La expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescente de manera eficiente en las plantas

Resumen

Hemos desarrollado un novedoso método para expresar conjuntamente múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas a superar las dificultades de los métodos convencionales. Toma ventaja del uso de un plásmido de expresión única que contiene múltiples proteínas funcionalmente independiente expresando cassettes para lograr la expresión de la proteína.

Resumen

Información sobre la localization(s) espacio-temporal subcelular de una proteína es fundamental para comprender sus funciones fisiológicas en las células. Proteínas fluorescentes y la generación de proteínas fluorescentes de fusión se han utilizado violentamente como una herramienta eficaz para visualizar directamente la localización de proteínas y la dinámica en las células. Es especialmente útil para compararlos con los marcadores de organelo conocido después de coexpresión con la proteína de interés. Sin embargo, métodos clásicos para la expresión de la proteína en las plantas implican generalmente múltiples plásmidos de expresión independiente y por lo tanto tienen inconvenientes que incluyen eficacia baja expresión Co, variación del nivel de expresión y alto tiempo de gasto en cruce genético y cribado. En este estudio, describimos un método robusto y novedoso para la expresión de múltiples proteínas quiméricas fluorescentes en las plantas. Supera las limitaciones de los métodos convencionales mediante el uso de un vector de expresión individual que se compone de múltiples cintas expresando semi-independiente. Cada cassette de expresión de la proteína contiene sus propios elementos de expresión de la proteína funcional, y por lo tanto se puede ajustar fexiblemente para satisfacer la demanda de expresión diversa. Además, es fácil y conveniente para llevar a cabo la Asamblea y fragmentos de manipulación del ADN en el plásmido de expresión mediante el uso de una reacción de un paso optimizado sin digestión adicional y pasos de ligadura. Además, es totalmente compatible con proteína fluorescente derivada bio-proyección de imagen de las tecnologías actuales y las aplicaciones, como el traste y centro. Como una validación del método, se empleó este nuevo sistema vacuolar receptor clasificación express Co fluorescente fundido y proteínas en la membrana secretora portador. Los resultados muestran que sus localizaciones subcelulares de la perspectiva al igual que en anteriores estudios de expresión transitoria y transformación genética en plantas.

Introducción

Proteínas de fusión fluorescente quimérico se han mirado como herramientas útiles para estudiar la dinámica intracelular y localización subcelular y entiendo sus funciones fisiológicas y trabajo mecanismos^{1,2, 3 , 4}. es especialmente beneficioso para express Co organelo conocido reportero las proteínas con la proteína en cuestión para mejor ilustrar su razonamiento espacio-temporal, distribución y funciones dentro del Sistema endomembranoso de células^{4 , 5 ,}

Protocolo

1. primer diseño estrategia y amplificación del ADN

1. Diseño de los cebadores para la clonación molecular de fragmentos de ADN. Los iniciadores comprenden secuencias de unión específica gen bp 20 y 20 a 25 bp 5'-el extremo voladizo las secuencias, que son la secuencia complementaria superpuesta de las moléculas de ADN adyacentes (ver tabla 1 por ejemplo).
   Nota: El montaje posterior de cada ADN fragmentos, acoplamiento de cassettes de expresión de proteínas diferentes, y dependen de integración con el vector de expresión final todos en el reconocimiento de las secuencias superpuestas adyacentes.
2. Amplificar fragmentos de ADN, como p....

Resultados

Hemos desarrollado un método robusto y altamente eficiente para la co-expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas. Se rompe a través de las barreras de lo convencional enfoques utilizan múltiples plásmidos separados para la coexpresión de la proteína, como se muestra en la figura 1A, B, a través de la expresión transitoria o transformación genética estable. En este nuevo método, se genera un v.......

Discusión

Aquí hemos demostrado un nuevo método para robusta Co expresar proteínas quiméricas fluorescentes fusión en plantas. Puede utilizar para la expresión transitoria y transformación genética y es compatible con actuales fluorescentes basados en proteína bio-proyección de imagen molecular y bioquímica aplicaciones y tecnologías^9,10,13 . Además, supera las dificultades de los métodos convencionales que utilizan varios plásmidos de ex.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
KOD-FX Polimerasa	TOYOBO	KFX-101
Sma I	NEB	R0141L/S/V
Tris-HCl	BBI	A600194-0500
MgCl2	BBI	A601336-0500
dNTP	NEB	#N0447V
TDT	BBI	C4H10O2S2
PEG 8000	BBI	A100159-0500
NAD	BBI	A600641-0001
T5 exonucleasa	Epicentro	T5E4111K
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	NEB	M0530S
ADN polimerasa	Taq NEB	B9022S
Murashige y Skoog Mezcla de sales basales (MS)	Sigma	M5524
Etanol	BBI	A500737-0500
Tween 20	BBI	A600560-0500
Agar	BBI	A505255-0250
Espermidina	BBI	A614270-0001
Partículas microportadoras de oro	Bio-Rad	165-2263	1.0 µ m
CaCl2	BBI	CD0050-500
Macroportadores	Bio-Rad	165-2335
Disco	de ruptura Bio-Rad	165-2329
Criba de parada	Bio-Rad	165-2336
Triptona	OXOID	LP0042
Extracto de levadura	OXOID	LP0021
NaCl	BBI	A610476-0001
KCl	BBI	A610440-0500
Glucosa	BBI	A600219-0001
Higromicina B	Genview	AH169-1G
Wortmannin	Sigma	F9128
Brefeldin A	Sigma	SML0975-5MG
Dimetilsulfóxido (DMSO)	BBI	A600163-0500
T100 Termociclador	Bio-Rad	1861096
Cámara de crecimiento	Panasonic	MLR-352H-PC
PSD-1000/He sistema de suministro de partículas	Bio-Rad	165-2257
Gene Pulsser	Bio-Rad	Cubeta 1652660
	Bio-Rad 1652083
Centrífuga de sobremesa	Eppendorf	5427000097
Microscopio confocal	Zeiss		LSM 7 DUO (780& 7Live)
Espectrofotómetros NanoDrop 2000/2000c	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
EPS-300 Fuente de alimentación	Tanon	EPS 300
Microscopio fluorescente	Mshot	MF30
Agrose	BBI	A600234
Ampicilina	BBI	A100339
Etileno Diamino Tetraacetio Ácido	BBI	B300599