El protocolo MPLEx para Multi-omic análisis de muestras de suelo

Resumen

Un protocolo se presenta de forma simultánea extracción de metabolitos, proteínas y lípidos en una muestra de suelo solo, permitiendo tiempos de preparación de muestra reducida y multi-omic análisis de espectrometría de masas de las muestras con cantidades limitadas.

Resumen

Espectrometría de masas (MS)-base metaproteomic integrado, metabolómicos y lipidómicos (multi-omic) estudios están transformando nuestra capacidad de comprender y caracterizar las comunidades microbianas en sistemas ambientales y biológicos. Estas mediciones están permitiendo incluso mejorados análisis de comunidades microbianas de suelo complejas, que son los más complejos sistemas microbianos conocidos hasta la fecha. Análisis multi-omic, sin embargo, tienen problemas de preparación de muestra, puesto que típicamente son necesarias extracciones separadas para cada estudio de omic, así grandemente ampliando el tiempo de preparación y cantidad de muestra necesaria. Para solucionar esta limitación, un 3 en 1 método para la extracción simultánea de metabolitos, proteínas y lípidos (MPLEx) de la misma muestra de suelo fue creado mediante la adaptación de un enfoque basado en solvente. Este protocolo MPLEx ha demostrado para ser sencilla y robusta para muchos tipos de muestras, incluso cuando se utilizan para cantidades limitadas de muestras complejas. El método MPLEx también permitió la medición rápida multi-omic necesaria para obtener una mejor comprensión de los miembros de cada comunidad microbiana, mientras que la evaluación de los cambios ocurridos en las perturbaciones biológicas y ambientales.

Introducción

Evaluación de las comunidades microbianas del suelo tiene importantes implicaciones para la comprensión de carbono bicicleta y el cambio climático. Sin embargo estudios recientes han puesto de manifiesto dificultades, como la falta de los genomas secuenciados de microbiota en varios tipos de suelo y la función desconocida de muchas de las proteínas detectadas. Resultado de estos desafíos debido al suelo que la comunidad microbiana más compleja conocida hasta la fecha^1,2,3. Análisis multi-omic, que combinan los resultados de la metagenómica, metatranscriptomic, metaproteomic, ....

Protocolo

Nota: Suelos muy húmedos pueden ser liofilizados antes de la extracción sin perjuicio de la eficacia de la extracción. Suelo mojado también se puede utilizar pero debe considerarse al agregar reactivos en proporciones específicas.

Nota: Se recomienda usar 20 g de peso de suelo seco por extracción, que debe ser dividida entre los dos tubos de 50 mL (máximo de 10 g de suelo por el tubo de 50 mL). Las extracciones se pueden escalar hacia arriba o abajo dependiendo de la muestra disponible.

Nota: Las muestras de suelo seco pueden ser tamizadas a través de una pantalla de 3 mm con el fin de homogeneizar y eliminar pie....

Resultados

Cuando se utiliza el protocolo MPLEx para extraer moléculas de suelo de pradera nativa de Kansas (un suelo Mollisol), los análisis por triplicado previeron resultados 3376 péptidos, 105 lípidos y 102 metabolitos polares (todas las identificaciones únicas). Mientras que el protocolo MPLEx ha sido bien establecido para la extracción general de lípidos y metabolitos^12,13,14,

Discusión

Es importante tener en cuenta que no todos los laboratorios tendrán el mismo equipo disponible para que ciertos métodos, por ejemplo el paso de lisis, pueden ser adaptados. Aquí utilizamos un vórtex y sonicando, sin embargo el uso de una batidora de grano grande 50 mL funcionaría. Si no encuentra un liofilizador con una temperatura del colector de-105 ° C, las muestras pueden ser secadas bajo una corriente de nitrógeno. También tipos de suelo varían mucho y pueden incluir arena, limo, arcilla, turba y Marga (etc.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
El cloroformo	Sigma-Aldrich	650498	almacenado a -20 grados; C ! Precaución el cloroformo tiene efectos potenciales agudos para la salud, irritación de la piel y posibles quemaduras químicas, irritación del sistema respiratorio, puede afectar los riñones, el hígado, el corazón. Use gafas, ropa y guantes protectores adecuados, trabaje en una campana extractora.
Metanol	Sigma-Aldrich	34860	almacenado a -20 grados; C ! Precaución El metanol puede causar irritación de las vías respiratorias, la piel y los ojos, puede dañar los nervios, los riñones y el hígado. Use gafas, ropa y guantes protectores adecuados, trabaje en una campana extractora.
Agua purificada del	sistema de purificación de agua	Millipore Milli-Q
¡Dodecil sulfato de sodio	Sigma-Aldrich	L6026	! Precaución: El SDS causa toxicidad aguda y es inflamable. Es un irritante de la piel, los ojos y las vías respiratorias. Use guantes y gafas de seguridad.
Kit de extracción de proteínas del suelo	MoBio, NoviPure Kit de extracción de proteínas del suelo, Qiagen	30000-20
DL-dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815
1M Trizma HCL	Sigma-Aldrich	T2694
Ácido tricloroacético	Sigma-Aldrich	T0699	! Precaución El TCA es cáustico, tóxico y puede causar quemaduras en la piel. Use guantes y gafas de seguridad.
acetona	Sigma-Aldrich	650501	almacenado a -20 grados; C ! Precaución: La acetona puede causar irritación de las vías respiratorias, la piel y los ojos. Líquidos y vapores inflamables. Use gafas de seguridad, guantes y una bata de laboratorio, trabaje con una campana extractora.
Urea	Sigma-Aldrich	208884	! Precaución La urea es un irritante para los ojos y la piel, use guantes y gafas de seguridad
Bicarbonato de amonio	Fluka	09830
Tripsina	Promega	V528A	20µ g viales Kit de ensayo de proteínas de
ácido bicinconínico	Pierce	23227
Formiato de amonio	Sigma-Aldrich	09735
Acetonitrilo	Sigma-Aldrich	34998	! Precaución El acetonitrilo es un irritante de la piel y los ojos. Altamente inflamable. Use guantes y gafas de seguridad. Trabaje en una campana extractora.
¡Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	T6508	! Precaución El TFA es extremadamente peligroso en caso de contacto con la piel, contacto con los ojos, ingestión e inhalación. Puede producir daño tisular, particularmente en las membranas mucosas de los ojos, la boca y las vías respiratorias. El contacto con la piel puede producir quemaduras. Use guantes, bata de laboratorio, gafas de seguridad y trabaje con una campana extractora.
Clorhidrato de metoxiamina	Sigma-Aldrich	226904	! Precaución El clorhidrato de metoxiamina causa quemaduras graves y daños graves en los ojos, puede causar sensibilización por contacto con la piel. Use gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio, trabaje con una campana extractora.
¡Piridina	Sigma-Aldrich	270970	! Precaución La piridina puede causar irritación de la piel y los ojos, depresión del sistema nervioso central. El vapor puede provocar un incendio repentino. Use gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio, trabaje con una campana extractora.
N-Metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida con 1% de trimetilclorosilano	Sigma-Aldrich	69478	! Precaución MSTFA + 1% TMCS puede causar corrosión de la piel, daños oculares graves y toxicidad específica en órganos diana. Líquidos y vapores inflamables. Use gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio, trabaje con una campana extractora.
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P9541
Sistema de purificación de agua Milli-Q	Millipore		modelo MPGP04001
Vortex	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Sonda sonicador	FisherBrand		modelo FB505
Centrífuga refrigerada	Eppendorf		modelo 5810R
Tubo de 50mL rotor de cuchara basculante	Eppendorf	A-4-44
50mL rotor de ángulo fijo	Eppendorf	FA-45-6-30
Balance	OHAUS		modelo V22PWE150IT
controlador de pipetas serológicas	Eppendorf	12-654-100
10mL, 25mL pipetas serológicas de vidrio	FisherBrand	13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer con Thermotop	Eppendorf	5382000015, 5308000003
0,9 – 2,0 mm mezcla de perlas de acero inoxidable	NextAdvance	SSB14B
0,15 mm perlas de granate	MoBio	13122-500
Plato agitador magnético	FisherBrand	11-100-16SH
Barra agitadora magnética	FisherBrand	14512130
pH tiras de papel, pH Rango 0– 14	FisherBrand	M95903
15mL, 50mL tubo de centrífuga cónico de polipropileno	Genesee Scientific	21-103 21-108	compatible con cloroformo
50mL accesorio de vórtice	MoBio	13000-V1-50
Cubo de hielo	FisherBrand	02-591-44
viales de vidrio de 27,25x70mm	FisherBrand	03-339-22K
Breathe Membranas de placa más fáciles	Midwest Scientific	BERM-2000
Toallitas con alcohol	Biotech diversificado	BPWP-1000
Incubadora agitadora de calentador	Benchmark, Incu-Shaker Mini
Rotador de tubo analógico	SoCal BioMed, LLC	82422001
Kit de preparación de muestras asistido por filtro	FASP; Expedeon	44250
Lector de microplacas	Biotek, Congelador EPOCH-20
grados Celsius	Fisher Congelador	13986149-80
grados Celsius	Stirling Ultracold	SU78OUE
Q-Exactive espectrómetro de masas con trampa de iones	Thermo Scientific
Agilent 7890A acoplado a un solo cuadrupolo Espectrómetro de masas 5975C	Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo	Thermo Scientific
Sistema NanoEquityTM UPLC de Waters	Millford, MA
Botella de medios de 250 ml	FisherBrand	1395-250
Waters	vial de Waters 186002805
Glass MS vial de muestra e insertos MicroSolv		9502S-WCV, 9502S-02ND
Vidrio Frasco de HPLC y tapones a presión	MicroSolv	9512C-0DCV, 9502C-10C-B
Placa de 96 pocillos de HPLC	Agilent	5042-6454
Frasco de vidrio grande 27.25x70mm	FisherBrand	03-339-22K
Liofilizador	Labconco	7934021
Espátula de cabeza plana de acero inoxidable pulido	Spoonula; Toallitas FisherBrand	14-375-10
Kim	Kimberly-Clark	34721
XBridge C18, 250x4,6 mm, 5 μ M con columna de protección de 4,6x20 mm	Waters	186003117, 186003064
sistema de HPLC de la serie Agilent 1100	Agilent	Technologies G1380-90000
de 1,7 ml	Sorenson	11700
Hamilton jeringas de vidrio, 5 ml, 50 y micro; L y 250µ L	Hamilton	81517, 80975, 81175
Pipetas Pasteur	FisherBrand	13-678-20A
Bombillas de pipeta Pasteur	Sigma-Aldrich	Z111597
baño Sonicator	Branson 1800 Limpiador
Centrífuga de vacío	Labconco Centrivap Sistema concentrador resistente a los
MicroSpin Columnas, C18 Sílice	El Grupo Nido	SEM SS18V