Micromanipulación de los cromosomas de espermatocitos de insectos

Resumen

En este protocolo, se describen la selección y preparación de células apropiadas para la micromanipulación y el uso de un micromanipulador piezoeléctrico para volver a colocar los cromosomas dentro de las células.

Resumen

Ha sido un método esencial para iluminar el mecanismo para cromosoma congression, el puesto de control de huso y los movimientos de cromosoma anafase la micromanipulación de los cromosomas y ha sido clave para entender lo que controla movimientos del cromosoma durante División de célula. Un biólogo experto puede utilizar un micromanipulador para separar los cromosomas del eje, para volver a colocar los cromosomas dentro de la célula y para aplicar fuerzas a los cromosomas con una aguja de pequeño de vidrio con una punta muy fina. Mientras que las perturbaciones se pueden hacer a los cromosomas utilizando otros métodos como las trampas ópticas y otros usos de un láser, hasta la fecha, ningún otro método permite la reposición de componentes celulares en la escala de decenas a cientos de micras con poco a ningún daño a la célula .

La selección y preparación de las células apropiadas para la micromanipulación de los cromosomas, específicamente describiendo la preparación de saltamontes y grillo espermatocito primario para el uso en proyección de imagen de células vivas y micromanipulación, son se describe aquí. Además, mostramos la construcción de una aguja para utilizarse para mover los cromosomas en la célula y el uso de un micromanipulador piezoeléctrico controlado por joystick con una aguja de vidrio para reposicionar los cromosomas dentro de las células divisorias. Un resultado de ejemplo muestra el uso de un micromanipulador para separar un cromosoma de un eje en un espermatocito primario y para volver a colocar ese cromosoma dentro de la célula.

Introducción

Micromanipulación ha revelado las partes del mecanismo para un cromosoma congression, puesto de control de eje y movimientos de cromosoma anafase. La primera publicación que describe los resultados de experimentos de micromanipulación era por Robert Chambers¹. Cámaras utilizan un micromanipulador mecánica con una aguja de vidrio adjunta para sondear el citoplasma de un número de diferentes tipos de células. Por desgracia, métodos de contraste que permitieron la visualización de los cromosomas y de muchos otros componentes celulares en las células vivas no estaban disponibles en el momento, para que experimentos de cámaras no pueden mostrar los ....

Protocolo

1. preparación del cultivo celular de espermatocito primario de insectos para micromanipulación

1. Preparación de portaobjetos
   1. Obtener un portaobjetos de vidrio 75 x 25 mm con un agujero circular de 20 mm de diámetro, en el centro de la diapositiva.
      Nota: Estos fueron cortados de una sola hoja de vidrio de la ventana a ser del tamaño de un portaobjetos de vidrio con un orificio en el centro.
   2. Ejecutar un cubreobjetos 25 x 25 mm #1.5 a través de una llama de mechero de Bunsen para 2 s.
   3. Aplique grasa de vacío alrededor del borde del orificio en el portaobjetos de cristal
   4. Coloque el cubreobjetos sobre el agujero como en l....

Resultados

La figura 6 muestra una micromanipulación de muestra de 2 espermatocitos primarios adyacentes saltamontes en varios ejemplos de los posibles usos de micromanipulación. Este experimento se realizó usando un microscopio de contraste de fases invertido,. El 0:00 (las horas se muestran en min:s) la imagen muestra las células antes de la manipulación. Un cromosoma en la célula de la parte inferior se muestra bajo tensión aplicada por la aguja de micromanipulación .......

Discusión

Con la práctica, moviendo los cromosomas en la célula puede convertirse en segunda naturaleza. Agujas que son lo suficientemente rígidos y suficientemente delgada con punta son difíciles "conseguir la habilidad de" fabricación, pero esta capacidad también viene con la práctica. Las agujas que son tan finas que se deforman cuando se movió en el aceite de halocarburos no será útiles para empujar los cromosomas en la célula. Las agujas que son tan embotan que sus consejos son visibles y tan grandes como 1/3 de la anchura de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microcubreobjetos VWR	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, n.º 1.5
Dow Corning Grasa de alto vacío	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Tijeras de microdisección, acero inoxidable	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 Foreceps finos	Fine Science Tools	11254-20
0,85 mm de diámetro exterior, 0,65 mm de diámetro interior tubo de vidrio Pyrex
			alto aumento de 60X o 100X
Microforge	ya sea hecho a medida o Micromanipulador Narashige	MF-900
	ya sea hecho a medida o Burleigh PCS-6000 con joystick de control piezoeléctrico personalizado	PCS-6300

Microscopio de contraste de fase invertido con objetivo de bajo aumento de 10X o 16X y objetivo de