización como un contraste. Siga las instrucciones y recomendaciones del kit para tiempos de incubación antes de la proyección de imagen muestras. El DAPI procedimiento de tinción se puede realizar antes de aplicar la solución antifade mountant que contienen DAPI. Evaluar por microscopía confocal. En un microscopio confocal, ajustar el láser a 495 nm/519 nm excitación/emisión para visualización de FITC. Establecer un segundo láser a 360 nm, 460 nm excitación/emisión visualizar DAPI. Localice el biofilm, centrándose en el canal DAPI. Utilizar canales de la DAPI y FITC para determinar el espesor completo y la parte superior e inferior imagen fronteras. Grabar imágenes de todo el espesor Z-stack mediante la captura de imágenes cada 0.25 μm después de establecer perímetros en la parte superior e inferior de la pila de z. Para obtener más información sobre microscopía confocal, consulte publicaciones por Prado et al. 17 , 18 , 19 , 20 Reconstruir las imágenes 3D en ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) para visualizar la formación de biofilm completo y calcular el espesor de la biopelícula. El espesor medio obtenido por S. flexneri sales biliares inducida por biofilms fue de 14 μm4. 5. ensayo de dispersión Nota: En este ensayo, el desmontaje del biofilm a través dispersión bacteriana se detecta. Aquí, se establecen biofilms maduros y posteriormente (generalmente al día siguiente), los medios de comunicación se sustituyen con PBS o suplido PBS. El componente sobrenadante es luego evaluado para cuantificar el número de bacterias que han disociado de la biopelícula. Configurar dos tubos de 1,5 mL. Etiqueta con TSB o TSB + BS. Añadir 1 mL de TSB o TSB + BS en los respectivos tubos. Inocular los tubos con 20 μl del cultivo durante la noche (en un 1:50 dilución). En una placa de 96 pocillos estéril, clara, fondo plano, tratada con cultivo de tejidos, añadir 130 μL/pocillo de medios de control no inoculado a tres pozos para servir como el control en blanco. Establecer tres pocillos de control para cada tipo de medios de comunicación ser probado. Añadir 130 μL/pocillo de cultivo inoculados a tres pozos y repita hasta que todas las condiciones experimentales se platean por triplicado. Incubar la placa por 4-24 h a 37 ° C estáticamente. Antes de continuar, caliente la PBS, PBS + glucosa, PBS + sales biliares y PBS + sales biliares + glucosa a 37 ° C. Preparar diariamente de estos reactivos. Usando un lector de placas, registro el OD600. Establecer los pocillos de control como ‘en blanco’. Confirman que el medio es claro sin evidencia de turbidez. Si se detecta cualquier turbidez, deseche el experimento. Los valores de OD600 pueden utilizarse para normalizar los datos si existen diferencias significativas en la tasa de crecimiento entre cepas bacterianas. Retire el medio de cultivo utilizando una línea de vacío. Asegúrese de recoger todo el medio de cultivo sin afectar la población adherente en la superficie de plástico. Lave suavemente los pocillos dos veces con 200 μL/pocillo de PBS estéril. Retire el lavado PBS utilizando la línea de vacío. Sustituir el lavado con 130 μL/pocillo de los siguientes en tres pozos: PBS, PBS + glucosa, PBS + sales biliares y PBS + sales biliares + glucosa. Estos reactivos deben ser precalentados a 37 ° C. Incube la placa durante 30 min a 37 ° C. Retire con cuidado la placa de la incubadora de 37 ° C. Transferir el sobrenadante a una placa de 96 pocillos estéril, fresca. Usando un bloque de 96 pocillos la placa o dilución, preparar 10 veces (1:10) diluciones seriadas del sobrenadante en PBS estéril.Nota: La serie de diluciones debe estar comprendida de no diluido a 10-6 dependiendo de la cepa bacteriana para ser probado. Experiencias piloto se pueden realizar para determinar el rango de dilución óptima. Spot de la placa 5 μl de cada dilución en agar LB con una pipeta multicanal. Incubar a 37 ° C durante la noche. Contar las colonias en los próximos días y cuenta para el factor de dilución para determinar la Colonia recuperación formando unidades (UFC). Para calcular la dispersión por ciento en comparación con el 1 x PBS control de (100%), dividir la recuperación UFC de cada condición de tratamiento por la recuperación de UFC de la muestra de control de 1 x PBS.Nota: Las placas de los medios de comunicación de rutina para la cepa bacteriana de interés también pueden ser utilizadas. Por ejemplo, Shigella puede ser plateado en las placas de rojo Congo. Asegúrese de que las placas estén secas para técnicas apropiadas de la galjanoplastia del lugar.

Representative Results

En la figura 1, formación de biopelículas se induce en la mayor parte del crecimiento siguiente prueba seis patógenos entéricos en medios que contienen sales biliares. Un aumento significativo de bacterias adherentes después de la exposición de las sales biliares se observa en casi todas las cepas probadas. La excepción es enteroaggregative e. coli (CEEA); sin embargo, tenga en cuenta la observación inducida de los mutantes de la<em…

Discussion

Análisis de la formación de biofilm es un reto debido a la naturaleza dinámica de biofilms y la variabilidad entre cepas, materiales, laboratorios y ensayos. Aquí, se presentan varias estrategias para determinar la formación de biopelículas en patógenos entéricos después de la exposición de las sales biliares con conocimiento experimental para promover la reproducibilidad. Hay consideraciones adicionales para asegurar la reproducibilidad. Ante todo, recomendamos realizar independiente por lo menos tres experime…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Rachael B. Chanin y Alejandro Llanos-Chea para asistencia técnica. Agradecemos a Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski y Bobby Cherayil para las cepas utilizadas en este estudio. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de alergias y K22AI104755 de subvención de enfermedades infecciosas (C.S.F.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Materials

Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich  22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G 
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500 
Formaldehyde Sigma-Aldrich  F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One  655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000
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References

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Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).
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