Cuantificar la muerte celular epidérmica en ranas con quitridiomicosis usando dos métodos. En primer lugar, utilizamos terminal transferasa-mediated dUTP nick etiquetado final (TUNEL) en situ histología para determinar las diferencias entre animales clínicamente infectados y no infectados. En segundo lugar, llevamos a cabo un análisis de series temporales de la apoptosis sobre la infección usando un análisis de la proteína caspasa 3/7.
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Artículo de método
Utilizando mediada por la transferasa Terminal dUTP Nick End-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7 ensayos a muerte celular epidérmica, medida en ranas con la quitridiomicosis
En este artículo
Resumen
Resumen
Anfibios están experimentando una gran pérdida de biodiversidad a nivel mundial y una de las principales causas es la quitridiomicosis enfermedad infecciosa. Esta enfermedad es causada por el hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que infecta y afecta epidermis de rana; sin embargo, los cambios patológicos se han no explícitamente caracterizados. Apoptosis (muerte celular programada) puede utilizarse por los patógenos para dañar tejido anfitrión, pero también puede ser un mecanismo de host de resistencia a las enfermedades para la eliminación del patógeno. En este estudio, cuantificar la muerte de las células epidérmicas de los animales infectados y no infectados usando dos análisis diferentes: terminal transferasa-mediated dUTP nick end-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7. Utilizando tejido de piel de muslo y ventral, dorsal, en el ensayo TUNEL, observamos muerte en las células epidérmicas en situ de los animales clínicamente infectados de la célula y comparar la muerte de la célula con los animales no infectados mediante microscopía fluorescente. Para determinar cómo cambian los niveles de apoptosis en la epidermis en el transcurso de la infección extraer muestras de la punta del dedo del pie quincenal durante un período de 8 semanas y utilizar un ensayo de caspasas 3/7 con proteínas extraídas para cuantificar la actividad dentro de las muestras. Entonces correlacionamos actividad de caspasas 3/7 con la carga de la infección. El ensayo TUNEL es útil para la localización de la muerte de la célula en situ, pero es costoso y el tiempo por muestra. El ensayo de caspasas 3/7 es eficaz para tamaños de muestra grandes y tiempo curso de experimentos. Sin embargo, porque las de biopsias punta del dedo del pie de rana son pequeñas hay extracto limitado disponible para estandarización de la muestra a través de métodos de cuantificación de la proteína, tales como el ensayo de Bradford. Por lo tanto, sugerimos estimar el área superficial de la piel a través del análisis fotográfico de las biopsias del dedo del pie para evitar el consumo de los extractos durante la normalización de la muestra.
Introducción
Anfibios están experimentando actualmente una las mayores pérdidas de la biodiversidad global de cualquier taxa vertebrados1. Una de las principales causas de estos descensos son la piel fatal enfermedad chytridiomycosis, causada por el hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. El patógeno infecta superficialmente la epidermis, que puede conducir a la alteración de la función de la piel resultando en pérdida del electrólito grave, paro cardiaco y muerte3. Varios mecanismos inmunes del huésped potencial contra Bd actualmente se están estudiando, tales como péptidos antim....
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Protocolo
Universidad James Cook aprobó ética animal en aplicaciones A1875 para p. corroboree y A1897 y A2171 L. v. alpina.
1. cría de animales y control de
- Animales de la casa individualmente, en un ambiente apropiado para la especie, con un agua apropiada, alimentación y limpieza horario. Revise diariamente los animales.
- Individuos adultos de la críticamente amenazada Pseudophryne corroboree (para el ensayo TUNEL, sección 4) y el amenazado Litoria verreauxii alpina (para el análisis caspasas 3/7, sección 5), donados por cautivo instalaciones de cría. Mantener los animales en 15-18 ° C, sobre un ....
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Resultados
Ensayo TUNEL
Había más células positivas TUNEL en los animales infectados que en los animales control no infectado. La ubicación en situ de TUNEL positiva las células difieren en infectados y controlar animales. En animales control, hubo una distribución uniforme del TUNEL positiva las células a lo largo de la dérmica y epidérmica de la piel capas en niveles bajos (ver figura 1A), .......
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Discusión
Exploramos epidérmico apoptosis y muerte celular como un mecanismo potencial de la patología de la quitridiomicosis enfermedad mortal o un mecanismo de resistencia a enfermedades en especies susceptibles de Bd . Se utilizaron dos métodos de evaluar la muerte celular en la epidermis, ensayo TUNEL en situ análisis de muerte celular epidérmica y caspasas 3/7 análisis para monitoreo de muerte de las células epidérmicas a lo largo de la evolución de la infección. Se encontró que la muerte celular y la apopto.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a las siguientes personas que ayudaron con cría y recogida de datos: Tegtmeier D. C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, Percival S., M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, Harney N. y T. Knavel; y M. Merces ayuda con disecciones. También nos gustaría agradecer a M. McFadden, P. Harlow y Taronga Zoo para aumentar la L. v. alpinay G. Marantelli para levantar los p. corroboree. Agradecemos a F. Pasmans, A. Martel para asesoramiento en ensayos de apoptosis, Constantino C., Kladnik A. y R. Webb ayuda con ensayo TUNEL, y Emeto T. y W. Weßels para ayudan con el protocolo y kit para análisis de caspasas 3/7. Este manuscrito y el protocolo se ha adapt....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Lector de placas luminiscentes | |
| 384 pocillos placa de fondo claro plano | Corning | 3707 | |
| 384 pozo brida baja blanca placa de fondo plano Corning | 3570 | ||
| Agar bacteriológico (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Formal-Fixx Formal-Fixx 10% Neutral Formol tamponado | Fisher 6764254 | ||
| Caldo de lactosa (oxoide) | Fisher | OXCM0137B | |
| Bicarbonato de sodio | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Triptona | Fisher | BP1421-500 | |
| Albúmina sérica bovina | Invitrogen 15561020 | ||
| Hisopo de rayón estéril | Medical Wire & Equipo | MW-113 | |
| ApopTag Red Kit de detección de apoptosis in situ Merck | Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reactivo | Pierce | 23200 | |
| Caspasa Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| Tampón HEPES | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Cloruro de magnesio | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Hidrolizado de gelatina Enzimático | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH 7,2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox blanqueador | Clorox | ||
| Etanol, 200 Prueba, Grado Molecular | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan microscopio fluorescente | Carl Zeiss | Microscopio fluorescente | |
| acero inoxidable | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Diseño individual para cebadores y sonda | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Diseño individual para imprimaciones y sonda | |
| Sonda aglutinante de ranura menor Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Diseño individual para cebadores y sonda | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Máquina qPCR | Qiagen | |
| Tubos de microcentrífuga 1,5 ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Placas de Petri para cultivo celular | Nunc 263991 | ||
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0,5 mm | BioSpec | 11079105Z |
Referencias
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Voyles, J., et al.
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Reimpresiones y permisos
