Aquí, mostramos el proceso de crear una línea de pez cebra de reportero de tensión eléctrica celular para visualizar el desarrollo embrionario, movimiento, y las células de tumor de peces en vivo.
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Artículo de método
Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores
En este artículo
Resumen
Resumen
Bioelectricidad, señalización eléctrica endógena mediada por canales iónicos y bombas situadas en la membrana celular, juega un papel importante en la señalización de los procesos de las células neuronales y musculares excitables y muchos otros procesos biológicos, tales como embrionarias patrones del desarrollo. Sin embargo, es necesario para en vivo monitoreo de la actividad eléctrica en la embriogénesis vertebrados. Los avances de los indicadores de voltaje fluorescente genéticamente codificados (GEVIs) han hecho posible dar una solución para este desafío. Aquí, describimos cómo crear un indicador de voltaje transgénicos pez cebra utilizando el indicador de tensión establecido, ASAP1 (acelerado Sensor de potenciales de acción 1), por ejemplo. El kit de Tol2 y un promotor de pez cebra ubicuo, ubi, fueron escogidos en este estudio. También explicamos los procesos de clonación de puerta de enlace específica, Tol2 pez cebra basada en transposon transgénesis y el proceso de proyección de imagen de incipiente peces peces y embriones los tumores utilizando microscopios regulares epifluorescente. Usando esta línea de peces, encontramos que hay cambios de voltaje eléctrico celular durante la embriogénesis de pez cebra y movimiento de larvas de peces. Además, se observó que en unos tumores de la vaina del nervio periférico maligno de pez cebra, el tumor de células generalmente fueron polarizadas en comparación con los tejidos normales circundantes.
Introducción
Bioelectricidad se refiere a señalización eléctrica endógena mediada por canales iónicos y bombas situadas en la membrana de la célula1. Intercambio iónico a través de la membrana celular y el acoplado cambios actuales y potenciales eléctricos, es esencial para la señalización de los procesos de las células neuronales y musculares excitables. Además, la bioelectricidad y los gradientes de iones tienen una variedad de otras funciones biológicas importantes como almacenamiento de energía, biosíntesis y transporte de metabolitos. Señalización bioeléctrica también fue descubierto como un regulador de la formación embrionaria, como ejes del cuerpo, ....
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Protocolo
El pez cebra se encuentran en un centro de animales aprobados por AAALAC, y todos los experimentos se llevaron a cabo según los protocolos aprobados por el cuidado de animales de Purdue y uso Comité (PACUC).
1. Tol2 Transposon plásmido construcción preparación
Nota: Tol2, un transposón que fue descubierto en los peces medaka, ha sido ampliamente utilizado en el pez cebra investigación comunidad8,9. Ha sido con éxito adoptado al puerta de enlace específica basada en la recombinación sistema de clonación y conocido como el kit de Tol210
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Resultados
En una inyección exitosa, más que embriones de pescado 50% inyectado mostrará cierta fluorescencia verde en las células somáticas, y la mayoría de ellos será positiva por análisis de impuestos sobre el consumo de transposon de Tol2 (figura 2). Después de 2-4 generaciones de hacia fuera-Cruz con peces de tipo salvaje (hasta que los peces fluorescentes alcanzan 50%, la proporción mendeliana esperada), los peces transgénicos se utilizaron para el experimento de .......
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Discusión
Aunque las actividades eléctricas nivel celular y tejidos durante el desarrollo embrionario y la enfermedad humana fueron descubiertas hace mucho tiempo, los en vivo eléctrica cambios dinámicos y sus papeles biológicos siguen siendo en gran parte desconocidos. Uno de los mayores retos es visualizar y cuantificar los cambios eléctricos. Tecnología de abrazadera del remiendo es una brecha para el seguimiento de las células, pero su aplicación en embriones vertebrados es limitada porque se componen de muchas célula.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El trabajo de investigación en esta publicación fue apoyado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número R35GM124913, programa de incentivos de la Universidad de Purdue PI4D y PVM interno competitivo Programa de fondos de investigación básica. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los agentes de financiación. Agradecemos a Koichi Kawakami para la construcción de Tol2, Michael Lin para la construcción de ASAP1, y Leonard Zon para el promotor ubi construir a través de Addgene.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de cultivo celular de 14 ml | VWR | 60818-725 Cultivo de | E.Coli |
| Tanque de electroforesis de agarosa | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletroporesis |
| Agarosa RA | Amresco | N605-500G | Para la fabricación de los geles inyectables |
| Attb1-ASAP1-F imprimación | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA | Amplificación de la región codificante ASAP1 para la subclonación |
| Attb2-ASAP1-R cebador | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA | Amplificación de la región codificante ASAP1 para la subclonación |
| Visor de disección de campo claro | Nikon | SMZ 745 | Decorionación, microinyección, montaje |
| Cámara a color | Zeiss | AxioCam MRc | Embrión de pez Grabación de imágenes |
| Corredera cóncava | VWR | 48336-001 | Para sujetar embriones de peces durante el proceso de adquisición de imágenes |
| Pipeta de transferencia desechable 3,4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Embriones de peces y transferencia de agua |
| Enzima endonucleasa, no I | NEB | R0189L | Para linealizar el ADN plasmídico |
| Osciloscopio compuesto epifuorescente | Zeiss | Axio Imager.A2 | Peces Imagen de embriones |
| Epifuorescente Estereoscópica de disección | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Imagen de embriones de peces |
| Fuente de luz fluorescente | Dinámica de lúmenes | X-cite seris 120 Fuente de | luz para microscopios de fluorescencia |
| Pinzas #5 | WPI | 500342 | Decorionación y rotura de agujas |
| Gateway BP Clonasa II Mezcla de enzimas | Thermo Scientific | 11789020 | Clonación por recombinación de Gateway BP |
| Gateway LR Clonasa II Plus | enzima Thermo Scientific | 12538120 | Clonación por recombinación Gateway LR Kit de recuperación de |
| ADN en gel Zymo | Research | D4002 | Purificación en gel de ADN |
| Punta de carga | Eppendorf | 930001007 | Para cargar solución inyectable en agujas capilares |
| Metilcelulosa (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Montaje de embriones de pez |
| Azul de metileno | Sigma-Aldrich | M9140 | Suprime los brotes de hongos en placas de Petri |
| microinyección | Herramientas de ciencia adaptativa | TU-1 | Para preparar bandeja de molde agaorse para sujetar embriones de peces durante la inyección |
| Microinyector | WPI | Picopump neumático PV820 | Inyector de microinyección |
| Micro-manipulador | WPI | Microinyector MM3301R | Operación |
| microinyección Extractor de micropipetas | Instrumento | Sutter P-1000 | Para la preparación de aguja capilar |
| Aceite mineral | Amresco | J217-500ml | Para calibrar el volumen de inyección |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripción | Thermo Scientific | AM1340 | Transcripción in vitro de ARNm |
| Cámara monocolor | Zeiss | AxioCam MRm | Grabación de imágenes de embriones de peces |
| Kit de minipreparación de plásmidos | Zymo Research | D4020 | Prepare una pequeña cantidad de ADN plasmídico |
| Placas de Petri de plástico | VWR | 25384-088 | Para sujetar peces o embriones de peces durante el proceso de adquisición de imágenes |
| RNA Clean & Concentrador-5 | Zymo Research | R1015 | Limpieza de ARNm después de la transcripción in vitro |
| Espectrofotómetro | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | Para la medición de concentraciones de ADN y ARN |
| Micrómetro de etapa | Am Scope | MR100 | Calibración de volumen de microinyección |
| Termociclador | Bio-Rad | T100 | amplificación de ADN para la clonación de genes |
| Pared delgada capilares de vidrio | WPI | TW100F-4 | Vidrio en bruto para la fabricación de aguja cappilar |
| Tol2-exL1 cebador | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | |
| Tol2 cebador Tol2-exR | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 ensayo de impuestos especiales |
| TOP10 E. coli químicamente competente | Thermo Scientific | C404006 Se utiliza para la transformación durante la clonación de genes | |
| Mesilato de tricaína | Sigma-Aldrich | A5040 | Para anestesiar peces o embriones de peces |
| Transiluminador UV 302nm | UVP | M-20V Visualización de | ADN |
| Baño de agua | Thermo Scientific | 2853 | Para el proceso de transformación de la clonación de genes |
Referencias
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al.
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Reimpresiones y permisos
