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Artículo de método

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

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DOI:

10.3791/57346

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12 de septiembre de 2018

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1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

En este artículo

Resumen

Tubos capilares del cerebro aislado de tejido de cerebro humano pueden utilizarse como un modelo preclínico para estudiar la función de barrera bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Aquí, presentamos un protocolo optimizado para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano fresco.

Resumen

Función de barrera blood - brain de comprensión bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas es crítica para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que tienen la promesa de mejorar la entrega de la droga de cerebro, mejorar la protección del cerebro y tratar el cerebro trastornos. Sin embargo, es difícil estudiar la función humana barrera blood - brain. Así, hay una necesidad crítica de modelos apropiados. En este sentido, los capilares del cerebro aislados de tejido cerebral humano representan una herramienta única para estudiar la función de barrera cerca de la situación humana en vivo como sea posible. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar los tubos capilares del tejido de cerebro humano en un alto rendimiento y con pureza y calidad constante. Los capilares están aislados del tejido de cerebro humano fresco mediante homogeneización mecánica, gradiente de densidad centrifugación y filtración. Después del aislamiento, los capilares del cerebro humano pueden utilizarse para diversas aplicaciones, incluyendo ensayos de fugas, imágenes de células vivas y ensayos inmune para estudiar la expresión de la proteína y función de la actividad enzimática y señalización intracelular. Los capilares del cerebro humano aisladas son un modelo único para aclarar la regulación de la función humana barrera blood - brain. Este modelo puede proporcionar penetraciones en la patogenesia de sistema nervioso central (SNC), que ayudará al desarrollo de estrategias terapéuticas para el tratamiento de trastornos de la CNS.

Introducción

La barrera blood - brain es una interfaz muy controlada entre la sangre y el cerebro que determina lo que entra y sale del cerebro. Anatómicamente, las células endoteliales componen la barrera hemato - encefálica y forman una red continua, compleja. Fisiológicamente, esta red capilar proporciona el cerebro con oxígeno y nutrientes mientras que al mismo tiempo la eliminación de dióxido de carbono y productos metabólicos de desecho. Lo importante, la evidencia apoya que los cambios en la barrera contribuyen a numerosas patologías, como la enfermedad de Alzheimer, epilepsia, accidente cerebrovascular1,2,3,4,5 , 6 , 7. cerebro células endoteliales también sirven como una barrera al tratamiento mediante el bloqueo de la absorción de drogas en el cerebro, por ejemplo., quimioterapia de glioblastoma multiforme tras tumor resección8,9, 10. en este sentido, los capilares del cerebro humano aisladas representan un modelo único ex vivo barrera blood - brain que se asemeja a la barrera propiedades en vivo, que permite el estudio de la función de barrera y disfunción en la salud y la enfermedad. En este artículo, nos proporcionan un protocolo para aislar los capilares cerebrales del cerebro humano con una alta calidad capilar y rendimiento para el estudio de la barrera blood - brain.

En 1969, Siakotos et al. 11 fueron los primeros en informar el aislamiento de los capilares del cerebro bovino y humano de tejido de cerebro usando densidad gradiente centrifugación y vidrio grano columna separación. Más tarde, Goldstein et al. 12 mejorar este método mediante la adición de varios pasos de filtración para disminuir la cantidad de tejido necesario para el estudio de los capilares del cerebro aislados de ratas, manteniendo la actividad metabólica del transporte de glucosa. Desde entonces, los investigadores optimizan el procedimiento de aislamiento capilar numerosas veces, mejorando el método y el cerebro modelo capilar con cada iteración13,14,15. Por ejemplo, Pardridge et al. 16 aislados bovinos capilares mediante digestión enzimática, en lugar de homogeneización mecánica y posteriormente pasa una suspensión capilar a través de un filtro de malla de 210 μm y una columna de bolas de vidrio. Estas modificaciones mejoraron la mancha de exclusión azul de tripano de capilares del cerebro aislado y así, aumentaron la viabilidad de las células endoteliales. En la década de 1990, Dallaire et al. 17 aislados capilares bovinos y ratas que eran claras de contaminación neuronal y mantener la actividad metabólica de la γ-glutamil transpeptidasa (γ-GTase) y fosfatasa alcalina. En el año 2000, Miller et al. 18, utiliza aislado de rata y los capilares del cerebro porcino en combinación con la microscopía confocal para mostrar la acumulación de sustratos de transporte en el lumen de los capilares. Posteriormente, nuestro laboratorio ha continuado optimizar el procedimiento de aislamiento capilar cerebral y hemos establecido ensayos de transporte para determinar la P-glicoproteína (P-gp)19,20,21, cáncer de mama resistencia proteína (BCRP)22,23y 2 (Mrp2) de la proteína de resistencia a múltiples drogas actividad de transporte de24 . En 2004, hemos publicado dos informes donde utilizamos los capilares del cerebro aislado de rata para investigar diferentes vías de señalización. En Hartz et al. 21, se encontró que el péptido endotelina-1 rápidamente reversible reduzca la función de transporte de P-gp en capilares del cerebro, actuando a través del receptor de endothelin receptor B (ETB), óxido nítrico sintasa (NOS) y proteína quinasa C (PKC). En Bauer et al. 19, demostramos la expresión del receptor del receptor nuclear pregnano X (PXR) y mostró PXR-modulación de la función de transporte y expresión de P-gp en los capilares del cerebro. En experimentos con ratones transgénicos de PXR humanizados, hemos ampliado esta línea de investigación y mostró en vivo apretando de la barrera por regular P-gp a través de la activación de hPXR25. En 2010, Hartz et al. 26 utiliza este enfoque para restablecer la expresión de la proteína P-gp y transporte actividad en ratones de (hAPP) la proteína precursora del amiloide humanos transgénicos que sobreexpresan hAPP. Además, restauración de P-gp en hAPP ratones redujeron significativamente la amiloide beta (Aβ)40y niveles de Aß42cerebro.

Además de estudiar vías de señalización, los capilares del cerebro aislado pueden utilizarse para determinar los cambios en la permeabilidad capilar que denominamos fuga capilar. En particular, el análisis de fuga de Texas Red se utiliza para evaluar la fuga de colorante fluorescente rojo de Texas desde el lumen capilar con el tiempo y estos datos entonces se utilizan para analizar las tasas de salida. Tasas de fuga capilar aumento en comparación con las de los capilares de control indican cambios en la integridad física de la barrera blood - brain2. Esto es valioso porque hay numerosos Estados de enfermedad asociados con la interrupción de la barrera, por ej., epilepsia, esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y cerebral traumática lesión27,28,29, 30. Otros grupos también han utilizado los capilares aislados para discernir las vías de señalización que regulan la expresión de la proteína y la actividad de transporte de proteínas31,32,33,34, 35,36,37. Por último, hemos seguido optimizar este método para el aislamiento de los capilares del cerebro humano y, recientemente, nos mostraron mayor expresión de P-gp en el humana barrera hemato - encefálica en pacientes con epilepsia en comparación con los individuos del control de asimiento-libre38 . Tomados juntos, estos desarrollos demuestran que los capilares del cerebro aislado pueden servir como modelo para estudiar la función de barrera.

Varios en vivo, ex vivoy en vitro barrera blood - brain los modelos se han utilizado en investigación básica y la detección de drogas industriales, principalmente con el objetivo de la prueba de entrega de la droga al cerebro39,40,41 ,42,43,44. Además aisladas ex vivo capilares del cerebro, modelos actuales de la barrera hemato - encefálica incluyen en silico modelos, en vitro cultura de célula de las células endoteliales capilares cerebrales aislados o líneas de células inmortalizadas de varios especie, en vitro cultura de células de madre pluripotenciales humanas (hPSC) que se diferencian en células endoteliales capilares del cerebro y modelos de microfluidos en un chip.

Modelos in silico se utilizan comúnmente en el desarrollo de fármacos de selección de candidatos de la droga basados en predicha de la absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) propiedades. Métodos tales como modelos de relación (QSPR) propiedad de la estructura cuantitativa y cuantitativa estructura-actividad relación (QSAR) son métodos populares utilizados en el cribado de alto rendimiento de las bibliotecas predecir penetración cerebral de fármacos candidatos 45 , 46. estos modelos son útiles para las moléculas de la pantalla de propiedades de penetración de barrera.

Betz et al. 47 estableció monocapas de células endoteliales capilares cerebrales cultivadas como un sistema de modelo en vitro barrera blood - brain. In vitro de la célula cultura modelos tejido fresco o líneas celulares endoteliales inmortalizado como las células endoteliales del microvessel cerebral humano (hCMECs) pueden ser otra herramienta de proyección de alto rendimiento para la penetración del cerebro o estudios mecanísticos. Sin embargo, modelos de cultura de célula endotelial capilar cerebral falta el estrés fisiológico del esquileo del flujo de sangre dentro del lumen capilar están limitados en su complejidad biológica en general y experimentan cambios en la expresión y localización de los componentes importantes de la barrera como las proteínas de Unión estrecha, iones, transportadores, enzimas y receptores de la superficie de canales48,49,50. Por el contrario, monocapas endoteliales derivan de hPSCs, tienen sacarosa baja permeabilidad en comparación con las culturas hCMEC/D3 y contener expresión polarizada de algunos transportadores de la barrera blood - brain, moléculas de adhesión y uniones estrechas51, 52. sin embargo, estas células también están sujetos a cambio de las propiedades en la cultura y el sistema debe ser validado para su recapitulación en vivo barrera propiedades52.

Nuevas tendencias en la investigación de la barrera hemato - encefálica incluyen utilizando sistemas de cultivo de tejidos 3D para crear capilares artificiales, utilizando la tecnología del órgano-on-chip para generar dispositivos microfluídicos, o utilizando la tecnología de fibra hueca53, 54 , 55. los capilares artificiales, sin embargo, tienen significativamente mayores diámetros (100 – 200 μm) que los capilares cerebrales (3 – 7 μm). Por lo tanto, el esquileo las fuerzas en vitro no completamente se asemejan a la situación en vivo . Esto se aborda en los dispositivos microfluídicos "blood-brain-barrier-on-a-chip", donde compartimientos de "sangre" y "cerebro" de forma artificial de las membranas y líquidos son bombeados a través de estos dispositivos microfluídicos fuerzas de esquileo. Del mismo modo, co-cultivos de células endoteliales en varias combinaciones con astrocitos y células musculares lisas vasculares también han sido utilizados con la tecnología de fibra hueca para recrear parámetros reológicos presentes en vivo las condiciones56 , 57 , 58. sin embargo, no está claro cómo este modelo refleja otras propiedades de la barrera hemato - encefálica como transporte, metabolismo, señalización y otros. Estos modelos artificiales capilar y chip son adecuados para la detección de alto rendimiento de drogas, pero las células utilizadas para generar estos modelos también están sujetos a cambio en la cultura.

Rebanadas de cerebro congelado y fijo o cerebro primario, cultivos de células endoteliales capilares son modelos adicionales que pueden utilizarse paraestudiar la microcirculación humana5,59,60,61. Por ejemplo, inmunohistoquímica del tejido de cerebro fija se utiliza para determinar la localización de proteínas y expresión en sana en comparación con el tejido enfermo.

Además de los modelos en vitro y rebanadas de tejido capilares descrita, recientemente aisladas del cerebro pueden ser utilizados para estudiar la función de la barrera blood - brain. Limitaciones de este modelo capilar aislada incluyen la dificultad para obtener tejido cerebral humano fresco, ausencia de astrocitos y neuronas y un proceso relativamente largo de aislamiento. Una ventaja del modelo capilar cerebral aislado es que este modelo se parece a la situación en vivo y, por lo tanto, se puede utilizar para caracterizar la disfunción y la función de barrera. Lo importante, también puede ser utilizado para discernir mecanismos de señalización mediante multitud de ensayos y técnicas moleculares3,19,62,63.

Nuestro laboratorio tiene acceso a ambos tejidos frescos y congelados de cerebro humano a través del centro de Sanders-Brown sobre el envejecimiento (IRB #B15-2602-M)64. En este contexto, las autopsias siguen un protocolo estándar, se obtienen cerebros en < 4 h y todos los procedimientos se ajustan a NIH muestra biológica directrices sobre prácticas idóneas65. Dado este acceso único para el tejido cerebral humano, establecimos y optimizado un protocolo para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano que se traduce en un alto rendimiento de tubos capilares del cerebro humano intacto y viable. Dos extremos comunes de interés son para determinar la expresión de la proteína y la actividad. En este sentido, nosotros y otros hemos establecido varios ensayos que pueden utilizarse para estudiar la expresión de la proteína y niveles de actividad con los capilares del cerebro aislado. Estos ensayos incluyen el Western Blot, Western Simple ensayo, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA), reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), zymography, ensayos de actividad de transporte, y ensayos de fuga capilar. Estos ensayos permiten a los investigadores a estudiar los cambios en la función de barrera en condiciones patológicas humanas, determinar las vías que regulan la actividad y expresión de la proteína e identificar dianas farmacológicas para el tratamiento de la barrera hemato - encefálica asociada enfermedades.

Tomados juntos, recién los capilares del cerebro aislado pueden servir como un modelo robusto y reproducible de la barrera blood - brain. Sobre todo, este modelo puede combinarse con muchos diferentes ensayos para determinar una amplia gama de puntos finales para el estudio de la función barrera.

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Protocolo

La siguiente información se basa en la seguridad actual y normas reglamentarias de la Universidad de Kentucky, Lexington, KY, Estados Unidos. Como precaución de seguridad, consulte programa de seguridad biológica de la institución y los reglamentos y recomendaciones más actuales antes de trabajar con tejido humano.

PRECAUCIÓN: Tejido humano puede ser una fuente de patógenos transmitidos por la sangre, incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (HCV) y otros. Trabajo con tejido humano plantea el riesgo de infección de patógenos de la sangre. Por lo tanto, ciertas consideraciones reglamentarias y de seguridad son imprescindibles cuando se trabaja con tejido humano para proteger al personal de laboratorio. Trabajo con tejidos humanos en los Estados Unidos requiere de un laboratorio de bioseguridad nivel 2, así como las precauciones de seguridad y formación de acuerdo con el NIH sección IV-B-7, Ley de OSHA de 1970 cláusula 5(a)(1) y el programa de seguridad institucional. En general, se debe obtener aprobación del Comité de bioseguridad institucional o junta de revisión institucional antes de realizar cualquier investigación con materiales humanos (tejido, fluidos corporales). La formación es necesaria para todo el personal trabajando con materiales humanos e incluye entrenamiento de seguridad de laboratorio básico, e.g., químicos de higiene y seguridad en el laboratorio, así como formación específica sobre seguridad biológica, residuos peligrosos y ser humano patógenos de la sangre. Todo el personal trabajando con materiales humanos es muy recomendables para obtener vacunas de Hepatitis B, antes de trabajar con materiales humanos. Personal se requiere usar equipo de protección personal específico al trabajar con materiales humanos, por ejemplo., una bata de laboratorio con manguito y un rostro protector y guantes en todo momento. Todo el trabajo se realiza en un gabinete de bioseguridad (clase 2). Todo el equipo que viene en contacto con materiales humanos y cualquier desecho de materiales humanos es manejado adecuadamente para evitar contaminación o infección del personal. Todos los equipos y las superficies se limpian con etanol del 10% cloro y 75% después de cada procedimiento con materiales humanos. Un derrame con materiales humanos debe limpiarse inmediatamente para arriba. La cristalería es esterilizada después de cada uso. Residuos, incluyendo el tejido humano no fijado, es recogido en una bolsa para residuos biológicos marcados y esterilizado. Objetos punzantes se recogen en un recipiente imperforable y fuga etiquetado como riesgo biológico. Todos los residuos de materiales humanos está dispuesto según las normas de seguridad biológica de la institución.

Nota: Nuestro laboratorio obtiene muestras frescas de corteza frontal de personas fallecidas a través del centro de Sanders-Brown sobre el envejecimiento (IRB #B15-2602-M). Criterios de inclusión son: inscripción en el estudio de cohorte longitudinal autopsia de UK-ADC y un intervalo Post Mortem (PMI) ≤4 h64. Las autopsias siguen un protocolo estándar y todos los procedimientos se ajustan a NIH muestra biológica directrices sobre prácticas idóneas65. Un PMI corto de menos de 4 h es de máxima importancia para asegurar viabilidad capilar después de aislamiento. Puede utilizarse tejido fresco y congelado. Si la congelación es necesaria, tejido cerebral humano recién obtenida debe ser choque congelado en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C. Tejido fresco o descongelado debe ser almacenado en búfer de aislamiento (véase abajo) y procesado rápidamente. Encontramos que 10 g de tejido fresco de humano rendimientos alrededor de 100 mg de capilares del cerebro (peso húmedo).

1. configuración

  1. Preparación de buffer
    Nota: El volumen de amortiguamiento necesitada depende de la cantidad de tejido. Todos los volúmenes de buffer en el siguiente protocolo se basan en 10 g de tejido de la corteza del cerebro humano.
    1. L de tampón de aislamiento: Uso 1,5 L de salino tamponado con fosfato de Dulbecco (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, Na2HPO4de 8,1 mM, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) y suplemento con D-glucosa (1,35 g de 5 mm. ) y piruvato de sodio 1 mM (0,165 g). Después de agregar la glucosa y del piruvato, ajustar a pH 7,4 con hidróxido de sodio. Enfriar y almacenar la solución a 4 ° C antes de usar.
    2. Albúmina de suero bovino (BSA): Añadir 10 g de polvo de BSA a 1 L de tampón de aislamiento a una concentración final de BSA 1%. Revolver lentamente para evitar burbujas, ajustar a pH 7,4 y almacenar a 4 ° C durante la noche. Inmediatamente antes de su uso, Revuelva suavemente; evitar la formación de burbujas para evitar la desnaturalización de la albúmina.
    3. medio de gradiente de densidad: pesar 18 g de medio de gradiente de densidad en un frasco de vidrio y agregar una barra de agitación magnética. Añadir 60 mL de tampón de aislamiento y agite vigorosamente por 5 minutos hasta que todo el polvo se suspende. Tienda durante la noche a 4 ° C para permitir que el medio de gradiente de densidad disolver. Agitar durante 10 minutos antes de usar.
    4. Almacenar todos los búferes a 4 ° C; Mantenga todas las herramientas y buffers en el hielo durante el procedimiento de aislamiento completo. Revolver todos los búferes antes de su uso.
  2. Disposición experimental
    1. Montar la mano del mortero de la amoladora de Potter-Elvehjem tejido sobre el agitador electrónico de arriba. Coloque el molinillo de tejido de Potter-Elvehjem y los homogeneizadores Dounce con mortero en el hielo bajo el capó. Preparar una malla de filtro de 300 μm (5 x 5 cm2), doblar a un cono e insertar y adjuntar a una 50 mL tubo Falcon con cinta adhesiva (figura 1A).
    2. Aros de conexión y filtros de la tensión de la célula (tamaño de poro: 30 μm) en tubos Falcon de 50 mL. Preparar bolsas de residuos biosanitarios hospitalarios. Colocar los equipos en la seguridad de la biotecnología gabinete (véase Tabla de materiales).

2. preparación de muestras de cerebro

Nota: La figura 1A muestra la tabla de flujo del procedimiento de aislamiento completo que se describe a continuación. Tejido cerebral humano puede provenir de cualquier parte de la corteza y puede utilizarse fresco o congelado. Tejido cerebral congelado puede ser descongelado a temperatura ambiente (sin buffer; ~ 30 min para 10 g). Para obtener resultados comparables, el tejido cerebral se debe obtener de la misma región del cerebro para cada experimento. Este protocolo está optimizado para fresco (PMI < 4 h) corteza cerebral humana que no ha sido congelada.

  1. Preparación del tejido de cerebro humano: documentar el peso de los tejidos del cerebro. Todos los números en el siguiente protocolo están apropiados para 10 g de tejido cerebral humano fresco. Coloque el tejido de cerebro en un plato de Petri de 100 mm. Remueva cuidadosamente las meninges con fórceps. Utilice un bisturí para cortar la materia blanca.
  2. Picado del tejido de cerebro humano: cuidadosamente corte el tejido de cerebro y picar con un bisturí. Carne picada durante unos 5 minutos (piezas de 2 – 3 mm). Transferir el tejido cerebral a la amoladora de tejido de Potter-Elvehjem. Añadir 30 mL de tampón de aislamiento.
    Nota: Las piezas de tejido picada son difíciles de ver ya que el tejido cerebral se convierte en ruido de fondo durante el proceso de picado.

3. homogeneización

  1. Amoladora de tejido Potter-Elvehjem (distancia: 150 – 230 μm): homogeneizar cada muestra con 100 golpes a una velocidad de homogeneizador de 50 rpm. Documentar el tiempo cada 25 golpes y el tiempo total necesario para 100 golpes. Vea la tabla 1 para un protocolo propuesto homogeneización; el tiempo total para homogeneizar 10 g de corteza frontal humana es alrededor de 22 minutos. No agregue el aire para evitar burbujas.
  2. Homogeneizadores Dounce (distancia: 80 a 130 μm): transferir el homogeneizado a un homogeneizador Dounce en hielo. Homogeneizar la suspensión con 20 golpes (~ 6 s/movimiento, total de ~ 2 minutos). Evitar las burbujas.

4. centrifugación

  1. Distribuir el homogeneizado de cerebro igualmente en cuatro tubos de centrifugación de 50 mL y documento el volumen total del homogeneizado. Distribuir 50 mL de tampón de gradiente de densidad en los tubos de centrifugación (12,5 mL por tubo). Utilizar 10 mL de tampón de aislamiento enjuagar el mortero y homogeneizador, y distribuir en los cuatro tubos de centrifugación (~2.5 mL por tubo).
  2. Cierre firmemente los tubos de centrifugadora con tapas. Mezclar el homogeneizado, medio de gradiente de densidad y amortiguación agitando vigorosamente los tubos. Centrifugue a 5.800 x g durante 15 min a 4 ° C (rotor de ángulo fijo); Seleccione una velocidad de deceleración media para mantener el sedimento al tubo. Deseche el sobrenadante y resuspender cada precipitado en 2 mL de 1% de BSA.

5. filtración

Nota: Para separar los tubos capilares de células de sangre rojas y otros restos celulares, son necesarios varios pasos de filtración.

  1. malla de 300 μm: después de volver a suspender el precipitado, filtrar la suspensión a través de la malla de 300 μm. Los capilares se filtran a través de la malla, mientras que los buques más grandes y más grandes desechos de cerebro permanecen en la malla. Lavar cuidadosamente la malla con hasta 50 mL de 1% de BSA. Deseche la malla.
    Nota: Este paso de filtración elimina la suspensión capilar de vasos o trozos de restos de cerebro más grande.
  2. Filtro de tensión de celda 30 μm
    Nota: Este paso de filtración separa los capilares de células de sangre rojas y otros desechos del cerebro.
    1. Distribuir el filtrado capilar en el paso 6.1 sobre los filtros de cinco 30 μm células cepa (aproximadamente 10 mL del filtrado capilar por filtro de tensión de la célula). Los capilares son retenidos por este filtro, mientras que los glóbulos rojos, células y desechos pequeños del cerebro pasan por el filtro y se recogen en el filtrado.
    2. Lavar cada filtro con 25 mL de 1% de BSA. Luego, vierta todos filtrados sobre el sexto filtro para aumentar el rendimiento. Lavar cada filtro con 50 mL de 1% de BSA; mantener la célula cepa filtros que contienen los capilares y descartar el filtrado.

6. colección capilar

  1. Invierta los filtros y lavar los tubos capilares con 50 mL de 1% de BSA para cada filtro en tubos de 50 mL. Suavemente aplique presión con la punta de la pipeta de una pipeta de 5 mL y moverse a través del filtro para lavar los tubos capilares del cerebro.
  2. Asegúrese de lavar todos los capilares del cerebro, especialmente desde el borde del filtro. Evitar las burbujas ya que esto dificulta el proceso de filtración y aumenta la probabilidad de pérdida capilar.

7. lavado

  1. Después de recoger los tubos capilares, centrifugar las muestras a 1.500 x g durante 3 min a 4 ° C (cubo rotor oscilante). Quite el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en aproximadamente 3 mL de tampón de aislamiento. Combinar todos los pellets resuspendidos de una muestra en un tubo cónico de 15 mL y llenarlo con tampón de aislamiento. Centrifugar nuevamente a 1.500 x g durante 3 min a 4 ° C y lave dos veces más.
  2. Documentar la pureza capilar con un microscopio (100 aumentos) y cámara (figura 1B).
    Nota: El rendimiento capilar del cerebro de 10 g de tejido cerebral humano es generalmente alrededor de 100 mg. Los capilares del cerebro aislado ahora pueden ser utilizados para experimentos, procesados (e.g., Lisado, aislamiento de membrana), o ser flash-congeladas y almacenadas a-80 ° C en criotubos por un mínimo de 6 – 12 meses (evitar múltiples ciclos de hielo-deshielo).

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Resultados

Los aislamientos de tejido de cerebro humano producen una suspensión enriquecida en capilares del cerebro humano (figura 1B) con pequeñas cantidades de recipientes más grandes, células de sangre rojas, otras células y algunos restos de células. Algunos capilares se ramifican, y, en algunos, las células de sangre rojas son atrapadas en los lúmenes capilares. El capilar típico tiene un diámetro de 3 – 7 μm y es aproximadamente de 100-200 μm largo con lúmenes ab...

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Discusión

El presente Protocolo describe el aislamiento de los capilares del cerebro humano intacto y viable de tejido fresco. En esta sección, discutimos en detalle lo siguiente: 1) modificaciones en el protocolo 2) solución de problemas de errores comunes, 3) limitaciones de la técnica, 4) la importancia del modelo con respecto a los existentes y modelos alternativos barrera blood - brain, y 5). aplicaciones potenciales de los capilares del cerebro humano aislado.

El protocolo descrito aquí está optim...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos y reconocemos el Dr. Peter Nelson y Sonya Anderson en el Banco de tejido cerebral de UK-ADC para proporcionar cerebro humano todas las muestras de tejido (NIH número de concesión: P30 AG028383 del Instituto Nacional sobre el envejecimiento). Agradecemos a Matt Hazzard y Tom Dolan, servicios de tecnología de información, tecnología académica y compromiso de la Facultad, Universidad de Kentucky para asistencia gráfica. Este proyecto fue apoyado por 1R01NS079507 número de subvención del Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular (por B.B.) y grant número 1R01AG039621 del Instituto Nacional sobre el envejecimiento (a A.M.S.H.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular o el Instituto Nacional sobre envejecimiento. Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipo de protección personal (EPP)
Diamond Grip Plus Guantes de látex, Microflex MediumVWR, Radnor, PA, EE. UU.32916-636EPI Batas
de laboratorio protectoras desechablesVWR, Radnor, PA, EE. UU. 470146-214EPP; debido a la naturaleza del material de origen humano, se recomienda el uso de una bata de laboratorio desechable
Protector facial, desechableThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU19460102EPP; Debido a la naturaleza del material de origen humano, se recomienda el uso de un protector facial desechable
Materiales de seguridad Bolsas
de autoclave de alta temperatura Clavies 8 x 12Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU.01-815-6
Versi Papel de banco seco 18" x 20"Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU.14-206-32para cubrir áreas de trabajo
VWR Sharps Container SystemsThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. 75800-272para bisturíes usados
Lejía 8.2% Clorox Germicida 64 oz.Centro de suministros del Reino Unido, Lexington, KY, EE. UU. 323775
Equipment
4 ° C RefrigeradorThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. 13-986-148
Medidor de pH Accume BASIC AB15Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. AB15
Heidolph RZR 2102 ControlHeidolph, Elk Grove Village, IL, EE. UU. 501-21024-01-3
Centrífuga Sorvall LEGEND XTRThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. 75004521
Microscopio de disección Leica L2Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, EE. UU.Se utiliza para eliminar las meninges
POLYTRON PT2500 HomogeneizadorKinematica AG, Lucerna, Suiza9158168
P-403Denver Instrument, Bohemia, NY, EE. UU.0191392
Mini agitador estándarThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. 1151050
Termo-Frascos de nitrógeno líquido DewarThermal Scientific, Mansfiled, TX, EE. UU11-670-4Cutilizado para congelar el tejido?
Balanza analítica Voyager ProOHAUS, Parsippany, Nueva Jersey, EE. UU.VP214CN
Microscopio ZEISS AxiovertCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, EE. UU.se utiliza para comprobar capilares aislados
fuerte
Finnpipette II Pipeta 1-5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. 21377823T1lavar los capilares filtro
Finnpipette II Pipeta 100-1.000 µ LThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. 21377821T1pellet de resuspensión en BSA
Pipet BoyIntegra, Hudson, NH, EE. UU.
50 mL Tubos Falcon 25/rack - 500/csVWR, Radnor, PA, EE. UU. 21008-951
Hojas de bisturí EISCOThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. S95938Cpara picar tejido cerebral
PARAFILMVWR, Radnor, PA, EE. UU. 52858-000para cubrir vaso de precipitados y matraz aforado
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU.21-377-304para lavar los capilares del filtro
Jeringa de 60 mL con Luer-LokThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU. BD309653utiliza con anillo conector para filtrar capilares
Mango de bisturí #4Fine Science Tools, Foster City, CA, EE. UU.10060-13utilizado para picar
Pinzas Dumont #5Fine Science Tools, Foster City, CA, EE. UU. 11251-10utilizado para eliminar meninges
Potter-Elvehjem Amoladora de tejidosThomas Scientific, Swedesboro, NJ, EE. UU3431E2550 mL volumen, espacio libre: 150-230 μ m
Homogeneizador DounceVWR, Radnor PA USA62400-64215 mL volumen, holgura: 80-130 μ m
Filtros tejidos Spectra/Mesh (300 µ m)Spectrum Laboratories, Rancho Domínguez, CA, EE.UU.146424Se utiliza para filtrar la suspensión capilar para eliminar cualquier meninge que pueda quedar
en los filtros (tamaño de poro: 30 y micro; m)pluriSelect Life Science, Leipzig, Alemania43-50030-03
Anillo conectorpluriSelect Life Science, Leipzig, Alemania41-50000-03reutilización múltiple
aforadopara la preparación de tampón de aislamiento
Vaso de precipitadospara la preparación de barra
de agitación BSA al 1%para la preparación de 1% BSA y Ficoll®
Schott Frasco (60 mL)para la preparación de Ficoll®
Cubiterapara mantener todo frío
Petri de 100 mmpara picar tejido cerebral
Raspador de células de cultivo de tejidosVWR, Radnor, PA, EE. UU. 89260-222para eliminar el sobrenadante después de la centrifugación
químicos
BSA Fracción V, A-9647Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UUA9647-500gpreparar en DPBS con Ca2 + < / sup> & Mg2+ el día anterior. Evite las burbujas durante la preparación. Guárdelo en el refrigerador. Revuelva lentamente durante 10 minutos antes de usar.
DPBS con Ca2+ & Mg2+HycloneSH30264.FSDPBS - parte del tampón de aislamiento
Ficoll PM400Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAF4375La medición exacta es importante aquí. Pesar en botella con barra para revolver. Agite enérgicamente después de agregar DPBS. Conservar en la nevera O/N. Estará despejado por la mañana. Revuelva suavemente durante 10-15 minutos antes de usar. Mantener en hielo hasta su uso.
Glucosa (D-(+) Dextrosa)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UUG7528Glucosa (D-(+) Dextrosa) Concentración: 5 mM
Solución estándar de hidróxido de sodioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. 71474para ajustar el pH del DPBS
Piruvato de sodioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UUP2256Concentración: 1 mM
. Escala . 739658 . Termo de 1 L de 1 L Placa de. . .

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