Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Summary

Aquí, mostramos el proceso de crear una línea de pez cebra de reportero de tensión eléctrica celular para visualizar el desarrollo embrionario, movimiento, y las células de tumor de peces en vivo.

Abstract

Bioelectricidad, señalización eléctrica endógena mediada por canales iónicos y bombas situadas en la membrana celular, juega un papel importante en la señalización de los procesos de las células neuronales y musculares excitables y muchos otros procesos biológicos, tales como embrionarias patrones del desarrollo. Sin embargo, es necesario para en vivo monitoreo de la actividad eléctrica en la embriogénesis vertebrados. Los avances de los indicadores de voltaje fluorescente genéticamente codificados (GEVIs) han hecho posible dar una solución para este desafío. Aquí, describimos cómo crear un indicador de voltaje transgénicos pez cebra utilizando el indicador de tensión establecido, ASAP1 (acelerado Sensor de potenciales de acción 1), por ejemplo. El kit de Tol2 y un promotor de pez cebra ubicuo, ubi, fueron escogidos en este estudio. También explicamos los procesos de clonación de puerta de enlace específica, Tol2 pez cebra basada en transposon transgénesis y el proceso de proyección de imagen de incipiente peces peces y embriones los tumores utilizando microscopios regulares epifluorescente. Usando esta línea de peces, encontramos que hay cambios de voltaje eléctrico celular durante la embriogénesis de pez cebra y movimiento de larvas de peces. Además, se observó que en unos tumores de la vaina del nervio periférico maligno de pez cebra, el tumor de células generalmente fueron polarizadas en comparación con los tejidos normales circundantes.

Introduction

Bioelectricidad se refiere a señalización eléctrica endógena mediada por canales iónicos y bombas situadas en la membrana de la célula¹. Intercambio iónico a través de la membrana celular y el acoplado cambios actuales y potenciales eléctricos, es esencial para la señalización de los procesos de las células neuronales y musculares excitables. Además, la bioelectricidad y los gradientes de iones tienen una variedad de otras funciones biológicas importantes como almacenamiento de energía, biosíntesis y transporte de metabolitos. Señalización bioeléctrica también fue descubierto como un regulador de la formación embrionaria, como ejes del cuerpo, el ciclo celular y diferenciación de células¹. Por lo tanto, es fundamental para la comprensión de muchas enfermedades congénitas humanas que resultan de la mala regulación de este tipo de señalización. Aunque abrazadera del remiendo ha sido ampliamente utilizada para la grabación de las células, está todavía lejos de ser ideal para el control simultáneo de múltiples células durante el desarrollo embrionario en vivo. Además, moléculas pequeñas sensibles de tensión no son también ideales para aplicaciones en vivo debido a su toxicidad, especificidades y sensibilidades.

La creación de una variedad de genéticamente codificado voltaje fluorescente indicadores (GEVIs) ofrece un nuevo mecanismo para resolver este problema y permite la fácil aplicación para el estudio de desarrollo embrionario, a pesar de que originalmente estaban destinados para el control neural células de^2,3. Uno de los GEVIs actualmente disponibles es el Sensor acelerado de potenciales de acción 1 (ASAP1)⁴. Se compone de un lazo extracelular de un dominio de detección de tensión de voltaje sensibles fosfatasa y una proteína fluorescente verde permutada circularmente. Por lo tanto, ASAP1 permite la visualización de los cambios de potencial eléctricos celulares (polarización: verde brillante, despolarización: verde oscuro). ASAP1 tiene 2 ms on y off cinética y puede realizar un seguimiento de cambio potencial subliminal⁴. Así, esta herramienta genética permite un nuevo nivel de eficacia en bioeléctrica de la supervisión en tiempo real en células vivas. Mayor comprensión de los roles de la bioelectricidad en muchas enfermedades humanas, como el cáncer y el desarrollo embrionario se arroja nueva luz sobre los mecanismos subyacentes, que es fundamental para la prevención y tratamiento de la enfermedad.

Pez cebra se ha demostrado un potente modelo animal para estudiar la biología del desarrollo y enfermedades humanas incluyendo cáncer^5,6. Comparten el 70% orthologous genes con los seres humanos, y tienen Biología vertebrado similar⁷. Pez cebra proporcionan cuidado relativamente fácil, un tamaño grande de huevos, manejable genética, transgénesis fácil y desarrollo embrionario externo transparente, que las hacen un sistema superior en vivo imagen^5,6. Con una fuente grande de líneas de peces mutantes ya presentes y un genoma completamente secuenciado, pez cebra ofrecerá una gama relativamente ilimitada de los descubrimientos científicos.

Para investigar la en vivo en tiempo real actividad eléctrica de las células, aprovechamos el sistema de modelo de pez cebra y ASAP1. En este papel, describimos cómo incorporar el biosensor fluorescente tensión ASAP1 en el genoma del pez cebra con Tol2 transposon transgénesis y visualizar actividad eléctrica celular durante el desarrollo embrionario, larval de peces movimiento y el tumor vivo .

Protocol

El pez cebra se encuentran en un centro de animales aprobados por AAALAC, y todos los experimentos se llevaron a cabo según los protocolos aprobados por el cuidado de animales de Purdue y uso Comité (PACUC).

1. Tol2 Transposon plásmido construcción preparación

Nota: Tol2, un transposón que fue descubierto en los peces medaka, ha sido ampliamente utilizado en el pez cebra investigación comunidad^8,9. Ha sido con éxito adoptado al puerta de enlace específica basada en la recombinación sistema de clonación y conocido como el kit de Tol2¹⁰. El kit de Tol2 permite de una manera más conveniente de crear construcciones modificadas para requisitos particulares de expresión, aumentando también la eficiencia de la transgénesis. Así, fue una decisión fácil de tomar ventaja de este sistema y crear una línea de pez cebra de expresión de ASAP1 ubicua utilizando un promotor ubiquitina de validado a ASAP1¹¹.

1. Crear una entrada medio ASAP1 construcción: pDONR221-ASAP1
   1. Adquirir el concepto de sensor ASAP1 voltaje genéticamente codificado, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plásmido #52519), de Addgene. Para amplificar la región de la codificación de ASAP1, configurar una PCR utilizando los cebadores modificado para requisitos particulares (attB1-ASAP1F y attB2-ASAP1R) flanqueados por secuencias attB en el extremo 5' de los cebadores (figura 1). Polimerasa de la DNA de Phusion fue elegida por su alta eficiencia y las condiciones PCR fueron optimizadas basados en el protocolo previamente publicados¹².
   2. Cargar los productos de PCR de 50 μL en un 1% TAE de gel utilizando una pipeta regular con puntas μl 200 y realizar la electroforesis a 160 V en un tanque horizontal gel durante unos 30 minutos.
   3. Compruebe el gel en un transiluminador UV (353 nm), impuesto especial a la banda deseada con un cuchilla/bisturí bajo un transiluminador UV previamente publicados^13,14y puso la muestra de ADN que contienen gel en una microcentrífuga de 1.5 mL limpia tubo.
   4. Realizar la purificación del gel para los productos de PCR ASAP1. Recuperar el ADN en el gel suprimido usando un kit de purificación de gel de ADN comercial siguiendo las instrucciones del fabricante y eluir el ADN en 20 μl de agua. Toma 1 μl como una muestra y medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro. Flujo de las instrucciones de software usando agua como blanco control¹⁵.
   5. Tome 100 ng de purificado producto de PCR y se mezcla con 150 ng de plásmido pDONR221 en 10 μl de TE (10 mM Tris, pH de EDTA 1 mM 8.0)¹⁶del almacenador intermediario. Añadir 2 μl de BP Clonase II en la reacción e incubar la reacción a temperatura ambiente durante la noche.
   6. En el segundo día, añadir 1 μl de proteinasa K en la reacción e incubar la reacción a 37 ° C durante 30 minutos.
   7. Realizar la transformación. Transferencia de la reacción y mezclar con 50 μl de Top10 competentes de e. coli las células e incubar las células en hielo durante 30 minutos. Luego, cambiar el tubo de reacción en un baño de agua de 42 ° C durante 1 minuto, inmediatamente retire el tubo e incubar en hielo durante 2 minutos. A continuación, poner el tubo en una coctelera de 37 ° C e incubar durante 1 h.
   8. Sacar el tubo y la placa de las células en una placa de LB de la kanamicina. A continuación, incubar la placa durante la noche (16-18 h) a 37 ° C.
   9. Seleccionar colonias individuales y bien separadas y sembrar en tubos de cultivo celular de 14 mL con 3 mL de medio LB. Cultura les durante la noche a 37 ° C en un agitador con una velocidad de rotación de 250 rpm (rotación por minuto).
   10. Realizar utilizando un kit comercial miniprep siguiendo su manual de instrucción¹⁷de miniprep.
   11. Secuencia 3-4 plásmidos con Sanger secuenciación para identificar positiva pDONR221-ASAP1 reproduce con primers de secuencia M13F y M13R.
2. Creación de la construcción de Tol2 para microinyección: pDestTol2 -ubi-ASAP1
   1. Elegir que la secuencia medida verificada pDONR221 ASAP1 clon su concentración de ADN utilizando un siguiente espectrofotómetro la instrucción de software usando el agua como un espacio en blanco de control¹⁵.
   2. Tomar 100 μg de pDONR221-ASAP1 y se mezcla con 100 μg de plásmido de Tol2 kit 5-final (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 μg de p3E-polyA (Tol2 kit #302) y 150 μg de pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Ajustar el volumen total a 8 μl utilizando tampón TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) en una microcentrífuga de 1.5 mL tubo y mezcle bien por un vórtice breve de 2-5 s. Luego, añadir 2 μl de LR Clonase II plus e incubar la reacción a temperatura ambiente durante la noche.
   3. En el segundo día, añadir 1 μl de proteinasa K en la reacción con una pipeta μl 10 e incubar la reacción a 37 ° C durante 30 minutos.
   4. Realizar transformación e identificar clones positivos como se describió anteriormente (medidas 1.1.7-11).
   5. Medida de la concentración de DNA de secuencia había verificada clon pDestTol2-ubi-ASAP1 (figura 1B) utilizando un espectrofotómetro¹⁵. La concentración es generalmente alrededor de 200ng/μl.

2. preparar Tol2 transposasa mRNA y solución inyectable

1. Raya e. coli glicerol stock de plásmido pCS2FA transposasa (Tol2 kit #396) sobre una placa de LB (con ampicilina 100 en μg/mL) usando un asa de inoculación esterilizada. Incubar la placa a 37 ° C en una incubadora durante una noche. Al día siguiente, elige una sola Colonia e inocular él en 3 mL de LB (ampicilina 100 μg/mL) utilizando una pipeta esterilizada de 10 μl. Cultura de la noche a 37 ° C en un agitador con una velocidad de rotación de 250 rpm.
2. Realizar miniprep en la cultura de e. coli utilizando un kit comercial miniprep siguiendo su manual de instrucciones. Eluir el ADN plásmido en 30-50 μl de tampón TE por 1 minuto centrifugar a 14.000 rpm y medir su concentración de ADN con un espectrofotómetro.
3. Alinear 1-2 μg de plásmido no i endonucleasa y purificar el ADN con ADN kit no me después con su manual de instrucciones de limpieza la digestión. Eluir el ADN en 5 μl de agua por centrifugación a 14.000 rpm durante 1 minuto. La concentración esperada es de 200-300 ng/μl.
4. Realizar la transcripción en vitro con no linealizado transposasa pCS2FA como una plantilla de ADN utilizando un kit comercial de transcripción SP6.
5. Una vez terminada la reacción, purificar Tol2 transposasa mRNA usando una limpieza de RNA comercial kit siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, procederá a la elución mRNA en 20 μl de agua libre de ARNasa y medir la concentración de RNA en un espectrofotómetro. La concentración esperada es de 1-3 μg / μl. las muestras se pueden almacenar en un congelador de-80 ° C si es necesario.
6. Preparar la solución de microinyección mezclando 20 ng/μl pDestTol2 -ubi-ASAP1 y Tol2 transposasa mRNA (100 ng/μL) en un tubo de microcentrífuga mediante pipeteo. Para evitar la degradación de ácidos nucleicos por descongelación repetida y recongelamiento, alícuotas 6 μl por tubo y guardarlo en un congelador de-80 ° C para su uso futuro.

3. microinyección

1. Set 4-6 tanques de cría con al menos 2 machos y 2 hembras la tarde antes de la inyección. Estos peces no deben ser alimentados por la tarde. Este paso será reducir la cantidad de residuos de pescado y ahorrar tiempo a limpiar por la mañana, mientras que también ayuda a inducir una respuesta de mejoramiento.
2. A la mañana siguiente, retire la solución de la inyección preparada (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construir y mRNA de Tol2) del congelador de-80 ° C y coloque en hielo.
3. Tire los divisores en el pescado tanques de cría y permitir a los peces para aparearse. En general, peces ponen huevos a 20-30 minutos después de sacar el divisor. Si no, espere 1-2 horas más. Algunos peces en absoluto no pueden poner huevos. En este caso, repite este experimento para colección de embriones de peces.
4. Mientras espera, asegúrese de que hay agujas con la punta rota en un ángulo que crea un borde biselado con fórceps, o rompiendo en un limpiador de tarea delicada.
   1. Tire las agujas de vidrio capilar en un extractor de micropipeta utilizando los siguientes parámetros: calor 545; Tire de 60; velocidad 80; tiempo 250; presión de 500. Romper la aguja con pinzas por debajo de un alcance de disección (con ocular de regla para la estimación del diámetro) manteniendo el fórceps en un ángulo de aproximadamente 45 °. Diámetros de deseada de la aguja pueden ser variable dependiendo de la configuración microinyector, pero menor diámetro es preferible para reducir la mortalidad del embrión.
5. Una vez que los peces han puesto huevos, recoger en un diámetro de 10 cm plato de Petri y llevarlos al alcance de la disección. Quitar todos los embriones anormales y desechos de pescado.
6. Pipeta de molde los embriones fertilizados en la inyección de preparados de agarosa al 3%. Eliminar el exceso de agua para ayudar a mantener los embriones en el lugar.
7. Una vez que todas las filas están llenas de embriones viables, disponerlos de modo que las células todas hacia la misma dirección hacia la aguja, que es aproximadamente un ángulo de 45° horizontal. Esto facilitará la inyección mucho más tarde.
8. Usando guantes, utilizar una pipeta de carga μl 20 punta y 5 μl de la construcción dispuesta retirar el tubo en hielo.
9. Inserte cuidadosamente la punta en el extremo posterior del tubo capilar roto hasta donde comienza a tapper, para obtener el reactivo tan cerca de la punta. Si quedan burbujas de aire, agitar la aguja, asegurándose de no romper la punta.
10. Inserte la aguja en el portaagujas de microinyección y apriete con cuidado hasta que la aguja permanece en su lugar. Ajuste el ángulo de 45 °.
11. Una vez que la aguja está preparada y conectada, encienda el microscopio y gas tanque de presión. Comercial CO₂ tanques son generalmente buenos para este propósito. El volumen de inyección se ajusta por la presión de sujeción y eyección: aproximadamente 0,5 psi para la tenencia y 30 psi para expulsión. Asegúrese de comprobar que la solución se sale cuando se presiona el pedal.
12. Usando un micrómetro con una gota de aceite mineral, ajustar el volumen y el flujo de la solución de ~ 150 μm de diámetro (aprox. 2 nL). Asegúrese de que la contrapresión dejó una pequeña cantidad gotear de la aguja. Si no hay suficiente presión, acción capilar produce un líquido entrar en la aguja y destruir el mRNA.
13. Una vez que se calibra la aguja, comenzar a inyectar la construcción dentro de la célula de los embriones fecundados.
    Nota: Esto tiene una gran cantidad de práctica, paciencia y delicadeza, debido a la membrana de la célula es difícil de perforar. Es importante inyectar la solución en la celda, no la yema, para la generación de pez cebra transgénico. Esto es diferente de la inyección de morfolino. No importa qué lado la aguja entra en la célula, siempre y cuando la construcción va en la celda. La transgénesis tendrá una muy baja tasa de éxito si se inyecta en la yema de huevo en lugar de la célula. Inyección fase unicelular también es importante, o pez quimera somática se creará. Esto reducirá la posibilidad de que el transgén entrar a las células de germen.
14. Utilice el borde de la ranura de gel para proporcionar un soporte que mantiene al embrión en su lugar y permite que la aguja aplicando presión sin mover el embrión. Una vez que la punta de la aguja está en la célula, presione el pedal para liberar la cantidad deseada de solución. Repita este proceso para todos los embriones.
15. Terminada, transferir los embriones inyectados en una placa etiqueta de enjuague de la muesca de la agarosa con agua de sistema de pescado y una pipeta de transferencia desechable mL 3,4. Almacenar los embriones en una incubadora de 28,5 ° C, que les permita desarrollar. Compruebe detrás durante todo el día eliminando embriones de peces muertos y reemplazar agua con azul de metileno 0.1% en agua de pescado.
16. Alrededor de 6-8 horas después de la inyección, tome 10 inyectado embriones de peces y preparar la DNA de genomic de ellos usando el método de Hotshot¹⁸.
17. A la mañana siguiente, usar un microscopio de disección con una fuente de luz de fluorescencia para clasificar los embriones que GFP en los tejidos de la yema no. Estos embriones de peces deben contener la construcción inyectada.
18. Realizar el ensayo de Tol2 impuestos especiales para comprobar la actividad del transposon como se describió anteriormente¹⁹. Si suprimido plásmido puede ser detectada, mantener la inyección embriones de peces y criarlos. Si no suprimido plásmido puede ser detectada, repita el proceso de síntesis y microinyección de Tol2 mRNA hasta lograr los resultados positivos del ensayo Tol2 impuestos especiales.

4. establecer peces transgénicos ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)

1. Levantar los peces inyectados (generación de F₀ ) a la edad adulta como se describió anteriormente en el pez cebra libro²⁰. Esto generalmente toma alrededor de 4 meses.
2. Tomar un solo adultos F₀ peces y cruzarlo con un sencillo frente a peces de tipo salvaje del género. Recolectar embriones de peces después de criar durante el día. Mantener los embriones de peces recogidos en la incubadora de 28,5 ° C en los peces del agua con azul de metileno 0,1%.
3. En el tercer día, revise los embriones de peces por debajo de un microscopio de disección fluorescente con un filtro GFP. Clasificar embriones de peces verdes, si hay alguna y elevarlas a la edad adulta como peces transgénicos generación de F₁ , Tg (ubi: ASAP1).
   Nota: Proporción mendeliana no se espera ya que la mayoría de los padres F₀ peces es quimeras genética de línea germinal.
4. Cruz sola F₁ adultos peces con peces tipo salvaje y recolectar embriones de peces. Clasificar los embriones verde peces y criarlos hasta la edad adulta como de los pescados generación F₂ .
   Nota: Verde y no verde peces embriones debe cerca de 1:1 si hay un solo transgen.
5. Para ver los cambios de potencial eléctricos en tumor como tumores de la vaina del maligno del nervio periférico (MPNST), cruzar la generación de₂ F Tg (ubi: ASAP1) pescado con pescado rpl35^hi258/wt . Es conocido que los tumores visibles comienzan a encontrarse en el 6-8 meses adultos^21,22.

5. la proyección de imagen

1. Imagen de embriones de pez cebra, tomar a múltiples fundador de generación de₂ F pescados y cruzarlos con los pescados de tipo salvaje en pares individuales. Recoger peces embriones en diferentes etapas de desarrollo deseadas según el pez cebra escenificando guía²³.
2. Para las primeras etapas de embriones de peces, pelar y quitar chorions de los embriones cuidadosamente con un par de fórceps bajo una disección en un diámetro de 10 cm placa de Petri con agua de sistema de pescado.
3. Transferencia de unos embriones de peces en un portaobjetos de vidrio cóncava con 3% de metilcelulosa con una pipeta de transferencia desechable 3,4 mL. Ajustar los embriones a la posición deseada para ver la actividad celular de la GFP utilizando una aguja por debajo de un alcance de disección fluorescente.
4. Para las etapas móviles de embriones de peces (más de la 12 etapa del somite), uso de mesilato de metanosulfonato de 0.05% para anestesiar los embriones de peces antes de transferirlas a las diapositivas. Brevemente, embriones de peces fueron emergió en mesilato de metanosulfonato de 0.05% en agua de pescado hasta que dejaron de natación y equilibrio del cuerpo de la pérdida. También, agregar una gota de mesilato de metanosulfonato de 0,05% con la metilcelulosa en la diapositiva.
5. Menos de 12 embriones del pescado de la etapa del somite, usar un microscopio de epi-fluorescencia compuesto con una cámara compatible y un software para la proyección de imagen. Para mayores de 12 embriones en fase de somite pescado, usar un microscopio de disección de fluorescencia.
6. Voltaje de la célula de tumor de la imagen, primero identificar los peces con tumores MPNST. Entonces, anestesiar el pez con mesilato de metanosulfonato de 0.05%. Para el montaje de toda la proyección de imagen, poner el pescado en un diámetro de 10 cm plato de Petri. Para ver la actividad eléctrica de la célula tumoral, tumores de pescado pueden diseca después Monte toda la proyección de imagen.

Results

En una inyección exitosa, más que embriones de pescado 50% inyectado mostrará cierta fluorescencia verde en las células somáticas, y la mayoría de ellos será positiva por análisis de impuestos sobre el consumo de transposon de Tol2 (figura 2). Después de 2-4 generaciones de hacia fuera-Cruz con peces de tipo salvaje (hasta que los peces fluorescentes alcanzan 50%, la proporción mendeliana esperada), los peces transgénicos se utilizaron para el experimento de ...

Discussion

Aunque las actividades eléctricas nivel celular y tejidos durante el desarrollo embrionario y la enfermedad humana fueron descubiertas hace mucho tiempo, los en vivo eléctrica cambios dinámicos y sus papeles biológicos siguen siendo en gran parte desconocidos. Uno de los mayores retos es visualizar y cuantificar los cambios eléctricos. Tecnología de abrazadera del remiendo es una brecha para el seguimiento de las células, pero su aplicación en embriones vertebrados es limitada porque se componen de muchas célula...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de cultivo celular de 14 ml	VWR	60818-725 Cultivo de	E.Coli
Tanque de electroforesis de agarosa	Thermo Scientific	Owl B2	DNA eletroporesis
Agarosa RA	Amresco	N605-500G	Para la fabricación de los geles inyectables
Attb1-ASAP1-F imprimación	IDT DNA	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	Amplificación de la región codificante ASAP1 para la subclonación
Attb2-ASAP1-R cebador	IDT DNA	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA	Amplificación de la región codificante ASAP1 para la subclonación
Visor de disección de campo claro	Nikon	SMZ 745	Decorionación, microinyección, montaje
Cámara a color	Zeiss	AxioCam MRc	Embrión de pez Grabación de imágenes
Corredera cóncava	VWR	48336-001	Para sujetar embriones de peces durante el proceso de adquisición de imágenes
Pipeta de transferencia desechable 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	Embriones de peces y transferencia de agua
Enzima endonucleasa, no I	NEB	R0189L	Para linealizar el ADN plasmídico
Osciloscopio compuesto epifuorescente	Zeiss	Axio Imager.A2	Peces Imagen de embriones
Epifuorescente Estereoscópica de disección	Zeiss	Stereo Discovery.V12	Imagen de embriones de peces
Fuente de luz fluorescente	Dinámica de lúmenes	X-cite seris 120 Fuente de	luz para microscopios de fluorescencia
Pinzas #5	WPI	500342	Decorionación y rotura de agujas
Gateway BP Clonasa II Mezcla de enzimas	Thermo Scientific	11789020	Clonación por recombinación de Gateway BP
Gateway LR Clonasa II Plus	enzima Thermo Scientific	12538120	Clonación por recombinación Gateway LR Kit de recuperación de
ADN en gel Zymo	Research	D4002	Purificación en gel de ADN
Punta de carga	Eppendorf	930001007	Para cargar solución inyectable en agujas capilares
Metilcelulosa (1600cPs)	Alfa Aesar	43146	Montaje de embriones de pez
Azul de metileno	Sigma-Aldrich	M9140	Suprime los brotes de hongos en placas de Petri
microinyección	Herramientas de ciencia adaptativa	TU-1	Para preparar bandeja de molde agaorse para sujetar embriones de peces durante la inyección
Microinyector	WPI	Picopump neumático PV820	Inyector de microinyección
Micro-manipulador	WPI	Microinyector MM3301R	Operación
microinyección Extractor de micropipetas	Instrumento	Sutter P-1000	Para la preparación de aguja capilar
Aceite mineral	Amresco	J217-500ml	Para calibrar el volumen de inyección
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripción	Thermo Scientific	AM1340	Transcripción in vitro de ARNm
Cámara monocolor	Zeiss	AxioCam MRm	Grabación de imágenes de embriones de peces
Kit de minipreparación de plásmidos	Zymo Research	D4020	Prepare una pequeña cantidad de ADN plasmídico
Placas de Petri de plástico	VWR	25384-088	Para sujetar peces o embriones de peces durante el proceso de adquisición de imágenes
RNA Clean & Concentrador-5	Zymo Research	R1015	Limpieza de ARNm después de la transcripción in vitro
Espectrofotómetro	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Para la medición de concentraciones de ADN y ARN
Micrómetro de etapa	Am Scope	MR100	Calibración de volumen de microinyección
Termociclador	Bio-Rad	T100	amplificación de ADN para la clonación de genes
Pared delgada capilares de vidrio	WPI	TW100F-4	Vidrio en bruto para la fabricación de aguja cappilar
Tol2-exL1 cebador	IDT DNA	GCACAACACCAGAAATGCCCTC
Tol2 cebador Tol2-exR	IDT DNA	ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG	Tol2 ensayo de impuestos especiales
TOP10 E. coli químicamente competente	Thermo Scientific		C404006 Se utiliza para la transformación durante la clonación de genes
Mesilato de tricaína	Sigma-Aldrich	A5040	Para anestesiar peces o embriones de peces
Transiluminador UV 302nm	UVP	M-20V Visualización de	ADN
Baño de agua	Thermo Scientific	2853	Para el proceso de transformación de la clonación de genes