Artículo de método

La expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescente de manera eficiente en las plantas

DOI:

10.3791/57354

1 de julio de 2018

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos desarrollado un novedoso método para expresar conjuntamente múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas a superar las dificultades de los métodos convencionales. Toma ventaja del uso de un plásmido de expresión única que contiene múltiples proteínas funcionalmente independiente expresando cassettes para lograr la expresión de la proteína.

Resumen

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Información sobre la localization(s) espacio-temporal subcelular de una proteína es fundamental para comprender sus funciones fisiológicas en las células. Proteínas fluorescentes y la generación de proteínas fluorescentes de fusión se han utilizado violentamente como una herramienta eficaz para visualizar directamente la localización de proteínas y la dinámica en las células. Es especialmente útil para compararlos con los marcadores de organelo conocido después de coexpresión con la proteína de interés. Sin embargo, métodos clásicos para la expresión de la proteína en las plantas implican generalmente múltiples plásmidos de expresión independiente y por lo tanto tienen inconvenientes que incluyen eficacia baja expresión Co, variación del nivel de expresión y alto tiempo de gasto en cruce genético y cribado. En este estudio, describimos un método robusto y novedoso para la expresión de múltiples proteínas quiméricas fluorescentes en las plantas. Supera las limitaciones de los métodos convencionales mediante el uso de un vector de expresión individual que se compone de múltiples cintas expresando semi-independiente. Cada cassette de expresión de la proteína contiene sus propios elementos de expresión de la proteína funcional, y por lo tanto se puede ajustar fexiblemente para satisfacer la demanda de expresión diversa. Además, es fácil y conveniente para llevar a cabo la Asamblea y fragmentos de manipulación del ADN en el plásmido de expresión mediante el uso de una reacción de un paso optimizado sin digestión adicional y pasos de ligadura. Además, es totalmente compatible con proteína fluorescente derivada bio-proyección de imagen de las tecnologías actuales y las aplicaciones, como el traste y centro. Como una validación del método, se empleó este nuevo sistema vacuolar receptor clasificación express Co fluorescente fundido y proteínas en la membrana secretora portador. Los resultados muestran que sus localizaciones subcelulares de la perspectiva al igual que en anteriores estudios de expresión transitoria y transformación genética en plantas.

Introducción

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteínas de fusión fluorescente quimérico se han mirado como herramientas útiles para estudiar la dinámica intracelular y localización subcelular y entiendo sus funciones fisiológicas y trabajo mecanismos1,2, 3 , 4. es especialmente beneficioso para express Co organelo conocido reportero las proteínas con la proteína en cuestión para mejor ilustrar su razonamiento espacio-temporal, distribución y funciones dentro del Sistema endomembranoso de células4 , 5 ,

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. primer diseño estrategia y amplificación del ADN

  1. Diseño de los cebadores para la clonación molecular de fragmentos de ADN. Los iniciadores comprenden secuencias de unión específica gen bp 20 y 20 a 25 bp 5'-el extremo voladizo las secuencias, que son la secuencia complementaria superpuesta de las moléculas de ADN adyacentes (ver tabla 1 por ejemplo).
    Nota: El montaje posterior de cada ADN fragmentos, acoplamiento de cassettes de expresión de proteínas diferentes, y dependen de integración con el vector de expresión final todos en el reconocimiento de las secuencias superpuestas adyacentes.
  2. Amplificar fragmentos de ADN, como p....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos desarrollado un método robusto y altamente eficiente para la co-expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas. Se rompe a través de las barreras de lo convencional enfoques utilizan múltiples plásmidos separados para la coexpresión de la proteína, como se muestra en la figura 1A, B, a través de la expresión transitoria o transformación genética estable. En este nuevo método, se genera un v.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí hemos demostrado un nuevo método para robusta Co expresar proteínas quiméricas fluorescentes fusión en plantas. Puede utilizar para la expresión transitoria y transformación genética y es compatible con actuales fluorescentes basados en proteína bio-proyección de imagen molecular y bioquímica aplicaciones y tecnologías9,10,13 . Además, supera las dificultades de los métodos convencionales que utilizan varios plásmidos de ex.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Wang de las discusiones útiles y comentarios. Este trabajo es apoyado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China (NSFC, grant no. 31570001) y la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Guangdong y la ciudad de Guangzhou (concesión 201707010024 y Nº 2016A030313401) a H.W.

....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
KOD-FX PolimerasaTOYOBOKFX-101
Sma INEBR0141L/S/V
Tris-HClBBIA600194-0500
MgCl2BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
TDTBBIC4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
T5 exonucleasaEpicentroT5E4111K
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidadNEBM0530S
ADN polimerasaTaq NEBB9022S
Murashige y Skoog Mezcla de sales basales (MS)SigmaM5524
EtanolBBIA500737-0500
Tween 20BBIA600560-0500
AgarBBIA505255-0250
EspermidinaBBIA614270-0001
Partículas microportadoras de oroBio-Rad165-22631.0 µ m
CaCl2BBICD0050-500
MacroportadoresBio-Rad165-2335
Discode ruptura Bio-Rad165-2329
Criba de paradaBio-Rad165-2336
TriptonaOXOIDLP0042
Extracto de levaduraOXOIDLP0021
NaClBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
GlucosaBBIA600219-0001
Higromicina BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
Dimetilsulfóxido (DMSO)BBIA600163-0500
T100 TermocicladorBio-Rad1861096
Cámara de crecimientoPanasonicMLR-352H-PC
PSD-1000/He sistema de suministro de partículasBio-Rad165-2257
Gene PulsserBio-RadCubeta 1652660
Bio-Rad 1652083
Centrífuga de sobremesaEppendorf5427000097
Microscopio confocalZeissLSM 7 DUO (780& 7Live)
Espectrofotómetros NanoDrop 2000/2000cThermo Fisher ScientificND-2000
EPS-300 Fuente de alimentaciónTanonEPS 300
Microscopio fluorescenteMshotMF30
AgroseBBIA600234
AmpicilinaBBIA100339
Etileno Diamino Tetraacetio ÁcidoBBIB300599

Referencias

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
  3. Wang, H.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Coexpresi n de prote nasvector de expresi n nicobombardeo de part culasmicroscop a confocalan lisis FRETensayo BiFClocalizaci n de VSR 2localizaci n de SCAMP4biolog a celular vegetal

Artículos relacionados