Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Efectos duales de factores derivados de células de Melanoma en la diferenciación de adipocitos de médula ósea

5.3K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/57329

⸱

23 de agosto de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Rheumatology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Department of Nephrology and Rheumatology, Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Medical Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un sistema de cocultivo (2D) bidimensional sencillo y confiable para el estudio de la interacción entre las células del tumor y adipocitos de médula ósea, que revela un doble efecto de factores derivados de células de melanoma en los adipocitos de la médula ósea diferenciación y también representa un método clásico para el estudio mecanístico de la metástasis del hueso.

Resumen

La diafonía entre los adipocitos de la médula ósea y las células del tumor puede jugar un papel fundamental en el proceso de metástasis del hueso. Una variedad de métodos están disponibles para el estudio de la interferencia significativa; sin embargo, un sistema de dos dimensiones transwell cocultivo sigue siendo un clásico, fiable y fácil para este estudio de la diafonía. Aquí, presentamos un protocolo detallado que muestra el cocultivo de los adipocitos de la médula ósea y las células del melanoma. Sin embargo, un sistema de cocultivo podría no sólo contribuir al estudio de transducciones de señales celulares de las células de cáncer inducidas por adipocitos de médula ósea, pero también al futuro mecanicista estudio de metástasis de hueso que puede revelar nuevas dianas terapéuticas para el hueso metástasis.

Introducción

Las metástasis óseas son frecuentes entre pacientes con cáncer avanzado, pero un tratamiento curativo no está todavía disponible. Más allá de especializado en almacenar energía como grasa, adipocitos pueden apoyar el crecimiento del tumor y metástasis en médula ósea y otros órganos1,2,3,4,5,6. Por otra parte, adipocitos desempeñan un papel esencial en la regulación del cáncer celular biología7,8,9,10 y metabolismo4,11,12 ,13,14,15,16, como así como en hueso metástasis1,4,12. En el nicho de la médula ósea, los adipocitos también pueden afectar el comportamiento biológico del cáncer las células4,6,17. La interacción entre los adipocitos de la médula ósea y las células cancerosas con osteotropism es importante para entender la metástasis del hueso. Sin embargo, poco se sabe.

Basado en los estudios actuales, diversos métodos se aplican a los adipocitos, incluyendo dos o tres dimensiones (2/3D) y ex vivo culturas17,18,19,20,21. Recientemente, Herroon et al. diseñado un nuevo enfoque de la cultura de 3D para el estudio de las interacciones de los adipocitos de la médula ósea con células de cáncer22. Aunque el cocultivo 3D es óptimo para mímico fisiológica interacciones entre adipocitos y el cáncer de células en vivo, sufre una pobre reproducibilidad22,23. En comparación con un sistema de cocultivo 2D, un sistema de cocultivo 3D puede proporcionar diferentes fenotipos celulares, como células morfología21,22,24,25,26. Además, el cultivo ex vivo de fragmentos de tejido aislado de hueso esponjoso puede conducir a un resultado robusto de adipocitos cultivados médula células17.

En contraste con los modelos anteriores, sin embargo, el modelo de cultivo celular 2D sigue siendo una técnica clásica, fiable y fácil para escanear rápidamente moléculas de candidato y los fenotipos cambiados en adipocitos o cáncer células in vitro1, 4,6,12,15,27. Para entender mejor la diafonía entre los adipocitos de la médula ósea y las células del melanoma, proporcionamos un protocolo detallado para un sistema de cocultivo 2D de los adipocitos de la médula ósea con células de melanoma.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Nota: Todas las células utilizadas este protocolo deben ser crecidas durante al menos tres generaciones después de la descongelación de las células comunes.

1. factores derivados de células de Melanoma de la cosecha

  1. Preparaciones
    1. Obtener células B16F10 y una línea de células de melanoma de ratón.
      Nota: Para este protocolo, se obtuvo una línea de células de melanoma de ratón desde el Banco de células madre de la Academia China de Ciencias.
    2. Hacer un medio completo para cultivo celular B16F10 (100 mL). Uso medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 50 U/mL de penicilina y 50 μg/mL de estreptomicina.
    3. Hacer un medio libre de suero para la inanición de las células de B16F10 (50 mL). Uso de medio sin SFB DMEM, 50 U/mL de penicilina y 50 μg/mL de estreptomicina.
  2. Preparar medio condicionado melanoma (CM)
    1. Las células5 B16F10 semilla 2.0 x 10 100 mm plato con 10 mL de 10% FBS DMEM. Luego incubar las células en una incubadora de 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 durante 24 h.
    2. Cuando las células alcanzan alrededor del 80% de confluencia, eliminar el medio de cultivo, lavan las células dos veces con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1 x, pH 7,4) y reemplazar el medio con 10 mL de medio libre de suero para el hambre.
    3. Volver las células a la incubadora durante 18 – 24 h.
    4. Después de la inanición, recoge el medio condicionado (CM) con una pipeta y transferir a un tubo de centrífuga de 50 mL fresco.
      Nota: El medio condicionado es el sobrenadante de las culturas de célula B16F10. Asegúrese de que las células B16F10 están en buenas condiciones antes de recoger el CM.
    5. Centrifugue la CM durante 5 minutos a 1.000 x g a 4 ° C.
    6. Pipeta el sobrenadante y transferir a un tubo estéril fresca o botella.
      Nota: Evite el pipeteo de la pelotilla en la parte inferior del tubo.
    7. Para eliminar los restos celulares, filtro de la CM pasando a través de un filtro de 0.45 μm jeringa conectada en la parte superior un tubo o frasco estéril.
      Nota: 0,22 μm filtros son óptimos para el filtrado de la CM.
    8. Guarde el sobrenadante filtrado a-20 ° C hasta su uso.
      Nota: Es mejor no almacenar el sobrenadante a-20 ° C durante más de un mes. Alternativamente, guarde el CM a-80 ° C por más largos períodos de tiempo para la diferenciación del adipocito.

2. inducción de los adipocitos de la médula ósea por factores derivados de células de Melanoma

  1. Preparaciones
    1. Hacer 100 mL de medio de inducción de adipogenic28. Utilizar un completo DMEM suplementado con 5 μg/mL de insulina, 0.5m m 3-isobutil-1-metilxantina y dexametasona μm 1. Almacenar hasta dos semanas a 4 ° C.
    2. Preparar 100 mL de medio de mantenimiento de adipogenic. Utilizar un DMEM completo o mixto con 50% melanoma CM suplementado con 5 μg/mL de insulina.
    3. Preparar una solución stock de aceite rojo O. Disolver 30 mg de polvo de aceite rojo O en 10 mL de isopropanol (≥ 99.5%) y mezclar por vortex.
      Nota: Almacenar hasta 1 año a 4 ° C.
    4. Hacer una solución de aceite rojo O de trabajo. En la capilla del humo, diluya la solución stock de aceite rojo O (en el paso 2.1.3) con agua desionizada en la proporción 3:2. Incubar la mezcla por 15 min a temperatura ambiente y filtrar con un filtro de 0,22 μm antes de su uso.
      Nota: Sólo use la solución de trabajo fresca dentro de 2 h.
  2. Diferenciación del adipocito
    1. Cultura una célula stromal línea 14F1.1 de médula ósea de ratón29 en un plato de 60 mm con un DMEM completo en el 80% de confluencia en una incubadora de 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2.
      Nota: Como alternativa, cambie 14F1.1 con células mesenquimales derivadas de médula ósea primaria30.
    2. Trypsinize las células con 1,5 mL de una solución de tripsina 0,25% en una incubadora durante 1 – 2 minutos.
    3. Añadir 5 mL de 10% FBS medio a las células y contar el número de células con un hemocitómetro de vidrio; Luego, ajustar la densidad celular a cerca de 1 – 2 x 105/ml.
    4. Semilla 5 x 104 de 14F1.1 células por pocillo en una placa de 24 pozos con 0,5 mL de medio de inducción de adipogenic. Después de dos días de incubación, las células alcanzan alrededor del 90% de confluencia.
      Nota: Este paso es muy importante. Células estromales de médula ósea no pueden ser inducidas a adipocitos sin un medio de inducción de adipogenic.
    5. Retire el medio de inducción y lavan las células dos veces con 1 mL de PBS cada vez.
    6. Cambie a 1 mL de medio de mantenimiento de adipogenic y siga a las células de la cultura hasta la maduración del adipocito.
      Nota: Bajo el microscopio, adipocitos como pompas de jabón pequeñas o grandes y son muy fáciles de reconocer. Generalmente, adipocytes maduros están presentes en la 6th odía 8 .
    7. Los adipocitos maduros con aceite rojo O la mancha o recoger los adipocitos para un análisis de polimerasa cuantitativa (qPCR) la reacción en cadena.
  3. Tinción de adipocito
    1. Lavado 14F1.1 diferenciadas las células x 2 con PBS y fijar en formol de 3,7% durante 1 hora.
    2. Enjuague las células en isopropanol al 60% y deje que se sequen completamente.
    3. Añadir 0,2 mL de la solución de trabajo de aceite rojo O a los pocillos e incubar a temperatura de 0.5 a 2 h.
    4. Lavar las células con agua para remover los tintes no consolidados.
    5. Foto los adipocitos teñidos bajo el microscopio de luz.

3. cocultivo de los adipocitos de la médula ósea con células de Melanoma

  1. Preparaciones
    1. Preparación de hueso maduro adipocitos médula: inducir a las células 14F1.1 en adipocytes maduros de BM en placas de 24 pocillos con el medio de inducción de adipogenic durante 2 días y mantenerlas en el medio de mantenimiento de adipogenic para 6 – 8 días adicionales.
    2. Preparar las células B16F10: cultura las células B16F10 en platos de 60 mm con 5 mL de medio DMEM.
    3. Humedecer la inserción de la membrana (e.g. transwell): Añadir 150 μL de medio DMEM libre de FBS a los 0,4 μm tamaño de poro de membrana insertos y sumergirlos en los pocillos de las placas de 24 pocillos con 500 μl de medio DMEM libre de FBS.
  2. Ajuste de cocultivo
    1. Lentamente pipeta fuera el medio de cada inserto.
      Nota: No destruyen la membrana al quitar el medio.
    2. Semillas las células B16F10 (0/103105106) en los poros de 0.4 μm rellenos de paso 3.2.1.
    3. Reemplazar el medio de mantenimiento de adipogenic en los pozos con los adipocitos maduros de la médula del paso 3.1.1. con 600 μl de medio DMEM completo.
    4. La transferencia de los insertos con las células B16F10 (del paso 3.2.2) en los pozos con los adipocitos maduros de la médula (en el paso 3.2.3) para los experimentos de cocultivo.
    5. Incubar cocultures a 37 ° C y 5% de CO2 durante 2 días.
    6. Después de 48 h de incubación, quite los insertos del cocultivo y luego lavar los adipocitos 2 x con 500 μl de PBS 1 x.
      Nota: Opcionalmente, recoger las células B16F10 en los insertos para el análisis si es necesario.
    7. Los adipocitos con la solución de trabajo de aceite rojo O la mancha o recoger los adipocitos para análisis de qPCR.
      Nota: Consulte el procedimiento de tinción en el paso 2.3.
    8. Foto los adipocitos teñidos bajo el microscopio de luz.

4. Análisis de la Gene Signature Adipocyte-específico de qPCR

  1. Agregar 0,5 mL de reactivo de aislamiento de RNA listo para su uso por pozo en una placa de 24 pocillos que adipocito maduro está listo para detectar.
  2. Seguir un protocolo estándar para la extracción de RNA y la síntesis del cDNA del31.
  3. Utilice la cartilla para 18S y GAPDH como control y CEBPα/β, PPARy, FABP4, leptina, Pref-1 o la adiponectina para la firma de gene adipocyte-específico (tabla 1).
  4. Ejecute la siguiente reacción en un termociclador: 95 ° C por 20 s, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 1 s y 60 ° C por 20 s.
  5. Utilice el método 2 deΔΔCt de–para calcular que el pliegue cambia32.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

En la médula ósea, pueden aparecer adipocitos en el microambiente de tumor de13,1,33,34,35 en una etapa temprana para apoyar la progresión del tumor a través de factores solubles o activación de osteoclastogénesis6,12,36, especialmente...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Cocultures con inserciones han sido ampliamente utilizados para el estudio de las interacciones célula a célula. El sistema de cocultivo 2D es un modo eficaz de observar cómo las dos piezas diafonía en vitro, por la que aquí mostramos dos diferentes basados en celular efectos en los adipocitos de la médula ósea. Muchos laboratorios han utilizado este método para investigar la diafonía entre los adipocitos y cáncer células6,12,

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos a Dov Zipori (el Instituto Científico Weizmann, Rehovot, Israel) amablemente nos proporciona las células estromales de médula ósea murina línea 14F1.1. Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias naturales (Nº 81771729) China y la Universidad Hospital de Yongchuan de Chongqing médica (Nos. YJQN201330; YJZQN201527).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMInvitrogen Inc.
Suero Fetal BovinoInvitrogen Inc.16000– 044
Solución salina tamponada con fosfatoInvitrogen Inc.14190-144
InsulinaSigma-Aldrich91077C
3-isobutil-1-metil-xantinaSigma-AldrichI5879
DexametasonaSigma-AldrichD4902
Aceite Rojo oSigma-AldrichO0625
Placa de 24 pocillosCorningCLS3527
InsertoTranswellMilliporeMCHT24H48
Penicilina/EstreptomicinaInvitrogen15140-122
isopropanolSigma-AldrichI9516
0,25% tripsinaThermo Scientific25200056
hemocitómetroBio-Rad 1450016
incubadora de cultivoThermo Scientific
50 mL falconCorningCLS430828
Clean BenchThermo Scientific-Microscopy
Olympus-200
μ Puntas de pipeta en LBeyoGold FTIP620
Puntas de pipeta de 1.000 mLBeyoGoldFTIP628
11965092

Referencias

  1. Wang, J., et al. Adipogenic niches for melanoma cell colonization and growth in bone marrow. Laboratory Investigation. 97 (6), 737-745 (2017).
  2. Trotter, T. N., et al. Adipocyte-Lineage Cells Support Growth and Dissemination of Multiple Myeloma in Bone. The American Journal of Pathology. 186 (11), 3054-3063 (2016).
  3. Morris, E. V., Edwards, C. M. The role of bone marrow adipocytes in bone metastasis. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 121-123 (2016).
  4. Diedrich, J. D., et al. Bone marrow adipocytes promote the Warburg phenotype in metastatic prostate tumors via HIF-1alpha activation. Oncotarget. 7 (40), 64854-64877 (2016).
  5. Chkourko Gusky, H., Diedrich, J., MacDougald, O. A., Podgorski, I. Omentum and bone marrow: how adipocyte-rich organs create tumour microenvironments conducive for metastatic progression. Obesity Reviews. 17 (11), 1015-1029 (2016).
  6. Chen, G. L., et al. High fat diet increases melanoma cell growth in the bone marrow by inducing osteopontin and interleukin 6. Oncotarget. 7 (18), 26653-26669 (2016).
  7. Balaban, S., et al. Adipocyte lipolysis links obesity to breast cancer growth: adipocyte-derived fatty acids drive breast cancer cell proliferation and migration. Cancer & Metabolism. 5, 1(2017).
  8. Huang, C. K., et al. Adipocytes promote malignant growth of breast tumours with monocarboxylate transporter 2 expression via beta-hydroxybutyrate. Nature Communications. 8, 14706(2017).
  9. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI Insight. 2 (4), 87489(2017).
  10. Wang, C., Gao, C., Meng, K., Qiao, H., Wang, Y. Human adipocytes stimulate invasion of breast cancer MCF-7 cells by secreting IGFBP-2. PLoS One. 10 (3), 0119348(2015).
  11. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
  12. Herroon, M. K., et al. Bone marrow adipocytes promote tumor growth in bone via FABP4-dependent mechanisms. Oncotarget. 4 (11), 2108-2123 (2013).
  13. Tabe, Y., et al. Bone Marrow Adipocytes Facilitate Fatty Acid Oxidation Activating AMPK and a Transcriptional Network Supporting Survival of Acute Monocytic Leukemia Cells. Cancer Research. 77 (6), 1453-1464 (2017).
  14. Wen, Y. A., et al. Adipocytes activate mitochondrial fatty acid oxidation and autophagy to promote tumor growth in colon cancer. Cell Death & Differentiation. 8 (2), 2593(2017).
  15. Liu, Z., et al. Mature adipocytes in bone marrow protect myeloma cells against chemotherapy through autophagy activation. Oncotarget. 6 (33), 34329-34341 (2015).
  16. Ye, H., et al. Leukemic Stem Cells Evade Chemotherapy by Metabolic Adaptation to an Adipose Tissue Niche. Cell Stem Cell. 19 (1), 23-37 (2016).
  17. Templeton, Z. S., et al. Breast Cancer Cell Colonization of the Human Bone Marrow Adipose Tissue Niche. Neoplasia. 17 (12), 849-861 (2015).
  18. Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
  19. Emont, M. P., et al. Using a 3D Culture System to Differentiate Visceral Adipocytes In Vitro. Endocrinology. 156 (12), 4761-4768 (2015).
  20. Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
  21. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  22. Herroon, M. K., Diedrich, J. D., Podgorski, I. New 3D-Culture Approaches to Study Interactions of Bone Marrow Adipocytes with Metastatic Prostate Cancer Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 84(2016).
  23. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Laboratory Investigation. 93 (5), 528-542 (2013).
  24. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  25. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  26. Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
  27. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  28. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  29. Zipori, D., Toledo, J., von der Mark, K. Phenotypic heterogeneity among stromal cell lines from mouse bone marrow disclosed in their extracellular matrix composition and interactions with normal and leukemic cells. Blood. 66 (2), 447-455 (1985).
  30. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).
  31. Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. Journal of Visualized Experiments. (132), e56850(2018).
  32. Bozec, A., Hannemann, N. Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis. Journal of Visualized Experiments. (112), e53822(2016).
  33. Shafat, M. S., et al. Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment. Blood. 129 (10), 1320-1332 (2017).
  34. Gazi, E., et al. Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy. The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).
  35. Brown, M. D., et al. Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer. British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).
  36. Hardaway, A. L., Herroon, M. K., Rajagurubandara, E., Podgorski, I. Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer. Clinical & Experimental Metastasis. 32 (4), 353-368 (2015).
  37. Aebi, M. Spinal metastasis in the elderly. European Spine Journal. 12, Suppl 2 202-213 (2003).
  38. Wagner, M., Bjerkvig, R., Wiig, H., Dudley, A. C. Loss of adipocyte specification and necrosis augment tumor-associated inflammation. Adipocyte. 2 (3), 176-183 (2013).
  39. Bochet, L., et al. Cancer-associated adipocytes promotes breast tumor radioresistance. Biochemical and Biophysical Research Communications. 411 (1), 102-106 (2011).
  40. Hirano, T., et al. Enhancement of adipogenesis induction by conditioned media obtained from cancer cells. Cancer Letters. 268 (2), 286-294 (2008).
  41. Gordeev, A. A., Chetverina, H. V., Chetverin, A. B. Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures. Biotechniques. 52 (5), 325-331 (2012).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Células de melanomacocultivo en Transwellmedio condicionadodiferenciación adipogénicatinción con Oil Red OPCR cuantitativatransducción de señales celularesmetástasis óseacomunicación celular
Efectos duales de factores derivados de células de Melanoma en la diferenciación de adipocitos de médula ósea
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.