Tubos capilares del cerebro aislado de tejido de cerebro humano pueden utilizarse como un modelo preclínico para estudiar la función de barrera bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Aquí, presentamos un protocolo optimizado para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano fresco.
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Artículo de método
Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido
En este artículo
Resumen
Resumen
Función de barrera blood - brain de comprensión bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas es crítica para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que tienen la promesa de mejorar la entrega de la droga de cerebro, mejorar la protección del cerebro y tratar el cerebro trastornos. Sin embargo, es difícil estudiar la función humana barrera blood - brain. Así, hay una necesidad crítica de modelos apropiados. En este sentido, los capilares del cerebro aislados de tejido cerebral humano representan una herramienta única para estudiar la función de barrera cerca de la situación humana en vivo como sea posible. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar los tubos capilares del tejido de cerebro humano en un alto rendimiento y con pureza y calidad constante. Los capilares están aislados del tejido de cerebro humano fresco mediante homogeneización mecánica, gradiente de densidad centrifugación y filtración. Después del aislamiento, los capilares del cerebro humano pueden utilizarse para diversas aplicaciones, incluyendo ensayos de fugas, imágenes de células vivas y ensayos inmune para estudiar la expresión de la proteína y función de la actividad enzimática y señalización intracelular. Los capilares del cerebro humano aisladas son un modelo único para aclarar la regulación de la función humana barrera blood - brain. Este modelo puede proporcionar penetraciones en la patogenesia de sistema nervioso central (SNC), que ayudará al desarrollo de estrategias terapéuticas para el tratamiento de trastornos de la CNS.
Introducción
La barrera blood - brain es una interfaz muy controlada entre la sangre y el cerebro que determina lo que entra y sale del cerebro. Anatómicamente, las células endoteliales componen la barrera hemato - encefálica y forman una red continua, compleja. Fisiológicamente, esta red capilar proporciona el cerebro con oxígeno y nutrientes mientras que al mismo tiempo la eliminación de dióxido de carbono y productos metabólicos de desecho. Lo importante, la evidencia apoya que los cambios en la barrera contribuyen a numerosas patologías, como la enfermedad de Alzheimer, epilepsia, accidente cerebrovascular1,2,
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Protocolo
La siguiente información se basa en la seguridad actual y normas reglamentarias de la Universidad de Kentucky, Lexington, KY, Estados Unidos. Como precaución de seguridad, consulte programa de seguridad biológica de la institución y los reglamentos y recomendaciones más actuales antes de trabajar con tejido humano.
PRECAUCIÓN: Tejido humano puede ser una fuente de patógenos transmitidos por la sangre, incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (HCV) y otros. Trabajo con tejido humano plantea el riesgo de infección de patógenos de la sangre. Por lo tanto, ciertas consideracio....
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Resultados
Los aislamientos de tejido de cerebro humano producen una suspensión enriquecida en capilares del cerebro humano (figura 1B) con pequeñas cantidades de recipientes más grandes, células de sangre rojas, otras células y algunos restos de células. Algunos capilares se ramifican, y, en algunos, las células de sangre rojas son atrapadas en los lúmenes capilares. El capilar típico tiene un diámetro de 3 – 7 μm y es aproximadamente de 100-200 μm largo con lúmenes ab.......
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Discusión
El presente Protocolo describe el aislamiento de los capilares del cerebro humano intacto y viable de tejido fresco. En esta sección, discutimos en detalle lo siguiente: 1) modificaciones en el protocolo 2) solución de problemas de errores comunes, 3) limitaciones de la técnica, 4) la importancia del modelo con respecto a los existentes y modelos alternativos barrera blood - brain, y 5). aplicaciones potenciales de los capilares del cerebro humano aislado.
El protocolo descrito aquí está optim.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos y reconocemos el Dr. Peter Nelson y Sonya Anderson en el Banco de tejido cerebral de UK-ADC para proporcionar cerebro humano todas las muestras de tejido (NIH número de concesión: P30 AG028383 del Instituto Nacional sobre el envejecimiento). Agradecemos a Matt Hazzard y Tom Dolan, servicios de tecnología de información, tecnología académica y compromiso de la Facultad, Universidad de Kentucky para asistencia gráfica. Este proyecto fue apoyado por 1R01NS079507 número de subvención del Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular (por B.B.) y grant número 1R01AG039621 del Instituto Nacional sobre el envejecimiento (a A.M.S.H.). E....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo de protección personal (EPP) | |||
| Diamond Grip Plus Guantes de látex, Microflex Medium | VWR, Radnor, PA, EE. UU. | 32916-636 | EPI Batas |
| de laboratorio protectoras desechables | VWR, Radnor, PA, EE. UU | . 470146-214 | EPP; debido a la naturaleza del material de origen humano, se recomienda el uso de una bata de laboratorio desechable |
| Protector facial, desechable | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU | 19460102 | EPP; Debido a la naturaleza del material de origen humano, se recomienda el uso de un protector facial desechable |
| Materiales de seguridad Bolsas | |||
| de autoclave de alta temperatura Clavies 8 x 12 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. | 01-815-6 | |
| Versi Papel de banco seco 18" x 20" | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. | 14-206-32 | para cubrir áreas de trabajo |
| VWR Sharps Container Systems | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU | . 75800-272 | para bisturíes usados |
| Lejía 8.2% Clorox Germicida 64 oz. | Centro de suministros del Reino Unido, Lexington, KY, EE. UU | . 323775 | |
| Equipment | |||
| 4 ° C Refrigerador | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU | . 13-986-148 | |
| Medidor de pH Accume BASIC AB15 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU | . AB15 | |
| Heidolph RZR 2102 Control | Heidolph, Elk Grove Village, IL, EE. UU | . 501-21024-01-3 | |
| Centrífuga Sorvall LEGEND XTR | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU | . 75004521 | |
| Microscopio de disección Leica L2 | Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, EE. UU. | Se utiliza para eliminar las meninges | |
| POLYTRON PT2500 Homogeneizador | Kinematica AG, Lucerna, Suiza | 9158168 | |
| P-403 | Denver Instrument, Bohemia, NY, EE. UU. | 0191392 | |
| Mini agitador estándar | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU | . 1151050 | |
| Termo-Frascos de nitrógeno líquido Dewar | Thermal Scientific, Mansfiled, TX, EE. UU | 11-670-4C | utilizado para congelar el tejido? |
| Balanza analítica Voyager Pro | OHAUS, Parsippany, Nueva Jersey, EE. UU. | VP214CN | |
| Microscopio ZEISS Axiovert | Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, EE. UU. | se utiliza para comprobar capilares aislados | |
| fuerte | |||
| Finnpipette II Pipeta 1-5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU | . 21377823T1 | lavar los capilares filtro |
| Finnpipette II Pipeta 100-1.000 µ L | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU | . 21377821T1 | pellet de resuspensión en BSA |
| Pipet Boy | Integra, Hudson, NH, EE. UU. | ||
| 50 mL Tubos Falcon 25/rack - 500/cs | VWR, Radnor, PA, EE. UU | . 21008-951 | |
| Hojas de bisturí EISCO | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU | . S95938C | para picar tejido cerebral |
| PARAFILM | VWR, Radnor, PA, EE. UU | . 52858-000 | para cubrir vaso de precipitados y matraz aforado |
| Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. | 21-377-304 | para lavar los capilares del filtro |
| Jeringa de 60 mL con Luer-Lok | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU | . BD309653 | utiliza con anillo conector para filtrar capilares |
| Mango de bisturí #4 | Fine Science Tools, Foster City, CA, EE. UU. | 10060-13 | utilizado para picar |
| Pinzas Dumont #5 | Fine Science Tools, Foster City, CA, EE. UU | . 11251-10 | utilizado para eliminar meninges |
| Potter-Elvehjem Amoladora de tejidos | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, EE. UU | 3431E25 | 50 mL volumen, espacio libre: 150-230 μ m |
| Homogeneizador Dounce | VWR, Radnor PA USA | 62400-642 | 15 mL volumen, holgura: 80-130 μ m |
| Filtros tejidos Spectra/Mesh (300 µ m) | Spectrum Laboratories, Rancho Domínguez, CA, EE.UU. | 146424 | Se utiliza para filtrar la suspensión capilar para eliminar cualquier meninge que pueda quedar |
| en los filtros (tamaño de poro: 30 y micro; m) | pluriSelect Life Science, Leipzig, Alemania | 43-50030-03 | |
| Anillo conector | pluriSelect Life Science, Leipzig, Alemania | 41-50000-03 | reutilización múltiple |
| aforado | para la preparación de tampón de aislamiento | ||
| Vaso de precipitados | para la preparación de barra | ||
| de agitación BSA al 1%para la preparación de 1% BSA y Ficoll® | |||
| Schott Frasco (60 mL) | para la preparación de Ficoll® | ||
| Cubitera | para mantener todo frío | ||
| Petri de 100 mm | para picar tejido cerebral | ||
| Raspador de células de cultivo de tejidos | VWR, Radnor, PA, EE. UU | . 89260-222 | para eliminar el sobrenadante después de la centrifugación |
| químicos | |||
| BSA Fracción V, A-9647 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | A9647-500g | preparar en DPBS con Ca2 + < / sup> & Mg2+ el día anterior. Evite las burbujas durante la preparación. Guárdelo en el refrigerador. Revuelva lentamente durante 10 minutos antes de usar. |
| DPBS con Ca2+ & Mg2+ | Hyclone | SH30264.FS | DPBS - parte del tampón de aislamiento |
| Ficoll PM400 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F4375 | La medición exacta es importante aquí. Pesar en botella con barra para revolver. Agite enérgicamente después de agregar DPBS. Conservar en la nevera O/N. Estará despejado por la mañana. Revuelva suavemente durante 10-15 minutos antes de usar. Mantener en hielo hasta su uso. |
| Glucosa (D-(+) Dextrosa) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | G7528 | Glucosa (D-(+) Dextrosa) Concentración: 5 mM |
| Solución estándar de hidróxido de sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | . 71474 | para ajustar el pH del DPBS |
| Piruvato de sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | P2256 | Concentración: 1 mM |
Referencias
- Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
- Hartz, A. M., et al.
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Reimpresiones y permisos
